本发明属于组织培养
技术领域：
，具体涉及一种兰花的组织培养，尤其是一种建兰愈伤组织的诱导方法。
背景技术：
：建兰(cymbidiumensifolium(linn.)sw.)，又称四季兰，是观赏植物兰花的一种，主要在6～10月开花，通常分两次开放，花期历时1周左右。主要分布于华南、华东及西南等地区，具有香味、耐高温和易开花的特点，具有较高的园艺和草药价值。建兰一般用分株的方式繁殖，这是由于兰属植物种子微小，胚未分化，无胚乳或仅有少量胚乳，在自然条件下极难萌发，因此一直沿用分株繁殖的方法进行繁殖。但这种繁殖方法变异极少，难以获得具叶艺、花艺、提早或推迟花期的优良品种。通过愈伤组织培养和繁殖是一种常见的兰花培养形式，利用愈伤组织可以达到快速扩繁的目的，应用于工厂化兰花的育苗，愈伤组织还可以用于植物种质资源的保存，或者作为次生代谢物质的生产车间，此外，它还是基因工程不可缺少的材料。目前对于建兰愈伤组织的诱导和培养研究并不多，存在诱导困难的问题，诱导出的愈伤组织容易褐化死亡，常无法进行继代培养，或者即使能够继代培养，但愈伤组织的培养时间过长，需要1至1.5年以上，并且生根率不高。技术实现要素：本发明的目的在于解决上述技术问题，提供一种容易诱导、诱导率高、诱导时间短、不易褐变、能够继代培养的建兰愈伤组织诱导方法。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种建兰愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：(1)以建兰的幼嫩子房为外植体，用75％酒精表面消毒1min，置于0.1g/100ml的hgcl2溶液浸泡消毒5～6min，无菌水冲洗3次，吸干水分；(2)将外植体置于第一培养基进行诱导，所述第一培养基以1/2ls为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l，置于温度20℃，光照8h/d，光照强度1500～2000lx条件下培养70～90天；(3)将(2)中培养的材料转移到第二培养基，所述第二培养基以n6为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.3mg/l、zt0.5mg/l、肌醇10mg/l，在25℃的黑暗条件下培养10～15天，接着置于温度20℃，光照12h/d，光照强度1500～2000lx条件下培养40～60天，然后置于25℃的黑暗条件下培养10～15天，最后在温度25℃，光照6h/d，光照强度1500～2000lx条件下培养40～60天。虽然所有的多细胞植物均具有诱导产生愈伤组织的潜在可能性，但建兰愈伤组织的培养一直存在较多技术问题，本发明申请人以建兰的幼嫩子房、幼叶、幼根、花瓣、根状茎等作为外植体，发现不论采用何种外植体，在兰花常用的基础培养基ms、vm、b5、ls等培养基中，均难以在12个月内诱导出能够继代培养的愈伤组织，本发明最终以建兰幼嫩子房作为外植体，以1/2ls作为第一培养基，明培养环境下诱导后，接着以n6作为第二培养基，在暗明交替的环境下培养，最终成功在6～8个月培育出能够继代培养的愈伤组织，同时诱导率高达70％以上，并且不易褐变。在本发明的优选实施方案中，所述幼嫩子房是建兰开花期间人工授粉后25d采集的发育正常的带花萼子房，与其他时期采集的子房以及不带花萼的子房相比，授粉后25d的带花萼子房诱导出愈伤组织的时间更短。在本发明的优选实施方案中，所述幼嫩子房在无菌条件下切成1～1.5mm长的子房段，避免长度过短愈伤组织不易产生，长度过长导致培养基物质不易渗入，诱导时间过长。在本发明的优选实施方案中，所述第一培养基的ph为6.0～6.5，有利于愈伤组织的生长和增殖。在本发明的优选实施方案中，所述第一培养基中还含有活性炭0.5mg/l，加入活性炭的第一培养基可进一步防止愈伤组织发生褐变，提高继代培养的成功率。在本发明的优选实施方案中，所述第二培养基的ph为5.2～5.6，有利于愈伤组织的生长和增殖。在本发明的优选实施方案中，所述第二培养基还含有植物凝胶2～2.5mg/l，加入植物凝胶的第二培养基可将诱导率由70％进一步提高至80％以上。综上，与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：提供了一种成功诱导出能够继代培养的建兰愈伤组织的方法，该愈伤组织不易褐化死亡，且培养时间大大缩短，由12～18个月缩短至6～8个月，愈伤组织长势良好，色泽健康，诱导率极高。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。对比例1～16取建兰的幼嫩子房、幼叶、幼根、花瓣等幼嫩组织作为外植体，消毒后，分别用ms、vm、ls、b5等作为基础培养基，所有培养基均添加2.4-d0.5mg/l，6-ba1mg/l，120天后统计愈伤组织的诱导和生长情况，结果如下。试验例外植体培养基接种数产生愈伤个数诱导率褐化率对比例1幼嫩子房ms5000——对比例2幼嫩子房vm5000——对比例3幼嫩子房ls5000——对比例4幼嫩子房b55000——对比例5幼叶ms5000——对比例6幼叶vm5000——对比例7幼叶ls5000——对比例8幼叶b55000——对比例9幼根ms50816％100％对比例10幼根vm5048％100％对比例11幼根ls5000——对比例12幼根b55000——对比例13花瓣ms5000——对比例14花瓣vm5000——对比例15花瓣ls5000——对比例16花瓣b55000——实验结果表明，仅在以幼根作为外植体，在ms和vm培养基(添加2.4-d0.5mg/l，6-ba1mg/l)中，才诱导出愈伤组织，但诱导率低于20％，并且诱导出的愈伤组织全部发生褐化。对比例17～28取建兰的幼嫩子房、幼叶、幼根、花瓣等幼嫩组织作为外植体，消毒后，分别用1/2ms、1/2ls、n6作为基础培养基，所有培养基均添加naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l，光照条件下培养120天，统计愈伤组织的诱导和生长情况，结果如下。实验结果表明，仅在以幼嫩子房作为外植体，在1/2ls培养基(添加2.4-d0.5mg/l，6-ba1mg/l)中，才诱导出愈伤组织，但诱导率仅为52％，并且诱导出的愈伤组织全部发生褐化。对比例29～34取建兰的幼嫩子房作为外植体，消毒后，用1/2ls作为基础培养基，添加naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l，光照条件下培养80天，然后将材料转移到n6或ms基础培养基，并添加naa0.3mg/l、zt0.5mg/l、肌醇10mg/l，分别在光照条件、黑暗条件，及明暗交替条件下培养120天，统计愈伤组织的诱导和生长情况，并将愈伤组织进行继代培养，结果如下。实施例1(1)取建兰的幼嫩子房(开花期间人工授粉后35d采集的发育正常的不带花萼子房)作为外植体，在无菌条件下切成1.5mm长的子房段，用75％酒精表面消毒1min，置于0.1g/100ml的hgcl2溶液浸泡消毒5min，无菌水冲洗3次，吸干水分；(2)将外植体置于第一培养基进行诱导，所述第一培养基以1/2ls为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l，调节ph为6.8，置于温度20℃，光照8h/d，光照强度1500lx条件下培养70天；(3)将(2)中培养的材料转移到第二培养基，所述第二培养基以n6为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.3mg/l、zt0.5mg/l、肌醇10mg/l，调节ph为5.0，在25℃的黑暗条件下培养15天，接着置于温度20℃，光照12h/d，光照强度2000lx条件下培养60天，然后置于25℃的黑暗条件下培养15天，最后在温度25℃，光照6h/d，光照强度2000lx条件下培养60天。实施例2(1)取建兰的幼嫩子房(开花期间人工授粉后35d采集的发育正常的带花萼子房)作为外植体，在无菌条件下切成1长的子房段，用75％酒精表面消毒1min，置于0.1g/100ml的hgcl2溶液浸泡消毒6min，无菌水冲洗3次，吸干水分；(2)将外植体置于第一培养基进行诱导，所述第一培养基以1/2ls为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l，调节ph为6.0，置于温度20℃，光照8h/d，光照强度1500lx条件下培养90天；(3)将(2)中培养的材料转移到第二培养基，所述第二培养基以n6为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.3mg/l、zt0.5mg/l、肌醇10mg/l，调节ph为5.6，在25℃的黑暗条件下培养10,天，接着置于温度20℃，光照12h/d，光照强度1500lx条件下培养60天，然后置于25℃的黑暗条件下培养10天，最后在温度25℃，光照6h/d，光照强度2000lx条件下培养60天。实施例3(1)取建兰的幼嫩子房(开花期间人工授粉后25d采集的发育正常的不带花萼子房)作为外植体，在无菌条件下切成1.2mm长的子房段，用75％酒精表面消毒1min，置于0.1g/100ml的hgcl2溶液浸泡消毒6min，无菌水冲洗3次，吸干水分；(2)将外植体置于第一培养基进行诱导，所述第一培养基以1/2ls为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l，调节ph为6.3，置于温度20℃，光照8h/d，光照强度2000lx条件下培养80天；(3)将(2)中培养的材料转移到第二培养基，所述第二培养基以n6为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.3mg/l、zt0.5mg/l、肌醇10mg/l，调节ph为5.4，在25℃的黑暗条件下培养15天，接着置于温度20℃，光照12h/d，光照强度1500x条件下培养55天，然后置于25℃的黑暗条件下培养13天，最后在温度25℃，光照6h/d，光照强度1500lx条件下培养50天。实施例4(1)取建兰的幼嫩子房(开花期间人工授粉后25d采集的发育正常的带花萼子房)作为外植体，在无菌条件下切成1mm长的子房段，用75％酒精表面消毒1min，置于0.1g/100ml的hgcl2溶液浸泡消毒6min，无菌水冲洗3次，吸干水分；(2)将外植体置于第一培养基进行诱导，所述第一培养基以1/2ls为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.5mg/l、kt0.2mg/l、tdz0.24mg/l、活性炭0.5mg/l，调节ph为6.2，置于温度20℃，光照8h/d，光照强度2000lx条件下培养70天；(3)将(2)中培养的材料转移到第二培养基，所述第二培养基以n6为基础培养基，包括以下浓度的组分：naa0.3mg/l、zt0.5mg/l、肌醇10mg/l，植物凝胶2.5mg/l，在25℃的黑暗条件下培养12天，接着置于温度20℃，光照12h/d，光照强度2000lx条件下培养40天，然后置于25℃的黑暗条件下培养10天，最后在温度25℃，光照6h/d，光照强度2000lx条件下培养40天。实施例1～4愈伤组织的诱导和生长情况，并将愈伤组织进行继代培养，观察培养情况，结果见下表。当前第1页12