辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；其通过检测与阿尔茨海默病相关的G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于阿尔茨海默病的早期发现和及时治疗。
【专利说明】辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及阿尔茨海默病的辅助诊断【技术领域】，特别涉及一种辅助诊断阿尔茨海 默病的检测试剂盒及其检测方法，尤其指一种能用于检测与阿尔茨海默病相关的G蛋白偶 联受体50基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimerdisease,AD)是一种系统性神经退行性疾病，其临床 表现为高级认知功能低下，主要特征包括脑细胞内神经纤维缠结及细胞外老年斑。阿尔茨 海默病患者需要终生护理，因此给社会和家庭带来极大的经济负担。阿尔茨海默病是一种 由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找阿尔茨海默病相关基因进而阐 明痴呆症发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视 并开展阿尔茨海默病的病因研究，且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与阿尔 茨海默病的关联性上，但其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了阿尔茨海默病预 防及治疗水平的提高。
[0003] G蛋白偶联受体50(Gprotein-coupledreceptor50)是G蛋白偶联受体家族的 成员，GPR50和双相情感障碍，重度抑郁症及精神分裂症存在关系。G蛋白偶联受体50是由 位于X染色体的G蛋白偶联受体50基因（Gprotein-coupledreceptor50gene，GPR50) (ChromosomeX: 151176584. ? 151181465)编码而成的。国内外已有大量研究报道了GPR50 基因表达与阿尔茨海默病发病的关系。
[0004] 目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与阿尔茨海默病相关的G蛋白偶联受 体基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、针对性强、检 测准确率高的辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒；通过对样品DNA甲基化水平测定辅助 诊断阿尔茨海默病，检测方法简单、检测效率高。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对G蛋白偶联受体基 因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对G蛋白偶联 受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下 游引物： 所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' _GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG-3' ； 所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
[0007] 辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：包括以下步骤： 步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度； 步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶，并加入一对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增； 步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45yl含有0. 3yM甲基化特 异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个微量离心管中，在 琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下 混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真 空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿 起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵； 将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水 清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C2分钟，再冷却到室 温； 步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用PyromarkGoldQ24试剂盒对步骤四中 的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMarkCpG软件对结果进行甲基化分析。
[0008] 上述的步骤一中采用Lab-Aid820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通 过Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。
[0009] 上述的步骤二中采用EZDNA甲基化试剂盒。
[0010] 上述的步骤三中PCR扩增条件为：首先95°ClOmin的变性；接着95°C30s，Tm 40s，72°C50s，共35个循环的退火反应；然后延伸反应72°C7min。
[0011] 上述的步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMarkQ24焦磷酸测序。
[0012] 本发明辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其检测方法，所述的检测试剂盒包 含一对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引 物，所述的一对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上 游引物和甲基化特异性下游引物；其优点在于：通过检测与阿尔茨海默病相关的G蛋白偶 联受体基因启动子区甲基化程度辅助诊断阿尔茨海默病，简单、方便，检测效率高，针对性 强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于阿尔茨海默病的早期发现和及时治 疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为被检测序列所在区域以及7个CpG位点的相关性示意图； 图2为DNA甲基化水平检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0014] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0015] 辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对G蛋白偶联受 体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一对G蛋白 偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异 性下游引物： 所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' _ GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG -3' ； 所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' - Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列： 5' - GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
[0016] 辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：包括以下步骤： 步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度； 步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶，并加入一对 G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增； 步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45 yl含有0. 3 y M甲基化特 异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个微量离心管中，在 琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下 混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真 空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿 起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵； 将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水 清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再冷却到室 温； 步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用PyromarkGoldQ24试剂盒对步骤四中 的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMarkCpG软件对结果进行甲基化分析。
[0017] 实施例中，步骤一中采用Lab-Aid820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再 通过Nan〇Dr〇p2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。
[0018] 实施例中，步骤二中采用EZDNA甲基化试剂盒。
[0019] 实施例中，步骤三中PCR扩增条件为：首先95°ClOmin的变性；接着95°C30s，Tm 40s，72°C50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72°C7min。
[0020] 实施例中，步骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMarkQ24焦磷酸测序。
[0021] G蛋白偶联受体基因启动子区域的甲基化水平不一致导致阿尔茨海默病基因的低 表达，从而影响阿尔茨海默病的发生和发展。因此，G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化水 平与阿尔茨海默病的患病率在男性中呈负相关，以检测阿尔茨海默病基因启动子区甲基化 水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对阿尔茨海默病的检测，检测 效率高，针对性强。
[0022] 下面通过实验证明G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的 患病率在男性中呈负相关。
[0023] 1、研究对象的收集 从宁波市某三甲医院收集阿尔茨海默病患者，痴呆诊断标准依据世界卫生组织的国际 疾病分类第10版（ICD-10)，阿尔茨海默病（AD)诊断标准采用NINCDS-ADRDA标准。排除血 管性痴呆，路易体痴呆等疾病后，最后确定阿尔茨海默病人61例作为病例组（79. 78±7. 87 岁），同时收集年龄匹配且无痴呆家族史的63名正常者作为对照组（80. 94±8. 88岁）。对 所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测载脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指标，同 时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80°C低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。
[0024] 2、基因组DNA的提取 应用Lab-Aid820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到 的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，ThermoFisher Scientific)检测所得DNA的浓度，以供BDNF基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
[0025] 3、DNA甲基化水平测定 本实验采用焦磷酸测序技术对基因启动子区的7个CpG位点（如图1)进行了 DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链 反应（PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变 成了尿嘧啶（U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次 研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引 物如下： (1) 甲基化特异性上游引物（Forwardprimer) 5' _GGGGATTTAGAGAGGTTGTAAAG-3'， (2) 甲基化特异性下游引物（Reverseprimer) 5' - Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3'， (3) 甲基化特异性测序引物（Sequencingprimer) 5' - GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
[0026] DNA甲基化水平测定的具体步骤： 第一步：采用 EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold(EZ DNA Methylation-Gold? Kit; ZYM0 RESEARCH)对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。
[0027] 第二步：取第一步中转化过的DNA样本20ng加入到ZymoTaq?PreMix酶（Zymo Taq?PreMix，ZYM0RESEARCH)，并加入上述一对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异 性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95°C10min的变性；接着95°C30s，Tm40s， 72°C50s，共35个循环的退火反应；然后延伸反应72°C7min。（注：Tm在实验中根据跑 PCR梯度温度确定） 第三步：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45yl含有0. 3yM上述甲基 化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMarkAnnealingBuffer;Qiagen);将需要使用的 混匀的琼脂糖珠总量（每样本3yl)转移到一个微量离心管中；在琼脂糖珠中加入结合缓 冲液（PyroMarkBindingBuffer;Qiagen)，使得平均每个样品约有50ii1的体积，将混合 物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50ill反应体积）中，每样本50ill;将PCR产物在常 温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入 180ml的高纯水、70%乙醇、洗漆缓冲液（PyroMarkWashBuffer;Qiagen;)和 120ml的变 性缓冲液（PyroMarkDenaturationSolution;Qiagen);打开真空预备工作站的泵，将真 空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMarkVacuumPr印Filter Probes;Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此 操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具 放入70%乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5 - 10秒；关 掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后 加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。
[0028] 第四步：焦磷酸测序：在PyroMarkQ24焦磷酸测序仪上，采用PyromarkGoldQ24 试剂盒（PyromarkGoldQ24Reagents;Qiagen)对第三步中的PSQ96板中的样本进行测 序，然后应用PyroMarkCpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图 2)。图2中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图2所示CpGl到CpG4的甲基化 程度分别为 39%，36%，50%，48%，37%，33%，35%。
[0029] 4、数据分析 本次实验采用SPSS16. 0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的7个CpG位点间存 在显著关联（相关系数r> 0.691，p〈 0.001，有统计学意义，见图1)(注：p〈 0.05时表 示有统计学意义，下同），所以我们把CpGl-CpG7求平均值后参与到后续的分析中，在病例 组和对照组之间的DNA甲基化水平不存在显著差异（p= 0. 893,见表1)。我们分性别比较 了病例组和对照组间阿尔茨海默病基因启动子区甲基化水平的差异，结果（见表2)发现 在男性中与阿尔茨海默病存在关联（P= 0.002)，结果(见表3)还表示性别对是该基因甲基 化水平具有显著影响。
[0030] 图1为被检测序列所在区域：具体位置为ChrX: 150346251. . 150346464 ;以及分 性别所检测的7个CpG点之间的关联性分析结果(例如男性中CpGl与CpG2的相关系数为 0. 960,CpG2与CpG3的相关系数为0. 954)。
[0031] 表1病例组与对照组间的比较（n=l14)
【权利要求】
1. 辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒包含一对G蛋 白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，所述的一 对G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲 基化特异性下游引物： 所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列： 5' -GGGGAITTAGAGAGGITGTAAAG -3' ； 所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列： 5' -Biotin-CCAACCTATAAACCCAACTAACTACTCTAC-3' ； 所述的甲基化特异性测序引物包括以下核苷酸序列： 5' - GGGATTTTTTTAGTTGTTAGTTAT-3'。
2. 根据权利要求1所述的辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：其特征 是：包括以下步骤： 步骤一：提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度； 步骤二：采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化； 步骤三：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo Taq? PreMix酶，并加入一对 G蛋白偶联受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增； 步骤四：焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45 yl含有0. 3 y M甲基化特 异性测序引物的退火缓冲液，将需要使用的混匀的琼脂糖珠转移到一个微量离心管中，在 琼脂糖珠中加入结合缓冲液混匀；将以上混合液加入PCR扩增产物中，将PCR产物在常温下 混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml 的高纯水、70%乙醇、洗涤缓冲液和120ml的变性缓冲液；打开真空预备工作站的泵，将真 空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具移到PCR板中，抓取琼脂糖珠；拿 起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70% 乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5至10秒；关掉泵； 将真空准备工具放入含有甲基化特异性测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠；使用高纯水 清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2分钟，再冷却到室 温； 步骤五：焦磷酸测序：在焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒对步骤四中 的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。
3. 根据权利要求2所述的辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步 骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超 微量分光光度计检测DNA的浓度。
4. 根据权利要求2所述的辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步 骤二中采用EZ DNA甲基化试剂盒。
5. 根据权利要求2所述的辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步 骤三中PCR扩增条件为：首先95°C lOmin的变性；接着95°C 30s，Tm 40s，72°C 50s，共35 个循环的退火反应；然后延伸反应72°C 7min。
6. 根据权利要求2所述的辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的检测方法：所述的步 骤五中焦磷酸测序仪采用PyroMark Q24焦磷酸测序。
【文档编号】C12Q1/68GK104328200SQ201410657145
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】段世伟, 季慧慧, 王钦文, 刘桂利 申请人:宁波大学