一种利用莲藕提取物一步法制备高效、稳定复合纳米银抑菌剂的方法与流程

本发明涉及新型抑菌剂制备领域，特别涉及一种生物介导的复合纳米银抑菌剂的制备方法。

背景技术：

莲藕(nulumbonuciferagaertn.)属木兰科多年水生草本植物。其根状茎既可生食也可加热煮食，是被广泛食用的蔬菜之一。除了食用之外，莲藕同时还具有清热生津、开胃健脾、止血化瘀、益血补心、止泻、降血压、降血糖等药用价值。现代科学研究发现莲藕中富含儿茶素、儿茶酚、没食子酚、多巴、芦丁、绿原酸、咖啡酸等多酚类物质，另外还含有有机酸、鞣质、多糖、皂苷、维生素c等，能有效清除氧自由基，具有抗氧化、抗衰老的功效。因此，莲藕的抗氧化能力强，是提取抗氧化剂的优良原料。

壳聚糖是甲壳素n-脱乙酰基的产物，具有成膜性、生物降解性、生物相容性、安全无毒，壳聚糖表面具有丰富的氨基和羧基，为制备复合材料提供了结合位点。同时壳聚糖还是天然抑菌剂，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、假单胞菌等细菌以及白色念珠菌薄状菌属、脉孢菌属、座线孢菌属等真菌均具有良好的抑制作用。然而壳聚糖的抑菌能力比较温和，大大限制了壳聚糖在抗菌方面的应用。

纳米银是将粒径做到纳米级的金属银单质。随着纳米技术的兴起，纳米银以其巨大的比表面积和小尺寸效应、以及独特的抑菌机理和良好的抑菌性能已成为一种新型的抑菌剂，在化工、纺织、陶瓷、生命科学、医学抑菌领域得到广泛应用。目前纳米银的制备方法主要有化学合成法、物理合成法以及生物合成法三大类。其中，物理法和化学法对合成设备要求较高、在实验过程中往往需要加入对环境造成危害的化学试剂，并且合成的纳米银颗粒表面活性很高，容易发生团聚，导致抑菌功能丧失，不利于长期保存。生物合成法以生物自身蕴含的还原剂制备纳米银，与其他传统合成方法相比具有成本低廉、环境友好、抗菌广谱高效等优点，能充分利用生物资源，易于放大，适合大规模工业化生产，并且符合现代科技低成本、低耗能、绿色环保发展的理念。虽然目前已有不少利用植物、微生物提取物生物合成纳米银的报道，但研究发现不同生物材料制备的纳米银抑菌剂在理化性质、抑菌活性和抑菌谱等方面都存在着较大的差别。另外，生物提取物中的氨基酸、脂类、蛋白质、多糖等物质虽然在一定程度上能起到稳定纳米银的作用，但许多生物合成纳米银产品在长期放置过程中仍会有团聚现象发生，不利于纳米银的推广和应用。因此需要人们不断开发和利用新的生物材料，用以制备出更加高效、稳定的纳米银抑菌剂。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种采用莲藕提取液生物合成的纳米银复合抑菌剂的方法，该方法反应条件温和环保，简单易操作，充分发挥了纳米银和壳聚糖的协同抑菌作用，达到显著的抑菌效果，并且以壳聚糖为载体制备出的复合纳米银制剂将更加稳定。

一种利用莲藕提取物一步法制备高效、稳定复合纳米银抑菌剂的方法，其特殊之处在于包括以下步骤：

1、材料的预处理

将莲藕洗净，切片，烘干至恒重后得到干燥的藕片；

所述将莲藕洗净是先将莲藕用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤3-5次；

所述藕片置于烘箱中烘干至恒重，烘箱内的温度控制在50-80℃；

2、莲藕提取液的制备

将干燥的藕片捣碎研磨成粉末后与提取剂按照质量比1∶(1-100)的比例混合，100-500w微波处理5-10min后，加热回流，离心，取上清液，置于4℃备用；

所述提取剂为双蒸水、乙醇、乙醚、丙酮中的任意一种；

所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流0.5-10h；

所述离心处理在离心机内进行，离心机的转速控制在5000-10000rpm，离心10-15min；

3、壳聚糖溶液的制备：

称量0.1-3g的壳聚糖，加入到100ml1％的冰酸溶液中，持续搅拌过夜，使壳聚糖完全溶解，备用；

4、一步法生物合成纳米银

取上述1-10ml的壳聚糖溶液，至30ml双蒸水中，再加入一定体积的硝酸银溶液，持续搅拌5min，随后加入莲藕提取液0.1-10ml，定容至50ml(此时硝酸银的终浓度为0.01-1mol/l)，加热回流，即得到复合纳米银抑菌剂；

所述加热回流的温度控制在40-100℃，加热回流5-120min。

本发明综合利用莲藕提取液中多酚类化合物等物质优良的抗氧化活性将硝酸银生物还原成纳米银抑菌剂，并通过莲藕提取物中的活性成分作为稳定剂，形成单分散颗粒，进一步与壳聚糖结合制备出稳定的生物纳米银复合抑菌剂。产品充分发挥了生物纳米银和壳聚糖的协同抑菌作用，达到显著的抑菌效果，本发明涉及的合成方法同时实现了纳米银的生物合成与载体负载，操作简便，生产成本低廉，反应温和环保，能够避免传统化学合成法危害环境的弊端。抑菌实验表明，莲藕生物合成纳米银抑菌剂对临床耐药病原菌和水产病原菌均有显著的抑菌效果，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1：本发明施例1在不同硝酸银浓度下利用莲藕提取物生物合成复合纳米银抑菌剂的紫外-可见吸收光谱图；

图2：本发明施例2在不同反应时间下利用莲藕提取物生物合成复合纳米银抑菌剂的紫外-可见吸收光谱图；

图3：本发明实施例2合成12min制备产品的透射电镜照片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例为一种利用莲藕提取液生物合成复合纳米银抑菌剂的制备工艺，包括以下制备工艺：

1、材料的预处理

将莲藕先用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤5次，切片，60℃烘干至恒重，得到干燥的藕片，将干燥的藕片捣碎研磨成粉末；

2、莲藕提取液的制备

称取上述莲藕粉末10g，加入双蒸水100ml，微波炉100w处理10min，70℃加热回流2h。8000rpm离心10min，取上清液，储存于4℃备用；

3、壳聚糖溶液的制备：

称量壳聚糖0.5g，加入到100ml1％的冰酸溶液中，持续搅拌过夜，使壳聚糖完全溶解，备用；

4、生物合成复合纳米银抑菌剂

取上述壳聚糖溶液1ml，加入到30ml双蒸水中，再加入不同体积的硝酸银溶液，搅拌5min，随后加入莲藕提取液1ml，定容至50ml(硝酸银的终浓度分别为0.5mm、1.0mm、1.5mm和2.0mm)，60℃加热回流20min后取样，冷却至室温检测。

5、紫外-可见吸收光谱表征

将制备好的样品溶液通过紫外-可见分光光度计扫描，扫描波长范围为300-600nm。由附图1可以看出，当硝酸银的浓度为0.5mm时制备的样品溶液在420nm附近出现了由于表面等离子体共振而产生的纳米银特征吸收峰，说明通过本发明提供的方法可以成功制备出纳米银抑菌剂。并且随着硝酸银浓度的增加其对应产品的吸收峰逐渐增强，当硝酸银的浓度达到2.0mm时产生的纳米银抑菌剂形成了显著的吸收峰。

实施例2

本实施例为一种利用莲藕提取液生物合成复合纳米银抑菌剂的制备工艺，包括以下制备工艺：

1、材料的预处理

将莲藕先用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤5次，切片，60℃烘干至恒重，得到干燥的藕片，将干燥的藕片捣碎研磨成粉末；

2、莲藕提取液的制备

称取上述莲藕粉末10g，加入50％乙醇100ml，微波炉500w处理5min，60℃加热回流1h。8000rpm离心10min，取上清液，储存于4℃备用；

3、壳聚糖溶液的制备

称取壳聚糖1g，加入到100ml1％的冰酸溶液中，持续搅拌过夜，使壳聚糖完全溶解，备用。

4、生物合成复合纳米银抑菌剂

取上述壳聚糖溶液1ml，加入到30ml双蒸水中，再加入10ml的10mm硝酸银溶液，搅拌5min，随后加入莲藕提取液2ml，定容至50ml(硝酸银终浓度2mm)，70℃加热回流3min、6min、9min、12min、15min后取样，冷却至室温检测。

5、紫外-可见吸收光谱表征

将制备好的样品溶液通过紫外-可见分光光度计扫描，扫描波长范围为300-600nm。由附图2可以看出，制备的样品溶液在425nm附近出现了明显的纳米银特征吸收峰，并且随着反应时间的延长吸收峰逐渐增强。从本实施例可以看出由莲藕提取物介导的纳米银复合物的合成效率很高，合成反应在进行3min后即可产生吸收峰。

6、透射电子显微镜观察

取5-10μl上述步骤4加热回流12min后制备的产品溶液滴加在铜网上，室温干燥，用透射电子显微镜在80-300kv电压下观察。如附图3所示，由莲藕生物合成的纳米银颗粒呈球形，粒径范围在3-30nm左右，粒径相对均匀。从图中可以看出，纳米银颗粒以单分散形式均匀负载在壳聚糖表面上。多数纳米银为5nm左右的小颗粒，较同类纳米银制剂小很多。纳米银较小的粒径，再加上壳聚糖较高的生物相容性，将有利于该复合纳米抑菌剂结合在病原菌的细胞壁和细胞膜上并直接进入菌体，与蛋白酶上的巯基结合，使其失活，并抑制细菌dna的合成，最终导致病原菌死亡。

对比例1

本对比例为一种不加载体的单纯莲藕生物合成纳米银抑菌剂的工艺，包括以下制备工艺：

1、材料的预处理

将莲藕先用自来水冲洗干净后，再用双蒸水洗涤5次，切片，60℃烘干至恒重，得到干燥的藕片，将干燥的藕片捣碎研磨成粉末；

2、莲藕提取液的制备

称取上述莲藕粉末10g，加入50％乙醇100ml，微波炉500w处理10min，60℃加热回流1h。8000rpm离心10min，取上清液，储存于4℃备用。

3、生物合成纳米银抑菌剂

取莲藕提取液2ml，加入到30ml双蒸水中，再加入10ml的10mm硝酸银溶液，定容至50ml(硝酸银终浓度2mm)，70℃加热回流20min后取样，冷却至室温检测。

对比例2

本实施例为一种化学法合成复合纳米银抑菌剂的制备工艺，包括以下制备工艺：

1、柠檬酸钠溶液的制备

称取1g柠檬酸钠，搅拌溶解于100ml双蒸水中，备用。

2、壳聚糖溶液的制备

称取壳聚糖1g，加入到100ml1％的冰酸溶液中，持续搅拌过夜，使壳聚糖完全溶解，备用。

3、化学合成复合纳米银抑菌剂

取上述壳聚糖溶液1ml，加入到30ml双蒸水中，再加入10ml的10mm硝酸银溶液，搅拌10min，随后加入步骤1制备的柠檬酸钠溶液5ml，定容至50ml(硝酸银终浓度2mm)，加热至沸腾，15min后取样，冷却至室温检测。

对比例3

将实施例2合成12min的产品与对比例1及对比例2的样品进行如下步骤的对比评价：

1、抑菌圈实验：

分别选用4种临床病原菌大肠杆菌(escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和4种水产病原菌：鳗弧菌(vibrioanguillarum)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、灿烂弧菌(vibriosplendidus)作为指示菌，采用常规杯碟法进行抑菌圈实验检测合成的纳米银抑菌剂的抑菌活性。具体实验方法如下：供试临床病原菌采用lb培养基(胰化蛋白胨10g酵母提取物5g，nacl5g，蒸馏水定容至1000ml，ph调至7.4)，37℃培养。海洋水产病原菌采用2216e培养基(蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，陈海水定容至1000ml)，28℃培养。将培养至对数增长期的供试菌用生理盐水稀释菌液浓度至1×10⁶cfu/ml，取100μl均匀涂布到对应的固体培养基上，在培养基上放置牛津杯(杯外径8mm)，在不同培养皿中分别加入实施例2、对比例1及对比例2的样品20μl，分别以壳聚糖、莲藕提取液、柠檬酸钠各20μl做为对照，将培养平皿置于恒温培养箱中过夜培养，观测抑菌圈直径。所有实验重复三次，结果用平均值±标准偏差表示，具体实验结果见附表1。从表中可以看出莲藕提取液和柠檬酸钠溶液对供试病原菌没有抑菌活性；壳聚糖具有一定的抑菌活性，可以在牛津杯周围产生较小的抑菌圈；而实施例2中的莲藕生物合成的复合纳米银抑菌剂、对比例1中的莲藕生物合成的单纯纳米银抑菌剂以及对比例2中的化学还原法制备的复合纳米银抑菌剂对所有供试临床病原菌和水产病原菌都有明显的抑菌圈。进一步比较可以看出实施例2较对比例1和对比例2的抑菌圈均大很多、具有更强的抑菌优势，说明莲藕生物合成的纳米银与壳聚糖发挥了协同抑菌活性，可以达到更为显著的抑菌效果。

附表1纳米银制剂对供试病原菌的抑菌圈直径

2、最小抑菌浓度实验：

以临床耐药病原菌金黄色葡萄球菌作为供试菌，采用二倍稀释法测定所制备的纳米银抑菌剂的最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration,mic)，从而定量评价制备纳米银的抗菌活力。二倍梯度稀释三种供试样品，等体积加入的1×10⁶cfu/ml新鲜金黄色葡萄球菌培养液，于37℃恒温培养24h，观察菌液的生长情况，不长菌的最低样品浓度即为mic。由附表2可以看出，实施例2样品的mic为6.25μg/ml，明显低于对比例1的25μg/ml和对比例2的50μg/ml，说明莲藕提取液生物合成的复合纳米银抑菌剂可以以更低的剂量达到抑制病原菌生长的效果，因此，其具有更强的抑菌活性。

附表2纳米银制剂对供试病原菌的最小抑菌浓度(mic)的测定

注：“+”表示有浑浊，“-”表示没有浑浊

3、稳定性实验：

由于纳米银具有大的比表面积和较小的粒径，极易发生团聚，这势必会影响其抑菌效果的发挥。因此稳定性成为抑菌剂的重要评价指标之一。将上述三种纳米银溶液在室温避光条件下放置三个月以后观察，发现对比例1和对比例2均出现溶液浑浊、沉淀析出的现象，抑菌圈实验也表明它们对供试病原菌的抑菌圈直径明显减小；而实施例2中的生物合成复合纳米银抑菌剂依然保持澄清透明，并且对供试病原菌的抑菌圈直径变化不大，仍具有显著的抑菌效果。因此本发明制备的产品抑菌效果显著、性能稳定，具有很好的应用推广价值。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。