奶牛早期妊娠的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法，通过联合检测奶牛外周血中两个干扰素刺激基因ISG15和RSAD2的表达量来进行妊娠诊断，可以在青年母牛人工授精后18d排查空怀牛和妊娠牛，使妊娠诊断的时间提前；可实现在青年母牛第一次配种后3周以内排查空怀牛，对其进行再次人工授精，从而缩短产犊至下一次妊娠的间隔，进而提高奶牛的繁殖率。本发明的试剂盒及其检测方法，操作简单，出结果快，检测结果准确，灵敏度高，有望成为今后奶牛业中早期妊娠诊断的主流技术。
【专利说明】奶牛早期妊娠的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和核酸检测【技术领域】，具体的说，本发明涉及一种基于荧 光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 妊娠诊断是奶牛生产管理中的重要环节，对奶牛实施早期妊娠诊断可以尽早发现 空怀牛并对其进行发情处理和再次人工授精，可缩短产犊间隔、减少空怀导致的经济损失。 根据国内外专家估计，空怀导致每头乳牛每日约减奶8-15千克；最低少生产牛犊0. 003头， 每头每日饲料、能源、人力等方面的消耗约20-30元。因此，探索科学、准确、简便、快捷的奶 牛早期妊娠诊断新技术显得尤为重要。
[0003] 在生产中常见最常用的妊娠诊断方法是直肠触诊，技术比较成熟的繁殖员在配 种后45-50d可做出准确诊断，经验丰富的繁殖员最早可以在人工授精后35d判断是否妊 娠；通过测定牛奶或者血液中的孕酮含量也可以判断奶牛是否受孕，该方法在人工授精 后21-24d进行检测；目前已经开始初步使用但是尚未广泛推广的牛妊娠相关蛋白（PAG) ELISA试剂盒能在妊娠后28d做出较为可靠的判断。由此可见，这些方法均只能在奶牛 人工授精三周后做出准确诊断。最新的研究报道证实利用PAGELISA试剂盒于人工授精 后28d排查出来的空怀牛，与同样条件下在妊娠46d时利用直肠检查的方法排查出来的 空怀牛相比，对其实施同期发情并再次配种后的妊娠率和空怀天数并没有提高（Sinedino LD，LimaFS,BisinottoRS，etal.Effectofearlyorlateresynchronization basedondifferentmethodsofpregnancydiagnosisonreproductiveperformance ofdairycows[J].Journalofdairyscience，2014, 97 (8): 4932-41) ?研究指出，如果 人工授精后一个情期内（三周）能排查出空怀牛，即可对其进行快速的同期发情处理，在 第21-23d进行复配，减少空怀天数，提高奶牛的繁殖效率（LucyMC，McDougallS，Nation DP.Theuseofhormonaltreatmentstoimprovethereproductiveperformanceof lactatingdairycowsinfeedlotorpasture-basedmanagementsystems[J].Animal reproductionScience, 2004, 82-83:495-512)。因此，从某种程度上来讲，能否于奶牛人工 授精后一个情期内判断奶牛妊娠或者空怀，是缩短奶牛产犊间隔和提高繁殖率的关键。
[0004] 综上，需要能够实现快速、有效且准确检测奶牛早期妊娠的产品，以尽早发现空怀 牛并对其进行发情处理和再次人工授精，缩短产犊间隔、减少空怀导致的经济损失。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确地检测奶牛早期妊娠的荧 光定量RT-PCR的方法，以较早时间判断出青年牛人工授精后是否妊娠。
[0006] 牛早期胚胎发育的过程中，在授精后14-18d即母体妊娠识别阶段，孕体合成并分 泌的干扰素-t(IFN-t)可作用于血液中白细胞，引起一系列干扰素刺激基因上调表达， 因此，通过定量PCR技术检测白细胞中这些干扰素刺激基因的表达水平可以进行妊娠诊 断。本发明通过荧光定量PCR技术检测奶牛人工授精后18d外周血白细胞中干扰素刺激基 因的表达水平来进行妊娠诊断，实现在奶牛人工授精后一个情期内判别妊娠牛和空怀牛。 为空怀牛的复配节约时间，从根本上提高奶牛的繁殖效率。
[0007] 该荧光定量RT-PCR检测方法包括如下步骤（步骤示意如图1):
[0008] (1)血液标本的收集
[0009]采集青年牛（14-16月龄的奶牛）发情后人工授精前0d和人工授精后18d的外周 血1. 5-2ml，抗凝，低温冷藏。
[0010] ⑵标本RNA的提取
[0011] 血液总RNA提取试剂盒提取标本中总RNA(标本采集后2h内完成），之后利用 NanoDrop2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度（0D26CI/28CI = 1. 9-2. 1)，同时采 用1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，于-80°C保存备用。
[0012] (3)逆转录反应
[0013] 逆转录采用试剂盒进行，每个反应RNA用量为500ng，根据RNA的浓度计算得出每 次反应所需的体积，按照试剂盒说明书进行。
[0014] (4)荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因在青年牛外周血中的相对表达量
[0015] 1)目的基因和内参基因引物的设计与合成
[0016] 牛ISG15基因和内参基因P-Actin引物参考文献报道（GiffordCA，Racicot K,ClarkDS,etal.RegulationofInterferon-StimulatedGenesinPeripheralBlood LeukocytesinPregnantandBred,NonpregnantDairyCows[J].Journalofdairy science, 2007, 90:274-280)，其中，所述的牛ISG15 基因的引物对是：SEQIDNO:1 和SEQ IDNO:2, 0 -Actin的引物对是：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,具体的引物信息如下：
[0017]ISG15-F:5 ; -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 ;
[0018]ISG15-R:5 ; -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 ;
[0019] @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 '
[0020] P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 '
[0021] 牛RSAD2基因引物对序列根据NCBI中提供的牛RSAD2基因序列（NM_001045941)， 利用软件Primer5.0设计。所用引物序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，具体的引 物对序列为：
[0022] RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 '
[0023]RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 '
[0024] 2)荧光定量PCR反应体系
[0025] 牛ISG15和RSAD2基因荧光定量PCR扩增体系均为：2xSYBR?Green10iil， 上下游引物各 〇? 5ill(10iimol/L)，cDNA模板 0? 3iil，ddH20 8. 7iil，体系共 20ill。
[0026] 3)荧光定量PCR反应条件
[0027] 15615基因反应条件：951：预变性6〇8,951：变性158,621：退火158 ;721：延伸 30s，共40个循环
[0028] 1?402基因反应条件：951：预变性6〇8,951：变性158,581：退火158 ;721：延伸 30s，共40个循环
[0029]0-Actin基因反应条件：95°C预变性 60s，95°C变性 15s，60-62°C退火 15s;72°C 延伸30s，共40个循环
[0030] (5)统计分析
[0031] 1)ISG15和RSAD2基因表达量的分析
[0032] 采用相对定量的方法检测目的基因的表达量：计算出检测标本中目的基因Ct均 值与内参基因Ct均值的差值（ACt)，以2_AAet表示样品中目的基因mRNA相对表达量，其 中AACt=ACt-(人工授精后0d检测样本目的基因的Ct均值-该样品内参基因的Ct 均值）。将奶牛人工授精后〇d各基因的相对表达量较正为1，人工授精后18d的表达量为 〇d时表达量的倍数。
[0033] 2)利用牛ISG15和RSAD2基因的表达量进行青年牛早期妊娠诊断
[0034] 人工授精后18d奶牛外周血中ISG15的表达量为XI，RSAD2的表达量为X2,将XI 和X2带入公式P=l/[l+e_(_653+2__+°_866X2)]中，如果P值大于0? 680时，即为妊娠。
[0035] 本发明的另一目的在于提供牛外周血中干扰素刺激基因表达水平的实时荧光定 量RT-PCR检测试剂盒，它含有牛干扰素刺激基因RSAD2和ISG15以及内参基因P-Actin 特异性引物对，其中：
[0036] (a)牛ISG15基因和内参基因@ -Actin弓丨物对信息如下：
[0037]ISG15-F:5 ' -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 '
[0038]ISG15-R:5 ' -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 '
[0039] @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 '
[0040]P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 '
[0041 ] (b)牛RSAD2基因引物对序列为：
[0042]RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 '
[0043]RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 '
[0044] 所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统一标准为：
[0045]
【权利要求】
1. 一种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测试剂盒，包含牛ISG15基因和内参 基因 P-Actin特异性引物对，其中，所述的牛ISG15基因的引物对是：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，@-Actin的引物对是：SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4,其特征在于还包含牛RSAD2 基因特异性引物对，所用引物序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示。
2. 如权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统 一标准为： ISG15-F lOumol/L 0. 5 u L ISG15-R lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-F lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-R lOumol/L 0. 5 u L ^-Actin-F lOumol/L 0. 5 u L 3-Actin-R IOu mol/L 0.5 u L。
3. -种基于荧光定量PCR技术的奶牛早期妊娠检测方法，包括如下步骤： (1) 血液标本的收集 采集奶牛发情后人工授精前Od和人工授精后18d的外周血I. 5-2ml，抗凝，低温冷藏； (2) 标本RNA的提取 标本采集后2h内用血液总RNA提取试剂盒完成标本中总RNA提取，之后利用NanoDrop 2000超微量分光光度计分析RNA样本浓度与纯度，0D26(I/28(I = 1. 9-2. 1，同时采用1. 2%琼脂 糖凝胶电泳检测RNA完整性，通过质检的样本分装后，于-80°C保存备用； (3) 逆转录反应 逆转录采用试剂盒进行，每个反应RNA用量为500ng，根据RNA的浓度计算得出每次反 应所需的体积，按照试剂盒说明书进行； (4) 荧光定量PCR检测ISG15和RSAD2基因在奶牛外周血中的相对表达量 1) 目的基因和内参基因引物的设计与合成 牛ISG15基因的引物对信息如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列；内参基因 3-Actin的引物对信息如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的序列；牛RSAD2基因引物对 序列如 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ; 2) 荧光定量PCR反应体系 牛15615、1?402基因和内参基因3 4(^111荧光定量？〇?扩增体系均为：2><8丫]311? Green 10 iil，上下游引物各 0.5 ill (IOii mol/L)，cDNA 模板 0.3 iil，CldH2O 8.7 iil，体系共 20u I ； 3) 荧光定量PCR反应条件 ISG15基因反应条件：95°C预变性60s，95°C变性15s，62°C退火15s ;72°C延伸30s，共 40个循环； RSAD2基因反应条件：95°C预变性60s，95°C变性15s，58°C退火15s ;72°C延伸30s，共 40个循环； 3-八(^丨11基因反应条件：951：预变性6〇8,951：变性158,6〇-621：退火158;721：延伸 30s，共40个循环； (5)统计分析 1. ISG15和RSAD2基因表达量的分析 采用相对定量的方法检测目的基因的表达量：计算出检测标本中目的基因与内参基因 的阈值差（A Ct)，以2_AAct表示样品中目的基因 mRNA相对表达量，将奶牛人工授精后Od 各基因的相对表达量较正为1，人工授精后18d的表达量为Od时表达量的倍数； 2) 利用牛ISG15和RSAD2基因的表达量进行奶牛早期妊娠诊断 人工授精后18d奶牛外周血中ISG15的表达量为X1，RSAD2的表达量为X2,将Xl和X2 带入公式P = l/[l+e_(_6 53+2__+°_866X2)]中，如果P值大于0.680时，即为妊娠。
【文档编号】C12Q1/68GK104328202SQ201410657206
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】程蕾, 向敏, 王定发, 刘晓华, 胡修忠, 夏瑜, 凌明湖 申请人:武汉市畜牧兽医科学研究所