一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法。

背景技术：

蒲公英(taraxacummongolicumhand.-mazz)为菊科多年生草本植物，主要产于北半球温带至亚热带地区，我国广泛分布于东北、华北、西北、华中及西南各省区。蒲公英的营养价值高，其植物体中含有蒲公英醇、蒲公英素、胆碱、有机酸、菊糖等多种健康营养成分；蒲公英是传统的中药材，具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋之功效。此外，蒲公英作为一种优质的营养保健蔬菜，越来越受到人们的青睐。蒲公英集食用和药用于一身，人们称之为食疗蔬菜。蒲公英的有性繁殖方式需要异花授粉，易受杂交污染，不利于保持种苗的优良性状和纯度。

对于蒲公英的遗传转化，体外高效再生体系的建立是必不可少的前提。利用蒲公英叶片为外植体建立的高效再生体系，对于进行蒲公英有效成分更加深入的研究和优良性状的保持具有重大的意义，同时提高了蒲公英的培养效率，为建立蒲公英遗传转化体系提供了一定的基础。

技术实现要素：

本发明提供一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法,可通过蒲公英叶片为材料，进行愈伤组织的诱导及植株再生，实现了蒲公英高效的组培体系，为建立蒲公英遗传转化体系提供技术支撑。

一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法，包括下列步骤：

(1)外植体的消毒：摘取蒲公英植株从根部数起第二片幼嫩叶片，在超净台中进行叶片消毒处理后，将其剪成1cm²大小；

(2)丛生芽的诱导及培养：将消毒后的外植体接种至ms培养基上进行丛生芽的诱导；

(3)丛生芽的壮芽：待丛生芽长至2cm左右时，将丛生芽切下，每一株保留2-3个丛生芽，接种至ms培养基上进行壮芽培养；

(4)生根和移栽：待丛生芽长至3cm左右时，将单个芽切下，接种至生根培养基上进行生根培养，待根系长出后，将其炼苗移栽。

所述的步骤(1)中无菌材料的消毒处理方法为：将采摘的叶片上的泥土用自来水冲洗干净，擦干后放入超净工作台，然后用75％的酒精进行消毒45s，最后用无菌水冲洗3次，无菌的吸水纸吸去表面水分，用于接种；

所述的步骤(2)中丛生芽诱导的ms培养基中加入1.5mg.l^-1的6-ba和0.2mg.l^-1的naa，培养基的ph＝5.80，诱导培养基中培养35d；

所述的步骤(4)中生根培养基为1/2ms基本培养基中加入0.4mg.l^-1的naa，植株炼苗时间为3-5d，移栽所用基质为蛭石：营养土按质量比1：2均匀混合。

所述植物组织培养各个阶段，培养条件均为光照强度为2000lx，每日光照12h，培养温度(25±2)℃。

本发明采用了蒲公英叶片作为材料，外植体在消毒后，在添加1.5mg.l^-1的6-ba和0.2mg.l^-1的naa的ms培养基作用下诱导丛生芽，在添加0.4mg.l^-1naa的ms培养基作用下诱导生根；本发明成功建立了蒲公英高效的再生体系，可在组织培养和遗传转化的步骤中进行使用。

附图说明

图1外植体各个时期的形态，

其中a.培养10d时蒲公英丛生芽的诱导情况；

b.培养25d时蒲公英丛生芽的诱导情况；

c.培养35d时蒲公英丛生芽的诱导情况；

d.蒲公英丛生芽的壮芽；

e.蒲公英丛生芽诱导生根；

f.蒲公英的移栽苗。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

培养基及培养条件：丛生芽诱导培养基为：ms+1.5mg.l^-16-ba+0.2mg.l^-1naa；丛生芽生根培养基为：ms+0.4mg.l^-1naa。所述培养的各个阶段，光照强度2000lx，每日光照12h，温度(25±2)℃。

实施例1一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法

1.1外植体的消毒：摘取蒲公英植株从根部数起第二片幼嫩叶片，用自来水将表面泥土冲洗干净，擦干表面水分后放入超净台中，用75％的酒精消毒45s，随后用无菌水清洗3次，每次1min，擦干表面水分后用手术刀将其切成1cm²大小。

从表1可看出，用不同时间组合的0.1％的升汞溶液和75％的酒精对蒲公英叶片进行消毒处理，随着0.1％的升汞溶液消毒时间的增加，污染率随之降低，但褐化率也随之上升。当使用0.1％的升汞溶液的消毒2min时，褐化率达到了100％。随着0.1％的升汞溶液消毒时间的减少，外植体的存活率呈现出上升的趋势。综合比较污染率、褐化率及存活率三个指标，最终确定蒲公英叶片外植体最佳时间为酒精消毒45s，此时污染率平均为4.67％，褐化率平均为3.33％，存活率平均为91.59％。

表1不同消毒时间组合对蒲公英叶片的污染率、褐化率及存活率的影响

1.2丛生芽的诱导及培养：将消毒后的外植体接接种至含有6-ba1.5mg.l^-1和iba0.2mg.l^-1的ms培养基中，进行丛生芽诱导及培养，时间为35d左右。如图1中a、b、c所示。

1.3壮芽：待丛生芽长至2cm左右时，将丛生芽切下，每一株保留2-3个丛生芽，接种至ms培养基上进行壮苗生长。如图1中d所示。

1.4生根培养和移栽：待丛生芽长至3cm左右时，将单个芽切下，接种至含有naa0.4mg.l^-1的生根培养基中进行生根培养，如图1中e所示；将长出健壮根系的植株开盖炼苗3～5d后移栽，移栽所用基质为蛭石：营养土按质量比1：2均匀混合。如图1中f所示。

技术特征：

1.一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法，包括下列步骤：

(1)外植体的消毒：摘取蒲公英植株从根部数起第二片幼嫩叶片，在超净台中进行叶片消毒处理后，将其剪成1cm²大小；

(2)丛生芽的诱导及培养：将消毒后的外植体接种至ms培养基上进行丛生芽的诱导；

(3)丛生芽的壮芽：待丛生芽长至2cm左右时，将丛生芽切下，每一株保留2-3个丛生芽，接种至ms培养基上进行壮芽培养；

(4)生根和移栽：待丛生芽长至3cm左右时，将单个芽切下，接种至生根培养基上进行生根培养，待根系长出后，将其炼苗移栽。

2.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(1)中无菌材料的消毒处理方法为：将采摘的叶片上的泥土用自来水冲洗干净，擦干后放入超净工作台，然后用75％的酒精进行消毒45s，最后用无菌水冲洗3次，无菌的吸水纸吸去表面水分，用于接种。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(2)中丛生芽诱导的ms培养基中加入1.5mg.l^-1的6-ba和0.2mg.l^-1的naa，培养基的ph＝5.80，诱导培养基中培养35d。

4.根据权利要求1所述的方法，所述的步骤(4)中生根培养基为1/2ms基本培养基中加入0.4mg.l^-1的naa，植株炼苗时间为3-5d，移栽所用基质为蛭石：营养土按质量比1：2均匀混合。

5.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(2)-(4)的培养条件均为光照强度为2000lx，每日光照12h，培养温度(25±2)℃。

技术总结
本发明涉及了一种以蒲公英叶片为外植体建立高效再生体系的方法。本方法中以蒲公英叶片为外植体，具体操作步骤如下：(1)外植体的消毒；(2)丛生芽的诱导；(3)丛生芽的壮芽；(4)生根和移栽。本方法利用蒲公英叶片为外植体，建立了蒲公英高效的再生体系，使用本方法，可提高蒲公英的培养效率，为建立蒲公英稳定的遗传转化体系奠定了一定的基础。

技术研发人员：赵德刚;余思文
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：2020.07.21
技术公布日：2020.10.27