一种紫花苜蓿水培扦插扩繁方法与流程

本发明涉及紫花苜蓿无性扩繁技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿水培扦插扩繁方法。

背景技术：

紫花苜蓿为豆科苜蓿属草本植物，由于紫花苜蓿属于严格的异花授粉植物，自交结实率极低，种子繁殖难度大，为保持其单株的优良品质，加速繁殖其后代，形成具有特异性状的株系，用于后续的综合品种和单株选育过程中。同时，在雄性不育系发现之后，无性扦插在紫花苜蓿三系扩繁及后期育种工作中具有重大意义。另外，由于紫花苜蓿是异花四倍体，同一品种不同植株基因型不一样，这样通过种子发芽育苗后进行分子相关研究干扰大，而扦插扩繁可以产生基因型一致的植株，为基因组、转录组和蛋白组等分子研究提供基因型一致的材料。

目前国内外常用的扦插方法主要是基于土培条件下的大田扦插和室内苗盘扦插。虽然部分种质扦插成活率可达到85％，但大田扦插相对不方便管理；室内苗盘扦插相对大田扦插，具有方便管理和省时省力的优点，但与大田扦插均有共有的缺点：扦插的无性系生长一致性较差，特别是用于分子育种研究中对结果干扰大。所以，需要发明一种更方便高效且产生的无性系具有一致性高的扦插方法，满足紫花苜蓿分子生物学研究，也能满足紫花苜蓿的常规扩繁和保育。

水培扦插是以水或营养液为介质，代替常用基质，具有快捷方便、洁净无污染、低碳环保、易管养、成本低廉等优点，同时也可对植物的营养成分进行精确控制，有利于了解植物的生长状况，受自然条件限制小，能够在多季节大量育苗，同时还兼具可方便观察根系生长的全过程。但是，因生根性差等因素，紫花苜蓿水培扦插系统一直未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对紫花苜蓿水培扦插方法的缺失，提供一种原创的生根率较高，可短时间获得大量紫花苜蓿水培扦插育苗的方法。本发明是首次发明紫花苜蓿水培扦插扩繁技术，为紫花苜蓿常规育种及分子水平研究提供重要扩繁技术。特别是可以解决紫花苜蓿土培扦插扩繁生长差异大，难以用于基因组、转录组、蛋白组等分子水平研究的瓶颈。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种紫花苜蓿水培扦插扩繁方法，包括扦插营养液配制，扦插苗的制备，水培扦插，扦插后管理，定植等步骤。

其中，扦插苗的制备方法为:以水培28-32天的紫花苜蓿为扦插苗，选取茎基直径为1.6～1.8mm的第一节茎节为插穗；

其中，扦插后管理方法为：水培扦插的第一周光照强度为180-220μmol/m2·s光照12h(25℃)/黑暗12h(20℃)，相对湿度70-80％。一周后换取营养液，光照强度变280-320μmol/m2·s，光照16h(25℃)/黑暗8h(20℃)，相对湿度70-80％，每6-8天更换同样配方的营养液至培养24-26天；其中所述营养液用改良的hoagland液和/或hb-101天然植物活力液配制。

优选的，所述以水培28-32天的紫花苜蓿为扦插苗，是在改良的hoagland液中水培30天。

其中所述扦插，方法如下：向培养容器内倒入750ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成45°角斜切，插穗长6～8cm，留一个叶片，带有1个叶芽，用1cm厚的海面(长5～6cm，宽1.8～2.0cm)将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住。然后将其插入pvc板的小孔内，然后放置在培养容器中。

其中，所述水培扦插，方法如下：以改良的1/2hoagland液为水培基液，加入1/1000的hb-101天然植物活力液，生根后转入改良的hoagland液中培养一周后定植。

其中，所述水培扦插以塑料盆作为培养容器，在盆的外侧用黑胶带覆盖来模拟植物根系黑暗生长的条件，并可防止营养液中绿藻的生长，培养容器放置厚度为0.4-0.6cm上有10-20个直径为1-1.5cm的圆孔pvc板。

其中，所述的定植，方法如下：生根25天后，将生根的紫花苜蓿水培苗在改良的hoagland液中壮苗一周后可用于后续试验，或定植于育苗盆中。

本发明进一步提供详细的方法，以利于操作。

(1)扦插苗的准备：紫花苜蓿种子在培养箱中催芽7天后进行水培培养，培养条件为：光照16h(25℃)/黑暗8h(20℃)，光照强度为300μmol/m²·s，相对湿度75％，每7天更换培养液直至培养30天。其中水培培养采用改良的hoagland液，其配方及配制方法如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，a、b母液分别稀释200倍，c液稀释1000倍，d液铁盐稀释200倍，混合后得到的是改良的hoagland营养液。

(2)扦插装置的设计：以白色塑料盆作为培养容器，在盆的外侧用黑胶带覆盖来模拟植物根系黑暗生长的条件，并可防止营养液中绿藻的生长。厚度为0.5cm的pvc板按照培养盆的大小切割后，均匀打成15个圆孔，消毒后备用。

(3)扦插营养液配制：扦插营养液以改良的1/2hoagland为基液，并加入1/1000的天然植物活力液，室温保存备用。其中，hoagland液配方同上，天然植物活力液为淘宝电商上所购买，如(日本hb-101品牌)。

1/2hoagland液，其配方及配制方法如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，a、b母液分别稀释400倍，c液稀释2000倍配置，d液铁盐稀释400倍。混合后得到的是改良的1/2hoagland液。

(4)插穗选择：以(1)中所述，培养30天的紫花苜蓿用于扦插，选取茎基直径为1.6～1.8mm的枝条第一节茎节为插穗；

(5)扦插：向培养容器内倒入750ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成45°角斜切，插穗长6～8cm，不留叶片，带有1个叶芽，用剪好的海面条将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住。然后将其插入pvc板的小孔内，然后放置在培养容器中；

(6)扦插后管理：水培的第一周光照强度为200μmol/m²·s，光照12h(25℃)/黑暗12h(20℃)，相对湿度75％。一周后光照强度变为300μmol/m²·s，光照16h(25℃)/黑暗8h(20℃)，相对湿度75％，每7天更换同样配方的营养液至培养25天。

(7)定植：培养7天后陆续生根，生根25天后，生根率达到98.3％，将生根的紫花苜蓿水培苗在(1)中所述的营养液中壮苗一周后可用于后续试验，或定植于育苗盆中。

以上步骤(2)所述的培养盆的规格为长17.5cm，宽11.5cm，高5cm，容积为800ml；所述的pvc板的规格为长17.5cm，宽11.5cm，厚0.5cm，板上的圆孔直径为1.2cm；以上步骤(5)所述海绵为厚度1cm，长5～6cm，宽1.8～2.0cm。采用75％酒精擦拭pvc板和培养盆表面，剪好的海绵条用自来水清洗1-2遍，后用蒸馏水清洗1遍。表面消毒的培养盆、pvc板和洗好的海绵放于超净台中紫外杀毒4h后备用。

以上步骤(1)所述的营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。步骤(1)中培养扦插苗的营养液时，a、b和d母液分别稀释200倍，c液稀释1000倍配制。步骤(3)中的扦插营养液可用步骤(1)中配制的母液来配制，a、b和d母液分别稀释400倍，c液稀释2000倍配制，并加入1/1000的hb-101天然植物活力液。

对比与现有扦插技术，本发明具有的优点及有益效果如下：

1.本发明是紫花苜蓿首次尝试水培扦插扩繁。相比于大田和室内苗盘扦插，具有方便管理和省时省力的优点，而且扦插的无性系生长一致性较好，特别是可用于分子育种研究中。

2.本发明以培养盆作为培养容器，采用酒精表面消毒和紫外消毒，有效的避免了因培养容器带菌导致水培过程中发霉的现象，而且占用空间小，对工作空间要求小，适宜广泛推广。

3.本发明使用水培苗枝条进行扦插，插穗一年四季均容易获得，且本方法一年四季都可进行无性苗的扦插扩繁，不受季节和气温限制，延长了有效扦插时间。

4.本发明配制的营养液营养均衡合理，使得扦插苗生长健壮一致，操作简单，管理简便，经济实用高效，杜绝了病虫害，而且节省了传统土壤扦插时所需的浇水、除草、喷雾等管理措施所耗费的人力，节约了大量成本；扦插7天后开始生根，15天后生根率达50％以上，扦插25天后生根率达到98.3％，根系健壮发达、生根率高且稳定，大大缩短了育苗周期。

5.本发明紧密结合生产实际，其实用性和可操作性强，成本低廉，可广泛应用于苜蓿育种及研究中，亦可对其他植物扦插扩繁提供参考，具有广阔的应用前景和技术成果转化潜力。

附图说明

图1为实施例中所使用的培养盆、pvc板和海绵条。

图2为实施例中扦插后的整体图。

图3为实施例中不同茎节节段扦插的整体区别图。

图4为实施例中不同茎节节段扦插对株高和根长的影响图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

选用无棣紫花苜蓿品种进行试验，种子在培养箱中催芽7天后进行水培培养，培养条件为：光照16h(25℃)/黑暗8h(20℃)，光照强度为300μmol/m²·s，相对湿度75％，每7天更换改良的hoagland营养液直至培养25天，培养的营养液配方如下：

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存。配置营养液工作液时，a、b母液分别稀释200倍，c液稀释1000倍配制，d液铁盐稀释200倍。

以白色塑料盆(长17.5cm，宽11.5cm，高5cm)作为培养容器，在盆的外侧用黑胶带覆盖来模拟植物根系黑暗生长的条件，并可防止营养液中绿藻的生长。厚度为0.5cm的pvc板按照盆的大小切割后，均匀打15个(3×5)直径1.2cm的圆孔。剪好的海绵条(厚1cm，长5～6cm，宽1.8～2.0cm))用自来水清洗1-2遍，后用蒸馏水清洗1遍。采用75％酒精擦表面消毒的培养盆、pvc板和洗好的海绵放于超净台中紫外杀毒4h后备用。

扦插营养液配制：扦插营养液以改良的1/2hoagland为基液，加入1/1000的hb-101天然植物活力液的扦插营养液，室温保存备用。

注：营养液的配制时，须每个药品单独溶解后再进行混合，配制好的母液存于棕色瓶中，并放于黑暗中储存，配置营养液工作液时，a、b母液分别稀释400倍，c液稀释2000倍配置，d液铁盐稀释400倍。

插穗的选择：水培培养30天的无棣紫花苜蓿用于扦插，选取茎基部直径为1.6～1.8mm的健壮枝条，下节为第一茎节，中节为第五茎节，上节为枝条的最顶端。

扦插：向培养容器内倒入750ml配好的扦插营养液，将选好的插穗上切口与枝条垂直平切，下切口与枝条成45°角斜切，插穗长6～8cm，不留叶片，带有1个叶芽，用海面条将插穗卷起，保证叶芽露在外面不被海绵包住。然后将其插入pvc板的小孔内，然后放置在培养容器中。

扦插后管理：水培的第一周光照强度为200μmol/m²·s，光照12(25℃)/黑暗12h(20℃)，相对湿度75％。一周后换取营养液，光照强度变为300μmol/m2·s，光照16h(25℃)/黑暗8h(20℃)，相对湿度75％，每7天更换同样配方的营养液。14天后，上中下节生根率分别可达55％、78.3％和51.7％。培养25天后生根率不再改变，上节生根率为78.3％，中节生根率为93.3％，下节生根率可达到98.3％。

定植：将生根的紫花苜蓿水培苗在(1)中所述的营养液中壮苗一周后可用于后续试验，或定植于育苗盆中。

按照上述实施例的方法，水培扦插25天后观察统计生根率，生根率＝(生根单株数/该组插穗总数)×100％，具体结果如表1。

表1按照实施例1-6的方法进行紫花苜蓿水培扦插育苗25天所得到的生根率及生长指标。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。