专利名称：剌激泡囊状丛枝状菌根真菌的方法和组合物的制作方法
本申请是申请号为90109691.1、申请日为1990年12月4日、发明名称为“剌激泡囊状丛枝状菌根真菌的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及利用类异黄酮来剌激泡囊状丛枝状菌根(VAM)真菌。具体地说，本发明涉及在VAM真菌存在下用类异黄酮来剌激植物材料生长的方法和组合物。
内囊霉科(接合菌纲)的一些真菌种属，在基本上所有类型的陆地栖息地中都与多种维管植物的根系形成内生性共生关系(Harley，J.L.和Smith，S.E.，《菌根共生》，Academic Press，London，483页，1983；Safir，G.R.，《VA菌根植物的生态生理学》，CRC Press，Boca Raton，224页，1987)。这些关系称为泡囊状丛枝状菌根(VAM)，已知这些关系发生在至少300,000个植物品种中，包括一些最重要的农作物，但十字花科植物和几个其它品种除外。正如人们所公知的，VAM真菌能够对植物的生长、营养及植物对非生物性和生物性逆境的耐性产生深刻的有益影响(Powell，G.L.和Bagyaraj，D.J.，《VA菌根》，CRC Press，Boca Raton，234页，1984；Safir，G.R.《VA菌根植物的生态生理学》，CRC Press，Boca Raton，224页，1987)。这些益处源于土壤养分吸收增加、豆科植物的根瘤形成作用和生物固氮作用增强、植物和水处于有利的相互关系、疾病严重程度减轻、植物生长促进物质的积聚增加、以及其它一些生理效应(Smith，S.E.和Gianinazzi-Pearson，V.，《植物生理学年评植物分子生物学》，39221-224，1988)。全世界的研究人员及商社都已认识到了把这些真菌大规模应用于农业和林业的巨大生物技术潜力(Jeffries，P.，《菌根在农业上的应用》，Crit.Rev.Biotechnol.5319-357，1987；Powell，C.L.和Bagyaraj，D.J.编《VA菌根》，CRC Press，Boca Raton，234页，1984；Safir，G.R.编《VA菌根植物的生态生理学》，CRC Press，Boca Raton，224页，1987)；Siqueira，J.O.和Franco，A.A.，Biotechnologia do solo.MEC/ABEAS，Brasilia，234页，1988)。使用这些真菌作为植物或土壤的接种物，将会减少使用化肥和杀虫剂、减少由非生物性逆境(金属毒性、干旱、不利温度)和生物性逆境(线虫和病原的侵袭)造成的作物损失，从而对农业和全球环境质量产生显著影响。此外，已证明这些真菌能改进荒地种植的存活率和早期生长，并能提高在贫瘠和受扰生境中的生产力或再生长能力。事实上，已知通过适当的VAM接种能使某些移植林和果树品种及咖啡籽苗的生长速度改善50-8000％。对园艺作物和栽培作物来说，所报导的由于VAM接种而提高的产量在5-290％的范围(Powell，C.L.和Bagyaraj，D.J.编《VA菌根》，CRC Press，Boca Raton，234页，1984；Siqueira，J.O.和Franco，A.A.，Biotechnologia do solo.MEC/ABEAS，Brasilia，235页，1988)。
考虑到发达国家对环境质量的关注、可望发生农业迅猛发展的热带土壤对肥料的高度需求、以及全球磷酸盐储量可能会在大约七十年内耗尽这一事实，VAM种菌将会有巨大的世界市场。
VAM真菌在大多数土壤中对植物生长的重要性，已为土壤化学家、农学家、园艺学家、生态学家、农民和苗圃工作者所接受和承认(Powell，C.L.和Bagyaraj，D.J.编《VA菌根》，CRC Press，Boca Raton，234页，1984；Safir，G.R.编《VA菌根植物的生态生理学》，CRC Press，Boca Raton，224页，1987)，但目前不能大量供应活泼且有效的接种物，这对它们的大规模应用来说是一个主要缺点。
VAM真菌被视为专性活体营养型，因为它们在纯净条件下的培养从未获得成功(Hepper，C.M.，《VAM体外孢子萌发和菌丝生长纯净培养的前景》，Proc.7th NACOM，Sylvia等编，University of Florida，Gainesville，172-174，1987；Mosse，B.《与泡囊状丛枝状内生真菌的“独立”生长有关的一些研究》，Can.J.Bot.662533-2540，1988；Siqueira等，Can.J.Microbiol.31965-972，1985)。由于缺少有效的VAM真菌，很难对基础生物学、生态学、宿主关系和接种物生产工艺进行深入研究。对VAM真菌的体外培养作了频繁的尝试，但得到不同的结果(Hepper，C.M.)《VAM的体外孢子萌发和菌丝生长纯净培养的前景》，Proc.7th NACOM，Sylvia等编，University of Florida，Gainesville，172-174页，1987；Siqueira等，Mycologia 74952-959，1982；Siqueira，J.O.等，Can.J.Microbiol.31965-972，1985)。欧洲专利申请0172085叙述了VAM真菌的纯净培养，但生长因子是非植物来源的，因而VAM真菌感染植物的能力有限。大多数种属的活孢子在接种在合适的培养基上时都易于萌发，但在没有生活根系存在时，萌发同步性和芽管生长速度受到若干固有的环境和营养因素的影响(Hepper，C.M.《VAM的体外孢子萌发和菌丝生长纯净培养的前景》，Proc.7th NACOM，Sylvia等编，University of Florida，Gainesville，172-174页，1987；Siqueira，J.O.等，Can.J.Microbiol.31965-972，1985)。在多数种属的孢子的萌发和菌丝生长虽然都没有具体的营养要求，但已证明加入某些因子是有益的，只是程度很有限(Siqueira，J.O.，Can.J.Microbiol.31965-972，1985)。只有在植物的生活根系存在下才能达到持续的菌丝生长和孢子生成(Bécard，G.和Fortin，J.A.，New Phytol.108211-218，1988；Mosse，B.，Can.J.Bot.662533-2540，1988)。日本专利63-87973(1988)(描述接种在马铃薯上的VAM真菌和各种生长加速剂)和美国专利4,294,037(Mosse等)叙述了VAM真菌在植物根系存在下的生长。
长期以来，根渗出液一直认为在VAM形成的起始及其程度中起重要作用(Harley，J.O.和Smith，S.E.《菌根共生》，Academic Press，London，483页，1983)。根系存在时即使不与菌丝物理接触也能剌激菌丝生长(Bécard，G.和Fortin，J.A.，New Phytol.108211-218，1988；Mosse，B.和Hepper，C.M.，Physiol.Plant Pathol.5215-223，1975；Mosse，B.，Can.J.Bot.662533-2540，1988)。但无论是根渗出液还是提取液，它们对体外孢子萌发或菌丝生长的影响都很不一致(Harley，J.L.和Smith，S.E.《菌根共生》，Academic Press，London，483页，1983；Siqueira，J.O.，Cultura axenica e monoxenica dos fungos micorizicos vesiculo-arbusculares，Proc.II Reuniao bras.Micorrizas，Sao Paulo，Sec.MeioAmbiente，44-70页，1987)。但最近的一项研究指出，根渗出液的质量而非数量，是VAM真菌体外生长的一个重要因素(Elias，K.S.和Safir，G.R.，Appl.Environ.Microbiol.531928-1933，1987)。作者指出，在缺磷三叶草植物的根渗出液中，存在一种暂时的VAM生长因子。
非VAM种属如芸苔属似乎不能被VAM真菌集群，因为它们在相容性宿主根系附近缺少可扩散的生长剌激剂(Glenn，M.G.等，NewPhytol.110217-225，1988)。这与VAM定殖的早期阶段必须发生化学信号传递的说法相一致(Elias，K.S.和Safir，G.R.，Appl.Environ.Microbiol.531928-1933，1987；Bécard，G.和Fortin，J.A.，New Phytol.108211-218，1988；Scannerini，S.，Smith，D.，Bonfante-Fasolo，P.inGianinazzi-Pearson，V.编《植物、动物和微生物共生中的细胞间信号》，Spring Verlag，Berlin，414页，1988)。
已知低分子量酚类化合物在多种植物-微生物体系中起重要作用。在植物-根瘤菌共生现象中，存在于根渗出液中的类黄酮以调控方式对细菌共生质粒上的nod基因起到诱导剂或阻遏剂的作用(Rolfe和Gresshoff，《植物生量学年评植物分子生物学》，39297-319，1988)。例如，藤黄菌素诱导苜蓿根瘤菌中nod ABC基因的表达，它可能以低浓度存在于苜蓿根围中，限制根瘤形成和固氮作用(Kapulnik，Y.等，Plant Physiol.841193-1196，1987)。类黄酮还可以诱导寄生植物中吸器的形成(Steffens，J.C.等，Ann.Bot.501-7，1982)；控制植物的微生物侵入(Bailey，J.A.编《植物-病原相互作用的生物学和分子生物学》，Spring Verlag，Berlin，415页，1986；Palacios，R.和Verma，D.P.S编《植物-微生物相互作用的分子遗传学》，APS，St.Paul.401页，1988；Templeton，M.D.和Lamb，D.J.，Plant，Cell Environ.，11395-401，1988；VanEtten，H.D.，Phytochemistry 15655-659，1976)；起天然植物生长素调节剂的作用(Jacobs，M.和Rubery，P.H.，Science 241346-349，1987)；而且已知类黄酮在对病原侵入作出反应时发生积聚(Templeton，M.D.和Lamb，C.J.，Plant，Cell Environ.，11395-401，1988)。其它低分子量酚类化合物能够诱导病原性土壤杆菌中细胞激动素生物合成和Vir基因的基因表达(Conn.E.E.编《植物生物技术中植物化学的机会》，PlenumPress，New York，210页，1988；Powell，G.K.等，Mol.Plant-MicrobeInteractions，1235-242，1988)；调控地衣的循环过程(Scannerini，S.等《植物、动物和微生物共生中的细胞间信号》，Spring Verlag Berlin，414页，1988)。它们还能起到植物间抑制性化合物的作用，并影响VAM的体外菌丝生长和根系集群(Wacker，T.L.等，J.Chem.Ecol.(待出版，1989))。
VAM真菌为专性活体营养型。它们可能在长期的与植物共同进化的过程中丧失了腐生生长的遗传能力(或者在所需要的基因组中有一部分受到了阻遏)(Siqueira，J.O.，Cultura axenica e monoxenica dosfungos micorizicos vesiculo-arbusculares，Proc.II Reuniao bras.Micorizas，Sao Paulo，Sec.Meio Ambiente，44-70页，1987)，从而使宿主植物能通过干扰真菌核DNA的复制而完全控制真菌的生活史，正如最近有人所提出的(Burggraaf，A.J.P.和Beringer，J.E.，New Phytol.11125-33，1989)。事实上，在孢子抑制后很容易触发萌发过程(Siqueira等，Can.J.Microbiol.31965-972，1985)，但至少有一个种在体外发育过程中未发现核DNA合成(Burggraaf A.J.P.和Beringer，J.E.，New Phytol.11125-33，1989)。此外据报道，在没有生活根系存在时，附着胞和丛枝状吸胞(吸器样结构)都不能形成。看来持续的菌丝生长和分化都处于宿主控制之下。对其它专性活体营养真菌观察到(Hoch，H.C.和Staples，R.C.，《植物病理学年评》，25231-247，1987)，可能需要植物信使或诱导动作为侵入菌早期生长、发育和分化的触发剂。
因此，本发明的一个目的是提供一种在培养液中或者在土壤或其它种植材料中生产植物感染性VAM真菌的方法。本发明的另一个目的是提供含有VAM真菌的新组合物。本发明的另一个目的是提供在VAM真菌存在下剌激植物生长或植物细胞生长的方法和组合物。本发明的另一个目的是提供一种通过剌激感染性VAM真菌而改进植物在土壤中的生产力的方法，所述土壤中含有植物毒性浓度的除草剂和其它杀虫剂。本发明的另一个目的是提供一种使用简单而经济的方法，它与廉价农用组合物配合使用。参阅以下说明和附图，上述目的和其它目的将会越来越明显。
图1给出了用类异黄酮三叶草A(7-羟4′-甲氧异黄酮，根提取液中的天然形式)、7-羟4′-甲氧异黄酮(合成的)、生原禅宁A处理三叶草，并与无效的类黄酮化合物比较的结果。图中表示7-羟4′-甲氧异黄酮、生原禅宁A和三叶草A使VAM真菌根系集群和三叶草生长大大增强。
图2给出了具有Glomus fasciculatum特征的VAM真菌在营养培养基上的生长情况，培养基分别为含有生原禅宁A、7-羟-4′-甲氧异黄酮的培养基和一个不含这两种化合物的对照培养基。和对照相比，加入7-羟-4′-甲氧异黄酮或生原禅宁A使真菌生长大大增强。
图3-6给出了天然的和合成的7-羟-4′-甲氧异黄酮在CD3OD和DMSO中的光谱数据。
图7给出了随生原禅宁A和7-羟-4′-甲氧异黄酮的浓度而变化的VAM真菌根系集群百分比。
图8显示了在存在有7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A的未灭菌大田土壤中生长的玉米，其叶片面积增加。大田土壤中含有对玉米有毒量的除草剂依吗喹(imazaquin)。
图9显示了在所加入的7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A存在下除草剂对玉米的损害减轻。损害水平是针对图8所述的玉米植株而言的。
图10显示了在7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A存在下，图8所述的玉米植株在4周龄时顶部干重增加。
本发明涉及一种在泡囊状丛枝状菌根真菌存在下剌激植物材料生长的方法，其改进之处包括在类导黄酮存在下使植物材料与真菌一起生长，所述类异黄酮最好具有下式
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基。
本发明还涉及用刺激植物生长的植物组合物，它包含一种最好具有下式的类异黄酮化合物
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基；一种含有作为添加剂的类异黄酮化合物的植物材料，所述化合物的数量在植物材料于VAM真菌存在下生长时能剌激该植物材料的生长。
本发明还涉及一种培养可用于剌激植物生长的泡囊状丛枝状菌根真菌(包括该真菌的孢子)的方法，该方法包括在一定量的最好具有下式的类异黄酮存在下培养泡囊状丛枝状菌根真菌，使所产生的真菌剌激植物的生长。
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基。
本发明还涉及一种真菌组合物，它包括在最好具有下式的类异黄酮存在下培养过的泡囊状丛枝状菌根真菌。
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基。
本发明还涉及剌激培养植物生长的方法，该方法包括在一种培养溶液中使植物或植物细胞生长，该溶液中含有泡囊状丛枝状菌根真菌和一种最好具有下式的类异黄酮
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基。
最后，本发明涉及具有下式的新化合物
其中R1、R2和R3选自含1-30个碳原子的烷氧基。
该类异黄酮上可以连有各种长链烷氧基。选择这些基团时不应干扰对VAM真菌的剌激作用。
本发明中最优选的类异黄酮化合物具有下式
其中R1、R2和R3如表1所示。
表 1
最优选的是生原禅宁A(2)和7-羟-4′-甲氧异黄酮(4)。
体外剌激真菌菌丝生长的类异黄酮化合物是从宿主根系中分离出来的，并化学鉴定为7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A。后来又合成了7-羟-4′-甲氧异黄酮。因此，在VAM真菌对浓度为5ppm的7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A作出反应时，发现了强生长剌激作用。用这些根系因子作为植物生长促进物质，其作用或者是增加自然土壤真菌种群的VAM形成，或者是剌激土壤中外菌丝体网的形成，而这又会提高植物从土壤中吸收养分和水的能力。
植物材料可以是生根植物或植物组织细胞、器官、种子或植物的其它部分，它们可以在培养液中与VAM真菌一起生长。优选的植物材料是玉米、大豆、高梁、芦笋、韭葱、洋葱、红豆杉属植物、咖啡、三叶草、柑桔、海燕麦(sea oats)、小麦、马铃薯和其它作物，特别是能被VAM真菌集群的具根植物。类异黄酮在土壤或种植混合物中的用量在约0.1至400ppm之间。种植混合物可以含有蛭石、聚苯乙烯珠、泥炭藓和其它填料，以及生长因子。在组织培养中，类异黄酮与植物材料和VAM真菌共存，其数量在约0.0001至400ppm之间。
类异黄酮可以在种植植物前或种植后施用于土壤或种植混合物。最好是在种植种子时施用类异黄酮。同时可以施用VAM真菌，VAM真菌也可能天然存在于土壤中。
类异黄酮可以施用于植物材料，例如种子或繁殖体。最好是利用与植物生长相容的粘合剂如甲基纤维素把类异黄酮涂在种子上。类异黄酮还可浸入种子中。最好是把VAM真菌和涂有类异黄酮的种子一同施用。VAM真菌也可以加类异黄酮进行培养。
优选的VAM真菌属于Glomus属，例如G.fasciculatum、G.intraradices和G.etunicatum。
这些VAM真菌在商业上特别重要。最好是在类异黄酮含量为约0.0001-400ppm的培养基中培养VAM真菌。培养基中含有碳源、氮源、矿物质源和维生素源，这是本领域专业人员所了解的。
可以借助分散剂把类异黄酮以每毫升约0.1-400微克的量加到液体农用载体中，分散剂能使类异黄酮保持溶液状态。优选的分散剂是低级链烷醇类，特别是甲醇，其中含有包括阴离子型和阳离子型表面活性剂在内的各种表面活性剂。可以用其它有机溶剂来形成类异黄酮的水乳液。类异黄酮可以制成含有分散剂和类异黄酮的固体混合物。可以把该组合物配入有助于把类异黄酮分散于土壤或种植材料中的固体载体中。类异黄酮的含量按固体载体重量计为约0.1-400ppm。
异黄酮可以配成可湿性粉剂、流动性浓缩制剂、乳油制剂、颗粒制剂等。
把以下成分一起研磨可制得可湿性粉剂约20％-45％(重量)的细分散载体，例如高岭土、膨润土、硅藻土、硅镁土等；45％-80％(重量)的活性化合物；2％-5％(重量)的分散剂，例如木素磺酸钠；2％-5％(重量)的非离子型表面活性剂，例如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇等。
将约40％(重量)的活性成分与以下成分混合可制得典型的流动性液体制剂约2％(重量)的胶凝剂，如膨润土；3％(重量)的分散剂，如木素磺酸钠；1％(重量)的聚乙二醇；54％(重量)的水。
典型的乳油制剂可如下制得将约5％-25％(重量)的活性成分溶于为65％-90％(重量)的N-甲基吡咯烷酮、异佛尔酮、丁基溶纤剂、乙酸甲酯等中，并在其中分散约5％-10％(重量)的非离子型表面活性剂，例如烷基苯氧基聚乙氧基醇。将此乳油分散于水中作为液体喷雾剂施用。
类异黄酮用于处理土壤时，可将化合物制成颗粒产品并以此形式施用。该颗粒产品可如下制备将活性化合物溶解于溶剂(如二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮等)中，然后把所制得的溶液喷在一种颗粒载体(如玉米棒屑、砂子、硅镁土、高岭土等)上。
所制得的颗粒产品一般含有约3％-20％(重量)的活性成分和约97％-80％(重量)的颗粒载体。
类异黄酮还可以与除草剂或杀虫剂混合而施用于植物，也可以在施用除草剂或杀虫剂之前或之后施用。在类黄酮存在下，VAM真菌起到“防护剂”的作用，避免除草剂或杀虫剂造成的损害。用本发明的方法特别可以避免由咪唑啉酮类除草剂(如依吗喹和imazethapyr)和pendimethalin造成的损害。在大田施用除草剂后的第二年，如果除草剂的残留量足以对大田中种植的作物造成损害，则在这里施用上述组合物效果最好。
具有下式的新化合物与羟基取代的已知类异黄酮相比，其水溶解度得到了提高。
其中R1、R2和R3选自含1-30个碳原子的烷氧基。这些新化合物的制备方法是，在碱或酸和有机溶剂(如二氯甲烷、丙酮等)存在下，使羟基类黄酮如表1中的(2)与烷基卤(烷基氯、烷基溴或烷基碘)反应，从而使羟基类黄酮烷基化。该混合物回流若干小时，最好是12-24小时。该反应基本上是酚类的常规烷基化反应。
表1中的类异黄酮除全烷氧基类异黄酮外都可以买到。后者已由表1中类异黄酮的烷基化反应制得。
实施例1类异黄酮最初是从三叶草根分离出来的，而后鉴定为7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A。利用表2所示的一般方案从三叶草根中分离类异黄酮。图3-6显示了天然的和合成的7-羟-4′-甲氧异黄酮的光谱数据。
表2冷冻干燥的三叶草根｜1.在室温下加甲醇搅拌｜2.过滤
甲醇提取液 残渣，弃去｜1.真空蒸发↓2.用硅胶进行固相层析提取，用甲醇/氯仿作溶剂。
甲醇/氯仿提取液｜1.真空蒸发↓2.用硅胶板进行薄层层析纯化，用氯仿/甲作溶剂。
纯化合物↓生物测定从薄层层析得到的两个活性化合物进行化学定性。经鉴定，高Rf化合物即三叶草A，与7-羟-4′-甲氧异黄酮相同。这由图3-6所示的1H-NMR、13C-NMR、长程COSY及与合成7-羟-4′-甲氧异黄酮的直接比较得到了证实。
用氯仿/甲醇洗脱低Rf化合物，得到浅棕色固体，H-NMR(CDCl3/DMSO)δ8.00(1H，s，H-2)，7.40(2H，d，J＝8Hz，H-2′，H-6′)，6.90(2H，d，J＝8Hz，H-3′，H-5′)，6.35(1H，d，J＝1.8Hz，H-8)，6.25(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，3.75(3H，s，OMe)；分子离子的质荷比(m/z)是284。把这些数据与已报道的生原禅宁A的数值作比较，证实从三叶草根中分离出的低Rf化合物也是生原禅宁A。
化学鉴定出的两个化合物为7-羟-4′-甲氧异黄酮(表1、4)和5，7-二羟-4′-甲氧异黄酮(表1、2)(生原禅宁A)。这两个化合物在0.1-400ppm的浓度范围内具有活性，而且尚不了解它们可用于此目的。
首先，从已在表3所示的无磷营养液中生长2周的Ladino白三叶草籽苗中取得根渗出液。
表 3营养液的组成
用0.1N NaOH调至pH 6.8。
将这些籽苗的根渗出液冷冻干燥，并在室温下用甲醇提取。将甲醇提取液真空干燥，所得粗提液用4∶1氯仿-甲醇溶剂体系在硅胶薄层板上进行层析。在长波和短波紫外光(254和366nm)下检测到三个条带，用1∶1甲醇-氯仿分别洗脱出这三个条带并蒸发至干。对这些纯的级分进行生物测定，测得它们能够剌激VAM菌丝在琼脂培养基上的生长。由于渗出液级分中活性化合物的浓度低，所以对三叶草根进行提取以获得这些化合物。使三叶草在未灭菌的砂中生长并每天浇蒸馏水，从不满2周龄的植株中取得三叶草根。将这些根于5℃下冷冻干燥，并于室温下用甲醇提取。于40℃下真空除去甲醇溶剂，所得提取物用甲醇在硅胶上进行真空固相提取使其部分纯化，用旋转蒸发仪蒸发至干，所得产物在斜薄层析上进行纯化(硅胶，4∶1氯仿-甲醇)。收集与根渗出液Rf值相同的三个条带，提取，并如前所述进行处理。得到与根渗出液化合物的VAM生物活性相同的纯化合物。选择两个化合物，即Rf值最高和中等的化合物，立即进行鉴定和VAM真菌生长研究。用1H-NMR、13C-NMR和MS方法鉴定这两个化合物为B环上连有一个甲氧基，A环上连有羟基的异黄酮，如下所示
1H-NMR光谱分析表明活性化合物与7-羟-4′-甲氧异黄酮(表1中的化合物4)和5，7-二羟-4′-甲氧异黄酮(生原禅宁A，表1中的化合物2)相同。
(1)类异黄酮的粗制备取白三叶草(Trifolium repens cv.Ladino)种子和其它品种植物的种子，用70％乙醇表面灭菌30秒，然后用含1mMHCl的0.1％HgCl2表面灭菌5-7分钟，然后用无菌蒸馏水彻底清洗。
接着把种子放在无菌培养皿中的湿滤纸上，于23℃下在暗中培养两天使其发芽。将50个籽苗从培养皿中转移到一个灭菌玻璃皿中的湿纱布上，该玻璃皿中装有100毫升经过灭菌的Hoagland氏无磷营养液。把玻璃皿包在无菌透明塑料袋中密封起来，使籽苗在16小时日长的荧光(4.5勒克司)下生长。每隔一周更换一次Hoagland氏营养液。
每隔一周从这些三叶草和其它籽苗的根中收集渗出液或提取液。每周将营养液合并，过滤灭菌，旋转蒸发至原体积的1/10，重新过滤灭菌，冷冻干燥，于4℃下储存。
(2)化学定性按照已经建立的方法，对含有各种植物来源的类异黄酮的活性级分进行化学定性。在每个纯化或定性步骤，都取若干份提取液测定VAM真菌生长剌激活性。生物测定的结果使我们能对类异黄酮作出进一步的化学定性。
实施例2根据从三叶草中分离出的化合物7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A的化学性质，与这两个化合物一起研究另外几种市售类黄酮的VAM生物活性，并进行实验确定其它化合物是否也能剌激VAM真菌的根系集群和随后的植物生长。取三叶草植株使其在用Glomus intraradices或与Glomus fasciculatum类似的真菌侵染过的基质中生长。
将消过毒的预先发过芽的三叶草种子移植到装在塑料嵌箱(inserts)中的砂壤混合物(2∶1)中，该嵌箱分为4个60毫升的小室。把每个四室单元放在90×15毫米塑料培养皿底部，以避免化学污染并有利于浇水。用类似Glomus fasciculatum的真菌或Glomus intraradices的VAM真菌土壤接种物侵染游离的VAM繁殖体砂壤混合物。基质pH为中性，交换量低，肥力水平低到中等。VAM土壤接种物得自在温室中保存至少四个月的盆栽物。将干燥接种物与基质充分混合，使孢子的终密度达到每克土壤混合物2-5个孢子。
在移植种子之前，在每个小室中加入5-10毫升三叶草A(所分离出的天然形式的7-羟-4′-甲氧异黄酮)或其它纯化学品的5ppm溶液。把嵌箱放在塑料盆中移至光线充分的生长室中，设定在每日14小时光照加10小时黑暗。
每天用蒸馏水给植物浇水两次，使其生长4周，然后收集起来。以枝条鲜重测量生长反应。从土壤中分出根，用来评定VAM的根系集群。
如
图1所示，在使植物生长于经过VAM真菌侵染的基质时，类异黄酮7-羟-4′-甲氧异黄酮(天然和合成形式)和生原禅宁A刺激VAM真菌的根系集群和三叶草植株的生长。所试验的其它无效化合物，即5，7，4′-三羟异黄酮、7，8-二羟黄酮、5，7-二羟黄酮、藤黄菌素、4′，5，7-三羟黄酮、橙皮素，不能改善植物生长或VAM真菌的根系集群。图7显示了生原禅宁A和7-羟-4′-甲氧异黄酮的浓度对VAM真菌在三叶草上集群百分比的影响。玉米和高梁在用7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A处理后，观察到类似的生长和真菌根系集群的增加。
实施例3图8和10显示了在有或没有7-羟-4′-甲氧异黄酮(Form)、生原禅宁A(Bio)或加入量为每克土壤7个孢子的VAM真菌Glomusintraradices(Myc)存在下，在未灭菌大田土壤中生长的玉米籽苗的生长情况，图9显示了这些玉米籽苗的除草剂损害水平。大田土壤中所含的除草剂依吗喹的初始残留量为13ppb，自然VAM真菌的量约为每克土壤7个孢子。在预先发过芽的玉米种子移植到3个1/2英寸×6英寸Styrofoam花盆中的大田土壤中并在生长室中生长2周和3周后，取从土壤算起第三片叶测量叶片面积。生长室的昼温为30℃，夜温为25℃，每日14小时光照加10小时黑暗。图8显示了在用7-羟-4′-甲氧异黄酮(-MycForm)、生原禅宁A(-MycBio)或VAM真菌Glomusintraradices处理2周和3周后，玉米叶片面积比对照植株(-Myc对照)增加。与VAM真菌接种物一起加入生原禅宁A或7-羟-4′-甲氧异黄酮(+MycBio或+MycForm)也增加玉米叶片面积。
图9显示了图8所述的玉米籽苗(见上)在移植2周和3周后的除草剂损害。损害评级标准以叶片黄化程度为依据，其范围从0＝无损害到5＝严重。与未给予7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A的植株相比，这两个化合物减轻了玉米植株的除草剂损害。
图10显示了图8所述的玉米植株与未接种VAM的对照相比，其4周龄时的顶部干重增加百分比。用7-羟-4′-甲氧异黄酮或生原禅宁A处理增加了玉米植株顶部的干重。
实施例41.孢子的制备几个真菌种属的VAM孢子制备如下在所要繁殖的孢子存在下将高梁植株盆栽在消毒土壤中。这些孢子萌发后感染生长中的植株，所造成的菌根感染于3-4月内在土壤中产生新孢子。用所产生的孢子进行实验。孢子生成后，将盆栽物于4℃下储存至少30天备用。把这种经过VAM侵染的土壤进行湿筛，去掉大部分留在筛上的土壤和有机碎片。接着，利用经过修改的在各种密度菲科尔溶液中进行离心-浮选的技术，从土壤碎片中分离出孢子。在解剖显微镜下用巴吸管以手工进一步从孢子悬浮液中除去有机碎片。接着用含有2％氯胺T(w/v)、+200ppm链霉素的溶液对孢子进行表面灭菌，然后用于萌发和菌丝生长研究。
2.萌发和菌丝生长生物测定将7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A以每体积培养基一定范围的浓度加到琼脂中。监测VAM孢子的萌发和菌丝伸长。萌发限定为直径至少两倍于孢子的芽管。菌丝伸长作用仅是萌发孢子的平均菌丝长度。生物测定时间从4周缩短至2周。还有另外两种生物测定真菌生长的方法，第一种方法采用液体培养，第二种方法则涉及一种含有VAM孢子的膜夹层，这些孢子位于含有养分的无菌砂子之上。这两种方法都在一周内产生类似的结果。类似Glomus fasciculatum的VAM真菌在琼脂培养基上的结果示于图2。
实施例5甲基化将7-羟-4′-甲氧异黄酮(250毫克)和生原禅宁A(500毫克)分别溶于丙酮(25毫升)中，并在室温下与无水K2CO3(30克)一起搅拌5分钟。在上述反应混合物中加入硫酸二甲酯(各3毫升)，并回流18小时。将反应混合物冷却，分别过滤并加甲醇旋转蒸发。粗产物用甲醇结晶，并真空干燥。熔点是用Kofler热台仪对甲基化产物测定的，并未经校正。全甲氧基化类异黄酮的物理性质如下。
MP7-甲氧基-4′-甲氧异黄酮＝155-156℃(白色片状结晶)；分子量282。
5，7-二甲氧基-4′-甲氧基异黄酮＝158-160℃(浅黄色片状结晶)；分子量312。
溶解性5，7-二甲氧基-4′-甲氧基异黄酮和7-甲氧基-4′-甲基异黄酮溶于甲醇、甲醇-水，部分溶于CHCl3。这些类异黄酮的水溶度增加使它们特别有用。
实施例6可以利用实施例4的方法使表2中所示的其它含羟基类异黄酮(如7-羟-4′-甲氧异黄酮)甲基化。这种方法生成已知化合物。
以上叙述只是要说明本发明，本发明只由以下所附的权利要求书来限定。
权利要求
1.一种用于刺激植物生长的植物材料组合物，该组合物包含(a)一种类异黄酮化合物；和(b)一种含有该化合物作为添加剂的植物材料，当该植物材料在VAM真菌存在下生长时，所述化合物的数量能刺激该植物材料生长成植株。
2.一种培养可用于刺激植物生长的泡囊状丛枝状菌根真菌(包括该真菌的孢子)的方法，该方法包括在一定量的类异黄酮存在下培养泡囊状丛枝状菌根真菌，使所产生的真菌剌激植物的生长。
3.一种用于在泡囊状丛枝状菌根真菌存在下剌激植物材料生长的农用组合物，该组合物包含(a)一种类异黄酮化合物；和(b)一种农用载体，其中类异黄酮的含量按载体重量计为0.1-400ppm，该组合物能够在所述真菌存在下刺激植物材料的生长。
4.一种真菌组合物，它包含已在类异黄酮存在下培养过的泡囊状丛枝状菌根真菌。
5.一种真菌组合物，它包含以下二者的混合物(a)一种类异黄酮；和(b)一种受类异黄酮刺激的泡囊状丛枝状菌根真菌。
6.一种在泡囊状丛枝状菌根真菌存在下减轻土壤中杀虫剂或除草剂的损害并在类异黄酮存在下使植物材料与所述真菌一起生长的方法，其中土壤中已施用了杀虫剂或除草剂，而且其含量对植物有毒。
7.一种用于剌激植物生长的植物材料组合物，它包含(a)一种具有下式的类异黄酮化合物
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含有1-30个碳原子的烷氧基；(b)一种含有该化合物作为添加剂的植物材料，当该植物材料在VAM真菌存在下生长时，所述化合物的量能刺激所述植物材料生长成植株。
8.一种用于剌激种子或种子繁殖体在种植后生长成植株的植物材料组合物，该组合物包含(a)一种类异黄酮化合物，选自7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A及这二者的混合物；和(b)一种含有该化合物作为添加剂的种子或繁殖体，其数量能够剌激种子或繁殖体种植后的生长。
9.权利要求8的组合物，其中种子或繁殖体选自被泡囊状丛枝状菌根真菌集群的所有植物。
10.权利要求9的组合物，其中泡囊状丛枝状真菌与种子或繁殖体混合。
11.权利要求8的组合物，其中类异黄酮涂复在种子或繁殖体上。
12.权利要求8的组合物，其中类异黄酮浸入种子或繁殖体中。
13.一种培养用于刺激植物生长的泡囊状丛枝状菌根真菌(包括该真菌的孢子)的方法，该方法包括在一定量的具有下式的类异黄酮存在下培养泡囊状丛枝状菌根真菌，使所产生的真菌刺激植物的生长，
式中R1、R2和R3选自氢、羟基和含有1至30个碳原子的烷氧基。
14.一种包括真菌孢子形成在内的培养可用于刺激植物生长的泡囊状丛枝状菌根真菌的方法，该方法包括在一定量的类异黄酮化合物存在下培养泡囊状丛枝状真菌，使所产生的真菌刺激植物生长，所述类异黄酮化合物选自7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A及这二者的混合物。
15.权利要求14的方法，其中真菌选自能集群于植物根系的真菌。
16.权利要求14的方法，其中真菌培养基中所述化合物的含量约为0.1-400ppm。
17.权利要求16的方法，其中培养基中含有能剌激真菌生长的碳源、氮源、维生素源和矿物质源。
18.权利要求16的方法，其中培养其中含有能刺激所述真菌生长的植物材料。
19.权利要求16的方法，其中培养其中含有能剌激真菌生长的碳源、氮源、维生素源和矿物质源，并含有能刺激真菌生长的植物材料。
20.一种用于在泡囊状丛枝状菌根真菌存在下刺激植物材料生长的农用组合物，该组合物包含(a)一种基本纯净的下式类异黄酮化合物
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基；和(b)一种农用载体，其中类异黄酮的含量按载体重量计为0.5-400ppm，该组合物能在所述真菌存在下剌激植物材料的生长。
21.一种用于在泡囊状丛枝状菌根真菌存在下剌激植物或植物种子生长的农用组合物，该组合物包含(a)一种基本上纯净的类异黄酮化合物，该化合物选自化学纯的7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A及这二者的混合物；和(b)一种农用载体，其中类异黄酮的含量按载体重量计为0.1-400ppm，该组合物能在所述真菌存在下刺激植物或种子的生长。
22.权利要求21的组合物，其中载体含有能刺激泡囊状丛枝状菌根真菌生长的养分。
23.权利要求21的组合物，它还包含泡囊状丛枝状菌根真菌。
24.一种真菌组合物，该组合物包含已在具有下式的类异黄酮存在下培养过的泡囊状丛枝状菌根真菌，
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含1-30个碳原子的烷氧基。
25.权利要求24的组合物，其中类异黄酮选自7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A。
26.权利要求24的组合物，其中真菌与植物材料混合。
27.一种真菌组合物，它包含以下二者的混合物(a)一种具有下式的类异黄酮
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含有1-30个碳原子的烷氧基；和(b)一种泡囊状丛枝状菌根真菌。
28.权利要求27的组合物，其中类异黄酮选自7-羟-4′-甲氧异黄酮和生原禅宁A。
29.一种具有下式的化合物
其中R1、R2和R3选自含有1-30个碳原子的烷氧基；
30.权利要求29的化合物，其中R1、R2和R3为甲氧基。
31.一种减轻土壤中杀虫剂或除草剂的毒性水平对植物损害的方法，该方法是在泡囊状丛枝状菌根真菌和具有下式的类异黄酮存在下使植物生长，其中植物在土壤中的生长得到增强，
其中R1、R2和R3选自氢、羟基和含有1-30个碳原子的烷氧基。
32.权利要求31的方法，其中类异黄酮选自生原禅宁A和7-羟-4′-甲氧异黄酮及其混合物。
全文摘要
本发明描述了利用类异黄酮化合物刺激泡囊状丛枝状菌根真菌生长或在植物材料存在下刺激该真菌生长的方法。类异黄酮最好具有右式,其中R
文档编号A01G7/00GK1186599SQ9710542
公开日1998年7月8日 申请日期1997年5月28日 优先权日1989年12月4日
发明者吉恩·R·萨菲尔, 穆拉利哈兰·G·奈尔, 何塞·O·西凯拉 申请人:密歇根州州立大学托管委员会