本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种木芙蓉花药愈伤组织再生植株的方法。
背景技术：
木芙蓉（hibiscusmutabilisl.）俗称芙蓉花，拒霜花、木莲、地芙蓉、华木，原产于我国，在东亚及东南亚地区均有分布。木芙蓉是我国的传统名花，它花色艳丽，树形优美，花期较长，色彩丰富，有红、粉、白、黄等色，花色还会随时间发生变化，有朝夕三变色的“三醉芙蓉”，也有隔天变色的“弄色芙蓉”，因而具有极高的观赏价值。木芙蓉适合在温暖、湿润的环境中生长，耐水湿，不耐寒，对土壤要求不高，适应性强，可丛植墙边、路旁，也可成片栽植于坡地，还可以盆栽观赏，是一种很好的园林植物。此外，木芙蓉的根、叶、花均可入药，有清热解毒、消肿排脓、凉血止血等功效。对于一切疮痈肿毒、乳痈等症，初起外用，能消肿止痛；成品内服，有排脓之功。近年研究发现木芙蓉叶含有黄酮类化合物。黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、镇痛、降血压、降血脂等药理作用。木芙蓉还具有较强的固碳、释氧、降温的能力，能够提升城市的生态环境，改善城区的热岛效应。
单倍体是指具有配子染色体数的个体或组织，仅有一个染色体组所构成的个体称为单倍体，单倍体经过自然或人工加倍后即可得到双单倍体。单倍体、双单倍体材料在植物育种和遗传基础理论研究中都具有重要的意义。在自然界单倍体的出现频率极低，只有十万分之一，并没有得到广泛利用。但随着植物组织培养技术的发展，通过花药或小孢子培养、未授粉子房（胚珠）培养、远缘杂交等方法进行人工诱导可显著提高植物单倍体的产生频率，其中花药培养应用最为广泛。
花药培养是在无菌条件下对小孢子发育到一定阶段的花药进行离体培养，提供适宜的培养条件，诱导小孢子向孢子体途径发育，从而产生染色体减半的单倍体植株的一种技术。花药培养是植物改良、遗传学及生理生化研究的重要途径，其优点主要表现在以下几个方面：（1）由于从单倍体的染色体加倍可以获得纯合的二倍体和多倍体，在遗传上非常稳定，不发生性状分离，因此，花培育种能极早稳定分离后代，这样可以省去多代自交，快速地获得自交系，缩短育种年限，并且可以克服杂种性状的分离；（2）单倍体植物与诱变育种相结合，可以加速诱变育种的进程；（3）单倍体不存在显隐性问题，其基因型完全可以由表现型反映出来，花培加倍后的纯合二倍体植株，可排除杂合体中显性因子掩盖隐性因子造成的干扰，提高选择的准确性和可靠性，而且花培再生植株会表现丰富的多样性，如株高、生育期、育性及抗性等，这些性状相互交叉，组成了具有多种形态特征的花培株系，因此，花培育种既可充分利用植物的种质资源，又可获得性状的多样性。
花药离体培养诱导单倍体植株的发生途径包括器官发生途径和直接或间接的胚状体发生途径。器官发生途径是指在一定条件下，愈伤组织中的分生细胞分化形成芽，再逐渐形成根，最后形成完整植株的过程；胚状体发生途径是指愈伤组织细胞分化形成含胚芽、胚根、胚轴的胚状体结构，最后长成完整植株的过程。近四十年来不少研究者在花药培养技术上做了许多工作，并取得了很大进展。研究表明，花药培养受基因型、小孢子发育时期、母本植株的生长状况、培养基、预处理、培养时间、培养条件等综合因素的影响。
自花药培养研究至今，利用花药离体培养技术产生单倍体植株，已经被广泛应用到28科68属170多种植物上。利用植物组织培养技术，开展木芙蓉花药培养和单倍体育种研究，能够为优良种质资源获得和新品种的培育创建一条新的有效途径。但迄今未见木芙蓉花药培养及再生体系建立研究的报道。
技术实现要素：
本发明目的在于针对背景技术提出的问题，提供一种木芙蓉花药愈伤组织培养获得再生植株的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种木芙蓉花药愈伤组织再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）愈伤组织的分化培养：将木芙蓉花药诱导培养形成的2mm以上的愈伤组织转入分化培养基，置于光照条件下培养，培养至25d左右更换新分化培养基，继续培养25~35d可见萌动的不定芽或丛生小苗；
（2）成苗培养：将上述不定芽或丛生小苗切下，转接到成苗培养基上，置于光照条件下培养，20~30d后可形成完整再生植株；
（3）炼苗与移栽：待再生植株长成含4~5片叶、根系发达的健壮苗时，打开瓶盖添加少量无菌水，在培养室内炼苗3~4d，然后起苗出瓶，洗净根部培养基后移栽到装有灭菌基质的营养钵中，放入温室控制一定的温度和湿度，2~3周后将其移栽到大田，定期浇水、施肥处理。
所述步骤（1）中，分化培养基的组分及浓度为：kno31940-2150mg/l，nh4no31250-1450mg/l，nah2po4140-160mg/l，cacl2116-140mg/l，mgso4·7h2o380-410mg/l，mnso4·4h2o19.5-23.3mg/l，ki0.8-0.9mg/l，h3bo34.0-6.0mg/l，znso4·7h2o2.9-4.5mg/l，na2moo4·2h2o0.2-0.3mg/l，cuso4·5h2o0.02-0.03mg/l，cocl2·6h2o0.02-0.03mg/l，feso4·7h2o27.2-29.4mg/l，na2-edta36.7-38.1mg/l，肌醇75-105mg/l，烟酸0.6-1.0mg/l，叶酸0.3-0.5mg/l，维生素b17.0-9.0mg/l，维生素b60.8-1.2mg/l，赖氨酸2.0-3.0mg/l，腐殖酸钠3.0-5.0mg/l，异戊烯腺嘌呤1.8-2.2mg/l，6-ba1.8-2.2mg/l，naa0.1-0.3mg/l，甜菜碱3.5-4.5mg/l，谷氨酰胺190-220mg/l，γ-氨基丁酸4.0-6.0mmol/l，纳米二氧化钛35-45mg/l，胡萝卜汁60-100ml/l，蔗糖25-35g/l，琼脂6-8g/l，ph调节为5.6-6.0。
所述步骤（1）中，培养条件为：光照强度1000~2000lx，光照时间13~15h/d，昼温25±1℃/夜温22±1℃。
所述步骤（2）中，成苗培养基以1/2ms为基本培养基，添加6-ba1.0mg/l，naa0.1mg/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，活性炭2g/l，ph调节为5.6-6.0。
所述步骤（2）中，培养条件为：光照强度2000~3000lx，光照时间15~17h/d，温度25±1℃。
所述步骤（3）中，灭菌基质为蛭石与珍珠岩按3:1（v/v）混合。
所述步骤（3）中，温度控制在22~27℃，湿度控制在80~90%。
本发明具有以下有益效果：
本发明设计了一种木芙蓉花药愈伤组织的分化培养基，调整了大量元素和部分微量元素的浓度，生长调节剂采用异戊烯腺嘌呤、6-ba和naa的组合，添加叶酸、赖氨酸、腐殖酸钠、甜菜碱、谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、纳米二氧化钛、胡萝卜汁等附加成分，能够有效提高愈伤组织的绿苗分化率。
本发明初步建立了木芙蓉花药培养植株再生体系，再生植株中单倍体所占比例为9.40%，为进一步开展木芙蓉单倍体育种和相关理论研究提供了技术基础和实验材料，为木芙蓉新品种的选育奠定一定的物质研究基础。
具体实施方式
以下结合具体实施方式，对本发明进行详细说明。
实施例1
一种木芙蓉花药愈伤组织再生植株的方法，包括以下步骤：
（1）愈伤组织的分化培养：选用木芙蓉品种‘牡丹红’和‘醉芙蓉’的花药愈伤组织作为供试材料，将2mm以上的愈伤组织转入分化培养基：kno32045mg/l，nh4no31350mg/l，nah2po4150mg/l，cacl2128mg/l，mgso4·7h2o395mg/l，mnso4·4h2o21.4mg/l，ki0.85mg/l，h3bo35.0mg/l，znso4·7h2o3.7mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，feso4·7h2o28.3mg/l，na2-edta37.4mg/l，肌醇90mg/l，烟酸0.8mg/l，叶酸0.4mg/l，维生素b18.0mg/l，维生素b61.0mg/l，赖氨酸2.5mg/l，腐殖酸钠4.0mg/l，异戊烯腺嘌呤2.0mg/l，6-ba2.0mg/l，naa0.2mg/l，甜菜碱4.0mg/l，谷氨酰胺205mg/l，γ-氨基丁酸5.0mmol/l，纳米二氧化钛40mg/l，胡萝卜汁80ml/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，ph调节为5.8，置于光照强度1500lx，光照时间14h/d，昼温25℃/夜温22℃的条件下培养，培养至25d左右更换新分化培养基，继续培养25~35d可见萌动的不定芽或丛生小苗，统计绿苗分化率。绿苗分化率（%）=分化出绿苗的愈伤组织数/转入分化的愈伤组织总数×100%。
（2）成苗培养：将上述不定芽或丛生小苗切下，转接到成苗培养基（1/2ms为基本培养基，添加6-ba1.0mg/l，naa0.1mg/l，蔗糖30g/l，琼脂7g/l，活性炭2g/l，ph调节为5.8），置于光照强度2500lx，光照时间16h/d，温度25℃的条件下培养，20~30d后可形成完整再生植株。
（3）炼苗与移栽：待再生植株长成含4~5片叶、根系发达的健壮苗时，打开瓶盖添加少量无菌水，在培养室内炼苗3~4d，然后起苗出瓶，洗净根部培养基后移栽到装有灭菌基质的营养钵中，放入温室中，温度控制在22~27℃，湿度控制在80~90%，2~3周后将其移栽到大田，定期浇水、施肥处理。
实施例2腐殖酸钠对木芙蓉花药愈伤组织分化的影响
以‘牡丹红’和‘醉芙蓉’的花药愈伤组织作为供试材料，将其转入添加不同浓度腐殖酸钠的分化培养基进行培养，比较不同浓度腐殖酸钠对供试材料绿苗分化的影响。腐殖酸钠浓度设计为0、1.0、2.0、4.0、8.0mg/l共5个浓度，每个浓度3次重复。结果见下表1。
由表1可知，培养基中添加1.0~4.0mg/l腐殖酸钠时，随着腐殖酸钠浓度的提高，供试材料的绿苗分化率也提高，其中添加4.0mg/l腐殖酸钠时绿苗分化率最高，‘牡丹红’可以达到35.5%，较不添加腐殖酸钠的高20.5%，‘醉芙蓉’可以达到48.7%，较不添加腐殖酸钠的高29.4%；当腐殖酸钠浓度提高到8.0mg/l时，供试材料的绿苗分化率有明显降低。因此腐殖酸钠的最佳添加浓度为4.0mg/l。
实施例3纳米二氧化钛对木芙蓉花药愈伤组织分化的影响
以‘牡丹红’和‘醉芙蓉’的花药愈伤组织作为供试材料，将其转入添加不同浓度腐殖酸钠的分化培养基进行培养，比较不同浓度纳米二氧化钛对供试材料绿苗分化的影响。纳米二氧化钛浓度设计为0mg/l、20mg/l、40mg/l、60mg/l、80mg/l共5个浓度，每个浓度3次重复。结果见下表2。
由表2可知，培养基中添加20~80mg/l纳米二氧化钛时，供试材料的绿苗分化率均有明显提高，其中添加40mg/l纳米二氧化钛时绿苗分化率最高，‘牡丹红’可以达到34.0%，较不添加纳米二氧化钛的高25.4%，‘醉芙蓉’可以达到47.6%，较不添加纳米二氧化钛的高19.8%；当纳米二氧化钛浓度为60~80mg/l时，供试材料的绿苗分化率虽然较40mg/l时有所下降，但仍然显著高于不添加纳米二氧化钛的绿苗分化率。纳米二氧化钛对木芙蓉花药愈伤组织的分化有较好的促进作用，分化培养基中的最佳添加浓度为40mg/l。
实施例4γ-氨基丁酸对木芙蓉花药愈伤组织分化的影响
以‘牡丹红’和‘醉芙蓉’的花药愈伤组织作为供试材料，将其转入添加不同浓度γ-氨基丁酸的分化培养基进行培养，比较不同浓度γ-氨基丁酸对供试材料花药愈伤组织分化的影响。γ-氨基丁酸浓度设计为0、1.0、3.0、5.0、7.0mmol/l共5个浓度，每个浓度3次重复。结果见下表3。
由表3可知，培养基中添加1.0~7.0mmol/lγ-氨基丁酸时，供试材料的绿苗分化率均有提高，其中添加5.0mmol/lγ-氨基丁酸时绿苗分化率最高，‘牡丹红’可以达到35.8%，较不添加γ-氨基丁酸的高18.4%，‘醉芙蓉’可以达到47.2%，较不添加纳γ-氨基丁酸的高22.3%；其次为添加7.0mmol/lγ-氨基丁酸时，绿苗分化率也处于较高水平。可见分化培养基中添加较高浓度的γ-氨基丁酸更有利于提高愈伤组织的分化能力，并且γ-氨基丁酸的最佳添加浓度为5.0mmol/l。
实施例5再生植株倍性鉴定
以实施例1中经成苗培养获得的再生植株为供试材料，进行再生植株倍性鉴定。选取再生植株长约3~5cm的根尖，采用0.002%mol/l8-羟基喹啉处理根尖，用卡宝-品红染色液染色，压片法制片，并在显微镜下观察和拍照。
经根尖压片观察，结果表明再生植株中多数为正常倍性植株（2n=92），所占比例为76.23%，少数为减倍后的植株（n=46），即单倍体，所占比例为9.40%，其余为非整倍体。
上述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。