一种真蕨类植物的人工授精的方法与流程

本发明涉及植物人工授精技术领域，具体涉及一种真蕨类植物的人工授精的方法。

背景技术：

现今地球上生存的蕨类植物约12000多种，我国约有2600种。从古至今，蕨类植物在人类的生活生产中占据了举足轻重的地位，在工业方面，石松的孢子是冶金工业的优良脱模剂，还可用于制造火箭、照明弹等；绝大多数蕨类植物都具有一定药用价值，如金毛狗蕨具有补肝肾、祛风湿等功效，海金沙可治尿道感染和结石，江南卷柏可治湿热黄疸、水肿；蕨类植物食用的历史也相当悠久：蕨的根状茎富含淀粉，幼叶有特殊的清香，食用价值很高；在近几十年，蕨类植物的观赏价值也逐渐被挖掘；还有一些濒危蕨类植物用于科学研究，如桫椤等。

蕨类是维管植物中靠游动精子与卵结合受精的特殊类群。与种子植物通过花粉管的授精方式截然不同。精子是只有约10μm长度的螺旋状单细胞，且没有细胞壁等任何保护结构。精子是因为受到颈卵器所分泌的磁性物质的梯度浓度的引导才能游到颈卵器处完成受精，所以能否顺利游入颈卵器不仅受精子活力、精子寿命等内在因素影响，还受水的理化性质所制约。而颈卵器所分泌的磁性物质很容易被水稀释，所以对于寿命不足半个小时且游动方向是随机的蕨类精子来说自然受精是很难完成的。蕨类植物的成苗率很低，在自然条件下长势也比较缓慢。我国蕨类植物的繁殖技术又相对滞后，使我国的蕨类资源连年锐减。这些原因都驱使我们需要快速高效的繁殖大量的蕨类植物。目前，有关蕨类植物精子的研究大部分都是关于超微结构的观察。

技术实现要素：

针对目前蕨类植物的繁殖技术相对滞后导致蕨类植物成苗率低的问题，本发明提供了一种真蕨类植物的人工授精的方法，包括如下步骤：

(1)孢子的培养：将孢子接种至培养基中，经避光保存后，在光照强度1800-4000lux、光照时间12h/d的条件下培养至性器成熟，所述避光保存的条件为18-25℃下避光保存12-48h；

(2)精子的提取:选取成熟的雄配子体，当精子大量释放时,使用取精工具将精子吸出，置于与精子同等体积的清水中，获得精子悬浊液；

(3)人工授精:选取发育成熟的雌配子体，将其放置在相对湿度为30％-40％的环境条件下静置6-12h，当雌配子体的颈卵器周围无水膜时，滴加诱导液与精子悬浊液，待精子游入雌配子体的颈卵器内部，人工授精完成。

进一步限定，真蕨类植物为笔筒树或金毛狗蕨或中华水韭。

进一步限定，培养基为暗棕壤、腐殖土、琼脂培养基或蕨类原生境的土壤。

更进一步限定，培养基中还添加激素或营养液，所述激素为精子囊素、赤霉素、脱落酸、乙烯等的一种或多种的混合，所述营养液为糖类物质、钙离子和甲硫氨酸中的一种或多种的混合。

进一步限定，孢子接种的密度为40-80个/cm²可获得雄性配子体；接种密度为4-8个/cm²可获得雌性配子体的孢子。

进一步限定，雄配子体的培养方法为，将雄配子体孢子均匀散落到培养基中，接种密度为60个/cm²，先置于20-25℃黑暗环境下24h，然后放置于，光照强度2500-3500lux、光照时间12h/d的环境下培养，保持培养环境中空气相对湿度为65％-85％，50d后，每2d在体视显微镜下观察配子体上是否有精子器出现，待精子器大量成熟，即进行取精。

进一步限定，雌配子体的培养方法为，将雌配子体孢子均匀散落到培养基中，接种密度为6个/cm²，接种后将培养皿放入瓷盘中，以玻璃覆盖，先置于20-25℃黑暗环境下24h，然后放置于光照强度2500-3500lux、光照时间12h/d的环境下培养，保持培养环境中空气相对湿度为65％-85％，培养至颈卵器顶端四个盖细胞刚刚开裂即发育成熟。

进一步限定，步骤(2)中的取精工具为微细管，所述微细管通过如下方法制备获得：直径0.5-1cm的玻璃管，将玻璃管中段经酒精喷灯火焰烘烤，拉伸玻璃管两端使玻璃管中段最细处孔径1-3mm时停止，然后换用酒精灯烘烤，继续拉伸玻璃管两端至最细处内孔径为0-2um时，选择3-5μm孔径处折断，制成两根微细管，作为取精工具。

进一步限定，步骤(2)中精子的提取的具体方法为：在体视显微镜下选取精子器成熟且密集的真蕨类植物的雄配子体，置于装有水的培养皿中，将雄配子体上附着的杂质清洗干净，然后放置于带有凹槽的载玻片上，在凹槽中滴入蒸馏水浸没配子体，在体视显微镜下观察，当观察到精子大量释放时，取微细管置于精子密集区，精子自动虹吸到微细管里，然后将其滴到同等体积的蒸馏水中，待3-5s后吸出，蒸馏水清洗后获得大量的活泼的蕨类植物的精子。

进一步限定，步骤(3)中诱导液质量浓度为1％-3％的葡萄糖酸钙水溶液；人工授精时，以颈卵器面积为基准计，每个颈卵器使用诱导液的用量为0.05ml/cm²，添加精子悬浊液为0.1ml。

有益效果

本发明的人工授精方法，不仅能使配子体的受精率达到30％-50％，是常规人工培养条件下的3-5倍，还常常出现单个配子体有两个胚胎发育的现象，并且也使蕨类植物的杂交技术更为简便易行。

附图说明

图1为金毛狗蕨的精子依次向左上方游动；

图2为金毛狗蕨精子涌入颈卵器的过程经固定、染色、切片后所得的显微照片；

图3为金毛狗蕨人工授精后的多胚发育；

图4为分株复壮的金毛狗蕨人工苗；

图5为非操纵状态下的笔筒树精子群；

图6为笔筒树活泼的精子；

图7为笔筒树精子同步向右游动；

图8为笔筒树精子依次向上游动；

图9中华水韭人工苗；

图10人工繁殖的中华水韭。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1、金毛狗蕨的人工授精方法。

本实施例以金毛狗蕨(cibotiumbarometz(l.)j.sm.)为例，描述真蕨类植物精子的提取与人工授精的方法。

1.孢子的培养：将孢子接种至培养基中，经避光保存后，在光照强度1800-4000lux、光照时间12h/d的条件下培养至性器成熟，所述避光保存的条件为18-25℃下避光保存24h；具体方法如下：

(1)培养基的选择

将暗棕壤装入灭菌袋内，130℃高压蒸汽灭菌40min。后置于室温下放凉、待用。

(2)孢子的培养

雄配子体的获得：取半径为25cmx15cm的培养盘，将其底部平铺一块5mm海绵，用蒸馏水将海绵润湿。海绵上平铺1cm厚的暗棕壤，抚平，压实。在海绵的底部缓慢、多次注入蒸馏水，使水浸透整个土壤层，盖上玻璃板保湿。

将孢子均匀的铺撒在洁净的a4纸上，用手轻弹，使孢子均匀的散落到培养盘中，接种密度为60个/cm²。接种后将培养盘放在培养架上，先置于23℃黑暗环境下24h，然后放置于23℃，光照强度3000lux、光照时间12h/d的环境下培养，适时补充水分使培养盘内的空气相对湿度保持在65％-85％之间。50d后，每2d在体视显微镜下观察配子体上是否有精子器出现。待精子器大量成熟，即进行取精。

雌配子体的获得：将灭菌后的暗棕壤倒入直径6cm培养皿中，厚度约为培养皿的1/3，抚平，压实。接种密度为6个/cm²。接种后将培养皿放入瓷盘中，以玻璃覆盖，盘的内底部铺有适量脱脂棉，培养过程中始终保持脱脂棉湿润，以保证孢子萌发所需空气湿度，培养至颈卵器顶端四个盖细胞刚刚开裂即发育成熟。

2.精子的提取:选取成熟的雄配子体，在显微镜下观察精子释放情况；当观察到精子大量释放时,将精子吸出，置于与精子同等体积的清水中，获得精子悬浊液；具体方法为：

(1)取精工具的制作

取一根长15-20cm、直径0.5-1cm的玻璃管，手持玻璃管两端，用酒精喷灯外焰烘烤玻璃管中段，烘烤的同时拉伸玻璃管，使玻璃管中段随着拉伸而变细，待最细处孔径约1mm时停止拉伸，然后换用酒精灯烘烤，用尖镊子继续拉伸直至内孔径2um，用解剖镜观察并用测微尺测量选择4μm孔径处折断，制成两根微细管。

(2)精子的提取

在体视显微镜下选取精子器成熟且密集的金毛狗蕨雄配子体，置于装有水的培养皿中，快速的用解剖针将金毛狗蕨雄配子体上附着的杂质清洗干净。将洗净的金毛狗蕨雄配子体挑起，放置于带有凹槽的载玻片上，在凹槽中滴入蒸馏水浸没配子体，在体视显微镜下观察，当观察到精子大量释放时，将微细管轻轻地放在精子密集区，大量精子会自动虹吸到微细管里，然后将其滴到同等体积的蒸馏水中，待3s后吸出，这样用蒸馏水清洗两次，即可获得大量的活泼的金毛狗蕨精子(见图1)。

3.人工授精:选取发育成熟的雌配子体，将其放置在相对湿度为30％-40％的环境条件下静置6-12h，然后在体视镜下观察培养皿中雌配子体上成熟颈卵器的位置，观察到颈卵器周围无水膜时，滴加诱导液与精子悬浊液，待精子游入雌配子体的颈卵器内部，人工授精完成。具体方法为：

(1)诱导液的制作

取三精制药葡萄糖酸钙口服溶液稀释至2％的质量浓度；

(2)人工授精

选取具有较多发育成熟的颈卵器的金毛狗蕨雌配子体，先打开培养皿，将其放置在相对湿度为30％-40％的环境条件下静置6-12h，然后在体视镜下观察培养皿中金毛狗蕨雌配子体上成熟颈卵器的位置，观察到颈卵器周围无水膜时，以颈卵器面积为基准计，用微细管均匀滴加约0.05ml/cm²诱导液，同时滴加0.1ml精子悬浊液，盖上培养皿盖，送入颈卵器周围的精子会在诱导液的作用下自动游入颈卵器内部(见图2)，即可完成人工授精。

在一般情况下，野外的蕨类孢子形成配子体的几率不足万分之一，成熟配子体能够长成幼孢苗的几率不足百分之一，而且每个配子体通常只能形成一个胚。在人工培养条件下，繁殖率能达到10％，而用本发明的人工授精方法，不仅能使配子体的受精率达到30％-50％，是常规培养条件下的3-5倍，还出现单个配子体有两个胚胎发育的现象(见图3)，幼孢苗生长旺盛(见图4)。

实施例2.笔筒树的人工授精方法。

本实施例以笔筒树为例，描述真蕨类植物精子的提取与人工授精的方法。

1.孢子的培养：将孢子接种至培养基中，经避光保存后，在光照强度1800-4000lux、光照时间12h/d的条件下培养至性器成熟，所述避光保存的条件为18-25℃下避光保存24h；具体方法如下：

(1)培养基的选择

将暗棕壤装入灭菌袋内，130℃高压蒸汽灭菌40min。后置于室温下放凉、待用。

本实施例中培养雌配子体采用改良后的knop’s固体培养基培养，培养基的配方为0.2gmgso4·7h2o，0.2gkh2po4，0.2gkno3，0.8gca(no3)2·4h2o，15g琼脂和1000ml蒸馏水。将配置完成的培养基进行121℃灭菌，时间为25min，灭菌后，在培养液冷却前，将培养液倒入培养皿中，最后盖好培养皿盖冷却备用。

(2)孢子的培养

雄配子体的获得：取半径为25cmx15cm的培养盘，将其底部平铺一块5mm海绵，用蒸馏水将海绵润湿。海绵上平铺1cm厚的暗棕壤，抚平，压实。在海绵的底部缓慢、多次注入蒸馏水，使水浸透整个土壤层，盖上玻璃板保湿。

将孢子均匀的铺撒在洁净的a4纸上，用手轻弹，使孢子均匀的散落到培养盘中，接种密度为60个/cm²。接种后将培养盘放在培养架上，先置于25℃黑暗环境下12h，然后放置于25℃，光照强度4000lux、光照时间12h/d的环境下培养，适时补充水分使培养盘内的空气相对湿度保持在65％-85％之间。50d后，每2d在体视显微镜下观察配子体上是否有精子器出现。待精子器大量成熟，即进行取精(见图5)。

雌配子体的获得：将配制好的knop’s培养基和直径6cm的培养皿于120℃×25min条件下灭菌，灭菌后将培养基倒入培养皿中，厚度约为培养皿的1/3，置于室温下放凉、待用。接种密度为6个/cm²。接种后将培养皿放入瓷盘中，以玻璃覆盖，盘的内底部铺有适量脱脂棉，培养过程中始终保持脱脂棉湿润，以保证孢子萌发所需空气湿度，培养至颈卵器顶端四个盖细胞刚刚开裂即发育成熟。

2.精子的提取:选取成熟的雄配子体，在显微镜下观察精子释放情况；当观察到精子大量释放时,将精子吸出，置于与精子同等体积的清水中，获得精子悬浊液；具体方法为：

(1)取精工具的制作

取一根长15-20cm、直径0.5-1cm的玻璃管，手持玻璃管两端，用酒精喷灯外焰烘烤玻璃管中段，烘烤的同时拉伸玻璃管，使玻璃管中段随着拉伸而变细，待最细处孔径约1mm时停止拉伸(也可直接购买细管使用)，然后换用酒精灯烘烤，用尖镊子继续拉伸直至内孔径2um，用解剖镜观察并用测微尺测量选择4μm孔径处折断，制成两根微细管。

(2)精子的提取

在体视显微镜下选取精子器成熟且密集的笔筒树雄配子体，置于装有水的培养皿中，快速的用解剖针将金毛狗蕨雄配子体上附着的杂质清洗干净。将洗净的金毛狗蕨雄配子体挑起，放置于带有凹槽的载玻片上，在凹槽中滴入蒸馏水浸没配子体，在体视显微镜下观察，当观察到精子大量释放时，将微细管轻轻地放在精子密集区，大量精子会自动虹吸到微细管里，然后将其滴到同等体积的蒸馏水中，待5s后吸出，这样用蒸馏水清洗两次，即可获得大量的活泼的笔筒树精子(见图6)。

3.人工授精:选取发育成熟的雌配子体，将其放置在相对湿度为30％-40％的环境条件下静置6-12h，然后在体视镜下观察培养皿中雌配子体上成熟颈卵器的位置，观察到颈卵器周围无水膜时，滴加诱导液与精子悬浊液，待精子游入雌配子体的颈卵器内部，人工授精完成。具体方法为：

(1)诱导液的制作

取三精制药葡萄糖酸钙口服溶液稀释至2％的质量浓度；

(2)人工授精

选取具有较多发育成熟的颈卵器的金毛狗蕨雌配子体，先打开培养皿，将其放置在相对湿度为40％的环境条件下静置12h，然后在体视镜下观察培养皿中金毛狗蕨雌配子体上成熟颈卵器的位置，观察到颈卵器周围无水膜时，以颈卵器面积为基准计，用微细管均匀滴加约0.05ml/cm²诱导液，同时滴加0.1ml精子悬浊液，盖上培养皿盖，送入颈卵器周围的精子会在诱导液的作用下自动游入颈卵器内部(见图7、图8)，即可完成人工授精。

实施例3.中华水韭的人工授精的方法。

本实施例以中华水韭为例，描述真蕨类植物精子的提取与人工授精的方法。

孢子的培养：将大小孢子接种至各自培养基中，经避光保存后，在光照强度1800-4000lux、光照时间12h/d的条件下培养至性器成熟，所述避光保存的条件为18-25℃下避光保存24h；具体方法如下：

(1)培养基的选择

将腐殖土装入灭菌袋内，130℃高压蒸汽灭菌40min。后置于室温下放凉、待用。

(2)孢子的培养

雄配子体的获得：取半径为25cmx15cm的培养盘，将其底部平铺一块5mm海绵，用蒸馏水将海绵润湿。海绵上平铺1cm厚的腐殖土，抚平，压实。在海绵的底部缓慢、多次注入蒸馏水，使水浸透整个土壤层，盖上玻璃板保湿。

将小孢子均匀的铺撒在洁净的a4纸上，用手轻弹，使小孢子均匀的散落到培养盘中，接种密度为60个/cm²。接种后将培养盘放在培养架上，先置于20℃黑暗环境下48h，然后放置于20℃，光照强度1800lux、光照时间12h/d的环境下培养，适时补充水分使培养盘内的空气相对湿度保持在65％-85％之间。50d后，每2d在体视显微镜下观察配子体上是否有精子器出现。待精子器大量成熟，即进行取精。

雌配子体的获得：将灭菌后的腐殖土倒入直径6cm培养皿中，厚度约为培养皿的1/3，抚平，压实。大孢子接种密度为6个/cm²。接种后将培养皿放入瓷盘中，以玻璃覆盖，盘的内底部铺有适量脱脂棉，培养过程中始终保持脱脂棉湿润，以保证孢子萌发所需空气湿度，培养至颈卵器顶端四个盖细胞刚刚开裂即发育成熟。

2.精子的提取:选取成熟的雄配子体，在显微镜下观察精子释放情况；当观察到精子大量释放时,将精子吸出，置于与精子同等体积的清水中，获得精子悬浊液；具体方法为：

(1)取精工具的制作

取一根长15-20cm、直径0.5-1cm的玻璃管，手持玻璃管两端，用酒精喷灯外焰烘烤玻璃管中段，烘烤的同时拉伸玻璃管，使玻璃管中段随着拉伸而变细，待最细处孔径约1mm时停止拉伸(也可直接购买细管使用)，然后换用酒精灯烘烤，用尖镊子继续拉伸直至内孔径2um，用解剖镜观察并用测微尺测量选择4μm孔径处折断，制成两根微细管。

(2)精子的提取

在体视显微镜下选取精子器成熟且密集的金毛狗蕨雄配子体，置于装有水的培养皿中，快速的用解剖针将金毛狗蕨雄配子体上附着的杂质清洗干净。将洗净的金毛狗蕨雄配子体挑起，放置于带有凹槽的载玻片上，在凹槽中滴入蒸馏水浸没配子体，在体视显微镜下观察，当观察到精子大量释放时，将微细管轻轻地放在精子密集区，大量精子会自动虹吸到微细管里，然后将其滴到同等体积的蒸馏水中，待5s后吸出，这样用蒸馏水清洗两次，即可获得大量的活泼的金毛狗蕨精子。

3.人工授精:选取发育成熟的雌配子体，将其放置在相对湿度为30％-40％的环境条件下静置6-12h，然后在体视镜下观察培养皿中雌配子体上成熟颈卵器的位置，观察到颈卵器周围无水膜时，滴加诱导液与精子悬浊液，待精子游入雌配子体的颈卵器内部，人工授精完成。具体方法为：

(1)诱导液的制作

取三精制药葡萄糖酸钙口服溶液稀释至2％的质量浓度；

(2)人工授精

选取具有较多发育成熟的颈卵器的金毛狗蕨雌配子体，先打开培养皿，将其放置在相对湿度为35％的环境条件下静置8h，然后在体视镜下观察培养皿中金毛狗蕨雌配子体上成熟颈卵器的位置，观察到颈卵器周围无水膜时，以颈卵器面积为基准计，用微细管均匀滴加约0.05ml/cm²诱导液，同时滴加0.1ml精子悬浊液，盖上培养皿盖，送入颈卵器周围的精子会在诱导液的作用下自动游入颈卵器内部，即可完成人工授精。中华水韭幼孢苗长势良好并且大量繁殖成功(见图9与图10)。

以上实施例中涉及的真蕨类植物均是配子体产量相对较高的种类，对于配子体产量不高的种类，也可添加激素(如成精子囊素、赤霉素、脱落酸或乙烯)，或营养液(如糖类物质、钙离子和甲硫氨酸)，也可以再适当提高光照强度，对于激素或营养液添加的具体剂量，根据蕨类植物品种不同可适当调整。对培养基质要求较严格的蕨类物种，可以利用该物种原生境的土壤作为培养基质，并利用不同浓度磷酸缓冲液调节土壤ph值至合适范围。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。