本发明属于花卉栽培繁殖领域，具体涉及一种快速繁殖大花蕙兰组织培养方法。
背景技术：
：大花蕙兰(cymbidiumhybridum)是兰科兰属常绿多年生附生草本，是由兰属中的大花附生种、小花垂生种以及一些地生兰经过一百多年的多代人工杂交育成的品种群。大花蕙兰叶长碧绿，花姿粗犷，豪放壮丽，是世界著名的“兰花新星”。它具有国兰的幽香典雅，又有洋兰的丰富多彩，在国际花卉市场十分畅销，深受花卉爱好者的倾爱。大花蕙兰由于种子发育不完全，几乎无胚乳，在自然条件下，种子萌发需要与真菌共生，因此种子萌发率极低，传统的分株繁殖极慢，为了快速大量繁殖大花蕙兰，实现兰花产业化道路，生产上应用植物组织培养快繁的技术，但目前该项技术存在原球茎诱导不成功、诱导率低、增值率低、培育时间长、再生苗质量不佳等问题。技术实现要素：本发明的目的在于解决上述技术问题，提供一种原球茎诱导率高、增殖率高、不易褐变、培育时间短、再生苗质量更优的大花蕙兰组织培养方法。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种快速繁殖大花蕙兰组织培养方法，其特征在于包含以下步骤：(1)外植体消毒：取开花第1～2天的大花蕙兰花瓣，无菌水流动冲洗15min，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液浸泡30min，然后用75％酒精擦拭30s，再用0.1％hgcl2浸泡4～5min，无菌水流动冲洗20min，吸干水分，切成0.6～0.8cm的段；(2)拟原球茎诱导：将步骤(1)所得外植体接种到第一培养基，所述培养基组成为：wpn基本培养基、6-ba0.5mg/l、naa1.0mg/l、葡萄汁5g/l、鱼油5g/l，培养30～40天，得到原球茎；(3)增殖培养：将步骤(2)所得原球茎切分后，接种于第二培养基，所述培养基组成为：dkw基本培养基、tdz3.0mg/l、活性炭1.0g/l、卵磷脂3g/l，培养50～60天，得到增殖后的原球茎；(4)生根培养：将步骤(3)增殖后的原球茎转入第三培养基，所述第三培养基组成为：b5基本培养基、naa2.5mg/l、琼脂8g/l、6-ba2mg/l，培养15～20天后，再次转入第三培养基，培养25～35天，得到生根苗；(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根苗移栽到栽培基质中，驯化2周，炼苗缓苗后正常培养。本发明以原球茎诱导难度较高的大花蕙兰花瓣作为外植体，消毒时以磷酸盐缓冲液浸泡处理，提高诱导率，并以特定含葡萄汁及鱼油的wpn培养基进行拟原球茎诱导，成功以75％以上的诱导率诱导得到原球茎，进而在特定含卵磷脂的dkw培养基中进行增殖，实现了增殖倍数8～10倍，接着在特定b5培养基中二次生根培养，经炼苗移栽，最终经过6个月左右快速繁殖获得种植苗，且种植苗生长健壮、色泽翠绿。在本发明的优选实施方案中，所述步骤(1)磷酸盐缓冲液配制方法为：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。采用磷酸二氢钾-氢氧化钠配制的缓冲液，能对外植体进行有效刺激，激活生长点细胞，进一步提高原球茎诱导率。在本发明的优选实施方案中，所述步骤(2)的培养环境为：培养温度23℃，每日光照9h，光照强度1500lx，有助于提高诱导速度，缩短诱导时间。在本发明的优选实施方案中，所述步骤(3)的培养环境为：培养温度25℃，每日光照11h，光照强度2500lx，有助于加快增殖速度，缩短增殖时间。在本发明的优选实施方案中，所述步骤(4)的培养环境为：培养温度25℃，每日光照8h，光照强度2000lx，有助于加快生根速度，缩短培育时间。在本发明的优选实施方案中，所述步骤(3)原球茎切成0.5cm小块，有利于原球茎增殖，加快继代。在本发明的优选实施方案中，所述第一培养基ph值为5.4，有助于提高诱导率，并能防止褐化。在本发明的优选实施方案中，所述第二培养基ph值为6.8，有助于提高增殖倍数，提高增殖速度。在本发明的优选实施方案中，所述第三培养基ph值为6.0，有助于形成健壮芽，幼苗健壮、叶色深绿，根毛多。综上，与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：以大花蕙兰花瓣作为外植体，实现了大花蕙兰组织培养快速繁殖，诱导率高、增殖倍数高，培育时间短，培育质量高，种植苗生长健壮、色泽翠绿，具有极高的商业价值。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1按照下述方法进行大花蕙兰组织培养。(1)外植体消毒：取开花第2天的大花蕙兰花瓣，无菌水流动冲洗15min，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液浸泡30min(磷酸盐缓冲液配制方法为：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)，然后用75％酒精擦拭30s，再用0.1％hgcl2浸泡5min，无菌水流动冲洗20min，吸干水分，切成0.8cm的段；(2)拟原球茎诱导：将步骤(1)所得外植体接种到第一培养基，所述培养基组成为：wpn基本培养基、6-ba0.5mg/l、naa1.0mg/l、葡萄汁5g/l、鱼油5g/l，调节ph为5.0，培养环境为：培养温度25℃，每日光照12h，光照强度2000lx，培养40天，得到原球茎；(3)增殖培养：将步骤(2)所得原球茎切成0.8cm小块，接种于第二培养基，所述培养基组成为：dkw基本培养基、tdz3.0mg/l、活性炭1.0g/l、卵磷脂3g/l，调节ph为6.0，培养环境为：培养温度25℃，每日光照12h，光照强度2000lx，培养60天，得到增殖后的原球茎；(4)生根培养：将步骤(3)增殖后的原球茎转入第三培养基，所述第三培养基组成为：b5基本培养基、naa2.5mg/l、琼脂8g/l、6-ba2mg/l，调节ph为7.0，培养环境为：培养温度25℃，每日光照12h，光照强度2000lx，培养20天后，再次转入第三培养基，培养35天，得到生根苗；(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根苗移栽到栽培基质中，驯化2周，炼苗缓苗后正常培养。实施例2按照下述方法进行大花蕙兰组织培养。(1)外植体消毒：取开花第1天的大花蕙兰花瓣，无菌水流动冲洗15min，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液浸泡30min(磷酸盐缓冲液配制方法为：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)，然后用75％酒精擦拭30s，再用0.1％hgcl2浸泡5min，无菌水流动冲洗20min，吸干水分，切成0.6cm的段；(2)拟原球茎诱导：将步骤(1)所得外植体接种到第一培养基，所述培养基组成为：wpn基本培养基、6-ba0.5mg/l、naa1.0mg/l、葡萄汁5g/l、鱼油5g/l，调节ph为5.4，培养环境为：培养温度25℃，每日光照12h，光照强度2000lx，培养36天，得到原球茎；(3)增殖培养：将步骤(2)所得原球茎切成0.5cm小块，接种于第二培养基，所述培养基组成为：dkw基本培养基、tdz3.0mg/l、活性炭1.0g/l、卵磷脂3g/l，调节ph为6.8，培养环境为：培养温度25℃，每日光照12h，光照强度2000lx，培养55天，得到增殖后的原球茎；(4)生根培养：将步骤(3)增殖后的原球茎转入第三培养基，所述第三培养基组成为：b5基本培养基、naa2.5mg/l、琼脂8g/l、6-ba2mg/l，调节ph为6.0，培养环境为：培养温度25℃，每日光照12h，光照强度2000lx，培养18天后，再次转入第三培养基，培养30天，得到生根苗；(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根苗移栽到栽培基质中，驯化2周，炼苗缓苗后正常培养。实施例3按照下述方法进行大花蕙兰组织培养。(1)外植体消毒：取开花第1天的大花蕙兰花瓣，无菌水流动冲洗15min，用ph为7.0的磷酸盐缓冲液浸泡30min(磷酸盐缓冲液配制方法为：取0.2mol/l磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/l氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得)，然后用75％酒精擦拭30s，再用0.1％hgcl2浸泡5min，无菌水流动冲洗20min，吸干水分，切成0.7cm的段；(2)拟原球茎诱导：将步骤(1)所得外植体接种到第一培养基，所述培养基组成为：wpn基本培养基、6-ba0.5mg/l、naa1.0mg/l、葡萄汁5g/l、鱼油5g/l，调节ph为5.4，培养环境为：培养温度23℃，每日光照9h，光照强度1500lx，培养30天，得到原球茎；(3)增殖培养：将步骤(2)所得原球茎切成0.5cm小块，接种于第二培养基，所述培养基组成为：dkw基本培养基、tdz3.0mg/l、活性炭1.0g/l、卵磷脂3g/l，调节ph为6.8，培养环境为：培养温度25℃，每日光照11h，光照强度2500lx，培养50天，得到增殖后的原球茎；(4)生根培养：将步骤(3)增殖后的原球茎转入第三培养基，所述第三培养基组成为：b5基本培养基、naa2.5mg/l、琼脂8g/l、6-ba2mg/l，调节ph为6.0，培养环境为：培养温度25℃，每日光照8h，光照强度2000lx，培养15天后，再次转入第三培养基，培养25天，得到生根苗；(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根苗移栽到栽培基质中，驯化2周，炼苗缓苗后正常培养。观察实施例大花蕙兰组织培养过程，记录并计算原球茎诱导率、增殖倍数，结果如下。实施例诱导率增殖倍数实施例178.2％8.0倍实施例280.6％9.2倍实施例385.8％10.5倍当前第1页12