专利名称：改良大豆品种的外源dna直接导入大豆的方法
技术领域：
本发明属于植物品种改良的生物技术。
现有植物品种改良一般有两种方法，一是有性杂交法，这种方法存在以下不足(1)只能在品种间进行，因而易造成遗传基础越来越狭窄。而远缘、超远缘，甚至不同科属间的有性杂交就很难成功。(2)杂交是整套染色体的重排，因而引起变异分离的幅度较大，大豆野生种和栽培种杂交虽可以成功，但其杂种后代分离较大，野生性难以改造，应用效率极低。二是基因工程技术，基因工程技术也称DNA体外重组技术。该方法目的性很强，但也存在如下缺点和不足(1)要求的技术难度大。(2)转移条件必须是细胞或组织，因而还要经历再生这一关。(3)在达到获得种子这一步前要经历许多步骤，因此达到最终转化难度较大，特别是稳定遗传的转化后代更要难些。(4)目的基因获得也受到一定的限制。转移后还存在安全性问题。(5)投入较多，一般实验室难以达到。
本发明的目的是研制一种改良大豆品种的外源DNA直接导入大豆的方法，该方法易能打破物种界限和某些基因连锁，扩大基因源，丰富遗传基础。该方法还可越过细胞或组织器官等的植株再生障碍和复杂过程，当年就应获得改良后大豆的种子。该方法获得的大豆后代应具有稳定、育种周期短、成本低的特点。
本发明的方法由以下步骤实现第一步采用大豆DNA快速提取方法(即氯仿——异戊醇——核糖核酸酶法)，但由于大豆不同于禾本科作物，其蛋白质等物质含量较高，本发明的DNA粗提离心次数二次，DNA纯化为3～4次，DNA沉淀时加入乙醇的体积是DNA的三倍。乙醇浓度采用无水乙醇。使大豆DNA提取的纯度达到A260/230≥2,A260/280≥1.8；片段大小为50kb的标准。第二步在常温、常湿度下，在上午7时～8时观察大豆植株，当大豆花冠高于最高花萼0.5～1mm时，于当日下午2时至次日下午5时内进行操作。采用切柱头滴提取后的DNA于切口处，导入浓度为500Mg/ml。三天后和结荚期内进行成活率调查和多次检查。
本发明导入的是总DNA的部分片段，可以打破物种界限和某些基因连锁，扩大基因源，丰富遗传基础。导入是在完成受精的整株水平上进行的，转化的是不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞，因而当年即可获得种子，还可越过细胞或组织器官等的植株再生障碍和复杂过程。导入整合的是极少部分DNA片段，因此后代稳定快，比有性杂交可节约一半的时间，使育种周期大大缩短，也降低了育种成本。并且不存在基因工程的安全性问题。操作简便、所需仪器药品投入少，比基因工程更易于被育种者所接受。利用该方法对实现大豆品种的熟期、蛋白质含量、大粒型等特性转化效果十分明显。如用该生物技术转化改良成功的大豆品种“黑生101”，受体蛋白质含量平均为43.68％，供体蛋白质含量为51.01％，后代黑生101蛋白质含量平均为45.44％(脂肪17.87％)，最高年份可达47.58％，平均比受体提高2个百分点，比标准品种高5个百分点，蛋白质和脂肪含量的总和也比受体高近2个百分点(受体为61.95％)。与大豆品质相关的球蛋白总量比受体高近10个百分点，其中与大豆加工品质和产率相关的IIS球蛋白所占比例高达72.9％，是大豆属中罕见的，也是受体所不及的。用本方法获得的大豆品种还具有高产的优点，异地鉴定产量平均为2595公斤/公顷，比标准品种(丰收22)增产11.3％，比受体增产46.8％。全省区域试验平均为2224.3公斤/公顷，比标准品种增产9.2％。全省生产试验为2198.9公斤/公顷，比标准品种增产9.8％。抗逆性强，耐旱，耐轻碱，抗病性能好，田间鉴定抗灰斑病。该大豆品和主要农艺性状为亚有限结荚习性，生育日数118天，需有效活动积温2362.5℃。株高80cm左右，杆强不倒，主茎型有分枝，平均1个。单株荚数多，平均33.3个，四粒荚多。株型收敛叶片较小而尖，为长叶型，叶色浓绿，叶肉较厚。通风透光性好，白花，灰色茸毛。籽粒圆形，种皮黄色光泽，脐无色或极淡。粒大小中等，百粒重18～20克。该转化的大豆品种“黑生101”经RAPD分子验证，在DNA分子水平上已找到转化证据。
实施例第一步进行总DNA的提取。一、进行提取液的配制。二、进行粗制品DNA的制备，粗制品DNA的制备过程如下1、将大豆芽进行研磨、离心处理。2、灭治DNA酶。3、加提取液、再离心处理。4、进行两次乙醇沉淀、离心，DNA沉淀时加入乙醇的体积是DNA的三倍。三、纯化DNA的制备1、去除RNA，2、加提取液、离心，3、进行二～三次乙醇沉淀、离心。沉淀时加入乙醇的体积是DNA溶液的三倍。四、DNA的检测1、采用琼脂糖凝胶电泳法测其纯度和片段大小，2、采用紫外线检测其纯度和浓度。当纯度达到A260/230≥2,A260/280≥1.8；片断大小为50kb；浓度为500Mg/ml方为合格。第二步进行导入。1、在上午7时～8时观察大豆植株，当大豆花冠高于最高花萼0.5～1mm寸，于当日下午2时～5时进行导入操作。此时田间平均气温要大于18℃以上，湿度在78％左右为宜。导入方法是切柱头，将提取后的DNA滴于切口处，可重复滴注一次。作好标记，三天后作成活率调查。
权利要求
1.改良大豆品种的外源DNA直接导入大豆的方法，第一步采用大豆DNA快速提取法，其特征在于第二步，在常温、常湿度下，在上午7时～8时观察大豆植株，当大豆花冠高于最高花萼0.5-1mm时，于当日下午2时至次日下午5时内进行操作，采用切柱头滴提取后的DNA于切口处，滴注的DNA的纯度为A260/230≥2,A260/280≥1.8；片段大小为50kb；导入浓度为500Mg/ml。
2.根据权利要求1所述的改良大豆品种的外源DNA直接导入大豆的方法，其特征在于大豆DNA粗提取方法采用二次离心，3～4次纯化，DNA沉定时加入乙醇的体积是DNA的三倍，采用的乙醇浓度为无水乙醇。
全文摘要
改良大豆品种的外源DNA直接导入大豆的方法,第一步采用大豆DNA快速提取法,第二步在常温、常湿度下,在上午7时～8时观察,当大豆花冠高于最高花萼0.5～1mm时,在当日下午2时至次日下午5时内采用切柱头滴提取后的DNA于切口处,滴注的DNA的纯度为A260/230≥2,A260/280≥1.8;片段大小为50kb;导入浓度为500μg/ml。该方法当年就能获得改良后的大豆种子。不存在基因工程的安全性问题。获得的大豆后代具有稳定、育种周期短、成本低、高产等优点。经RAPD分子验证证明是遗传转化的品种。
文档编号A01H1/00GK1214855SQ9812150
公开日1999年4月28日 申请日期1998年10月6日 优先权日1998年10月6日
发明者雷勃钧 申请人:黑龙江省农业科学院生物技术研究中心