一种利用根瘤菌接种缓解阿特拉津对大豆药害作用的方法

本发明涉及农业微生物应用领域。

背景技术：

玉米和大豆轮作是我国东北地区应用广泛的可持续种植方式，可以有效保持土壤肥力。但在实际生产中，玉米的常年连作，除草剂过量施用导致阿特拉津在土壤中残留量越来越高，对下茬大豆伤害也越来越严重。大豆是一类对阿特拉津胁迫较为敏感的作物，豆科植物与根瘤形成的固氮系统对于地球的生态系统以及农业生产具有重大的意义。国外通过大面积接种根瘤菌充分发挥大豆的生物固氮功能，取得了明显的经济效益和生态效益。然而我国大豆生产中普遍施用氮肥，这不仅降低了肥料利用率也直接增加了生产成本。因此推广根瘤菌及优化根瘤菌投加方式在我国黑土区大豆生产上的应用具有广阔的前景。但目前尚缺少针对缓解黑土区残留阿特拉津对大豆药害的根瘤菌施加方法。

技术实现要素：

本发明要解决现有黑土区残留阿特拉津对大豆药害作用严重的技术问题，而提供一种利用根瘤菌接种缓解阿特拉津对大豆药害作用的方法。

一种利用根瘤菌接种缓解阿特拉津对大豆药害作用的方法，具体按以下步骤进行：

一、将根瘤菌菌株转接到yma平面培养基上活化，然后挑取单菌落接种在yma液体培养基中培养，获得根瘤菌菌液；

二、将大豆种子种植在阿特拉律污染的土壤中，当大豆幼苗长出第一对真叶后，向大豆幼苗的根部周围注入步骤一所述的根瘤菌菌液，继续培养，完成该方法。

进一步的，步骤一所述根瘤菌为菌种bradyrhizobiumjaponicumac20，购自上海保藏生物技术中心，保藏编号为shbccd11101。

本发明的有益效果是：

采用本发明方法施加根瘤菌后，明显缓解了阿特拉津对大豆生长产生的胁迫作用。污染土壤中的阿特拉津对大豆生长及结瘤情况产生显著的抑制作用，菌株ac20(1.2×10⁷cfu/ml～1.2×10⁹cfu/ml)添加后，阿特拉津的抑制作用明显缓解，且当添加量为1.2×10⁸～1.2×10⁹cfu/ml时，缓解效果最明显。此外，阿特拉津还能显著抑制大豆的结瘤数，具体表现在根瘤数量减少，干重下调等方面，大豆的豆血红蛋白含量从9.1mg/g降低到3.4mg/g；本发明添加根瘤菌ac20能有效缓解阿特拉津对上述指标的抑制作用，经验证豆血红蛋白含量增加了111.4％，同时根瘤菌接种可以有效增加阿特拉津胁迫下大豆植株光合色素含量以及氮素积累量，相应含量分别比未添加菌株的处理组增加87.23％和61.85％，缓解了由阿特拉津胁迫导致的大豆光损伤和养分缺失。

本发明用于缓解阿特拉津对大豆药害作用。

附图说明

图1为实施例大豆植株生长情况对比照片，1代表未污染土壤、未注入根瘤菌菌液，2代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、未注入根瘤菌菌液，3代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml；

图2为实施例根瘤菌接种对大豆株重(干重)的影响分析图，其中a代表未污染土壤、未注入根瘤菌菌液，b代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，c代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，d代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml，e代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、未注入根瘤菌菌液，f代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，g代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，h代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml；

图3为实施例根瘤菌接种对大豆根重(干重)的影响分析图，其中a代表未污染土壤、未注入根瘤菌菌液，b代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，c代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，d代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml，e代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、未注入根瘤菌菌液，f代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，g代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，h代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式一种利用根瘤菌接种缓解阿特拉津对大豆药害作用的方法，具体按以下步骤进行：

一、将根瘤菌菌株转接到yma平面培养基上活化，然后挑取单菌落接种在yma液体培养基中培养，获得根瘤菌菌液；

二、将大豆种子种植在阿特拉律污染的土壤中，当大豆幼苗长出第一对真叶后，向大豆幼苗的根部周围注入步骤一所述的根瘤菌菌液，继续培养，完成该方法。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述根瘤菌为菌种bradyrhizobiumjaponicumac20，购自上海保藏生物技术中心，保藏编号为shbccd11101。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一采用稀释或浓缩的方法，调节所述根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷～1.2×10⁹cfu/ml。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一所述根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二所述土壤中阿特拉律的浓度低于20mg/kg。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二所述大豆种子预先进行灭菌处理，再进行种植。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：大豆种子的灭菌处理具体为：将大豆种子放入在质量浓度为3％的次氯酸钠溶液中灭菌3min，然后用蒸馏水冲洗3次，确保表面无菌。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二每株大豆幼苗注入的根瘤菌菌液体积为1ml。其它与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤二根瘤菌菌液注入到幼苗根际土壤表面。其它与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤二注入根瘤菌菌液后，继续培养25天。其它与具体实施方式一至九之一相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例一：

本实施例一种利用根瘤菌接种缓解阿特拉津对大豆药害作用的方法，具体按以下步骤进行：

一、将根瘤菌菌株转接到yma平面培养基上进行活化，然后挑取单菌落接种在yma液体培养基中培养，获得根瘤菌菌液；

二、采用风干土壤与蛭石按质量比为3:1进行充分混合，然后加入阿特拉津充分混匀制备污染土壤，污染土壤中阿特拉津的初始浓度为20mg·kg^-1(干重)；将污染土壤装入底部有三个孔的花盆(长×宽×高＝10cm×10cm×8.5cm)中，每盆装200g污染土壤，用蒸馏水浇灌至田间持水量的60％，待用；

三、将大豆种子放入在质量浓度为3％的次氯酸钠(naclo)溶液中灭菌3min，然后用蒸馏水冲洗3次，确保表面无菌，灭菌后的大豆种子采用滤纸在温度为30℃的恒温培养箱中避光培养24h，将发芽的种子转接到装有污染土壤的花盆中，每个花盆转接9颗大豆种子；加入一定量的去离子水，然后放在光照培养室中进行培养，昼夜温度分别为(25士2℃)和(18士2℃)；当大豆幼苗长出第一对真叶后(10d左右)，向大豆幼苗的根部周围注入步骤一所述的根瘤菌菌液(od600＝0.6，1.2×10⁸cfu/ml)；每株大豆注入的根瘤菌菌液体积均为1ml，再继续培养25天，采样测定相关指标。

步骤一所述根瘤菌为菌种bradyrhizobiumjaponicumac20，购自上海保藏生物技术中心，保藏编号为shbccd11101。

步骤一所述根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml。

步骤二根瘤菌菌液注入到幼苗根际土壤表面。

实施例二：

本实施例与实施例一不同的是：向大豆幼苗的根部周围注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml。

实施例三：

本实施例与实施例一不同的是：向大豆幼苗的根部周围注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml。

图1为实施例大豆植株生长情况对比照片，1代表未污染土壤、未注入根瘤菌菌液，2代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、未注入根瘤菌菌液，3代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml。图2为实施例根瘤菌接种对大豆株重(干重)的影响分析图，其中a代表未污染土壤、未注入根瘤菌菌液，b代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，c代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，d代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml，e代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、未注入根瘤菌菌液，f代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，g代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，h代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml。

图3为实施例根瘤菌接种对大豆根重(干重)的影响分析图，其中a代表未污染土壤、未注入根瘤菌菌液，b代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，c代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，d代表未污染土壤、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml，e代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、未注入根瘤菌菌液，f代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁷cfu/ml，g代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁸cfu/ml，h代表污染土壤阿特拉津浓度为20mg·kg^-1、注入根瘤菌菌液中有效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml。

从以上图中，得出结论：阿特拉津(20mg/kg)显著抑制大豆植株的生长，菌株ac20(1.2×10⁷cfu/ml～1.2×10⁹cfu/ml)添加后，大豆的干生物量显著增加，有效缓解阿特拉津对大豆生长产生的胁迫作用；当效活菌数为1.2×10⁹cfu/ml时，植株干物质量达到峰值。

经验证污染土壤中的阿特拉津对大豆生长及结瘤情况产生显著的抑制作用，添加根瘤菌ac20(添加量1.2×10⁷cfu/ml～1.2×10⁹cfu/ml)后，阿特拉津的抑制作用明显减弱。此外，阿特拉津还能显著抑制大豆的结瘤数，具体表现在根瘤数量减少，干重下调等方面，大豆的豆血红蛋白含量从9.1mg/g降低到3.4mg/g；实施例添加根瘤菌ac20能有效缓解阿特拉津对上述指标的抑制作用，经验证豆血红蛋白含量增加了111.4％，同时根瘤菌接种可以有效增加阿特拉津胁迫下大豆植株光合色素含量以及氮素积累量，相应含量分别比未添加菌株的处理组增加87.23％和61.85％，缓解了由阿特拉津胁迫导致的大豆光损伤和养分缺失。