获得修饰表型的方法和措施的制作方法

专利名称：获得修饰表型的方法和措施的制作方法
1．发明领域本发明涉及通过同时提供给细胞编码含有分别同源于和互补于至少一部分目的核酸的核苷酸序列的核苷酸序列的有义和反义RNA分子的嵌合基因，减少真核细胞特别是植物细胞中目的核酸序列的表型的表达的方法。有义和反义RNA分子可被提供作为这样一种RNA分子，其中的有义和反义RNA可被一段间隔核苷酸序列连接并且能够形成双链RNA分子。在发明的一个方面，本方法目的在于来减少病毒感染，产生极端的病毒抗性。在另一个实施方案中，本方法目的在于减少植物细胞的内源基因表型的表达。本发明进一步涉及一种高通量筛选方法，用于鉴别植物细胞中目的核酸赋予的表型。也提供了含有这种RNA分子的植物细胞，以及基本上由这种植物细胞构成的植物。
2．发明的背景在1985年，Sanford和Johnston提出了寄生物来源的抗性概念。他们假设来源于寄生物以机能障碍的形式、过量或在发育异常的阶段表达于宿主的主要基因产物将中断寄生物对宿主的微弱影响(Sanford &Johnston,1985)。利用QB噬菌体作为模板，他们提出噬菌体壳蛋白或修饰的复制每或互补于QB基因组的反义RNA在细菌中的表达均能产生抗性。他们认为此方法也可将植物病毒以及特别是修饰植物病毒复制酶应用于植物中。植物病毒烟草花叶病毒(TMV)的壳蛋白在烟草中的表达是此植物病毒抗性概念的首次验证。此工作(Powell-Abel等，1986)表明来自转基因的TMV壳蛋白在花椰菜花病毒35S启动子调节下表达，并赋予植物对TMV的抗性。相同的一群人(Powell等，1990)表明，通常地，植物壳蛋白的高水平表达比植物壳蛋白的低水平表达更具有对TMV的抗性。此种论证之后，许多用病毒壳蛋白基因转化的植物实施例显示出了抗性(表1)。此外，也有大量的关于在表达野生型复制酶(Braun和Hemenway,1992,Brederode等，1995)，平端复制酶(Carr等1992)，修饰性复制酶(Longstaff等1993)，或反义病毒RNA(Kawchuck等1991)植物中的植物病毒抗性的报道。
在1992年，Dougherty及其同事利用了烟草蚀刻病毒(TEV)不同形式的壳蛋白基因并且发现一些含有非翻译“有义”壳蛋白基因和反义壳蛋白基因的植物显示出对病毒(Lindbo & Dougherty,1992 a,b)的极端抗性(ER)。这种抗性在植物水平以及在单细胞水平有功能。TEV不能在来自ER植物的原生质体中复制但是可在来自非转基因的烟草中高水平复制。Dougherty等人断定非翻译有义构建物的极端抗性的产生机制不同于经常报道的壳蛋白介导的机制。他们提出非翻译有义构建物的mRNA用病毒的负性有义基因组杂交并且用复制复合体的性染色体在负链上进行干扰。他们认为使用可以形成分子内配对的病毒序列应该被避免，因为这干扰其与靶病毒RNA杂交的能力。
表1被基因工程改造赋予病毒抗性的植物种类(根据RebeccaGrumet,Hort Science 30[3]1995)
Dougherty等人拓展了他们的研究到含有非翻译有义马铃薯病毒Y(PVY)壳蛋白基因的植物。他们获得了与TEV相似的结果并显示了具有ER的植物有很高的转基因拷贝数，转基因的高转录活性，以及来自PVY转基因的低水平稳定状态mRNA(Lindbo等.1993,Smith等1994)。这种抗性机制的模型如下病毒转基因的高水平转录引发了以胞质为基础的后转录细胞监测系统，其目的在于消除特异性RNAs。由于转基因编码了含有病毒序列的转录本，此机制不仅降低了转基因mRNA而且降低了病毒基因组RNA的相同序列。此模型的关键点是需要由高拷贝数提供的转基因的高水平转录(3-8；Goodwin等1996)。可选择地，引发该机制所需要的RNA阈值可通过在早期感染时复制来的病毒RNA辅助下更温和的转录水平来获得。此产生"回复表型"其中的植物显示出最初被感染时的症状，但其后产生没有病毒症状的新的生长，其为对感染的极端抗性。
此假设通过发现使非病毒转基因的基因沉默也归因于在RNA水平作用的后转录机制而被证实(lngelbrecht等1994；de Carvalho Niebel等1995)。
非病毒基因沉默和病原体来源抗性之间的联系通过用含有GUS序列(English等1996)的病毒接种转基因植物来提供，其中的GUS转基因已知通过后转录机制被沉默。在此情况下植物对病毒感染有极端抗性。然而，相同的植物如不含有GUS序列则容易被病毒感染。
病毒抗性的程度并非总直接相关于病毒转基因转录(Mueller et at1995；English et at 1996)的水平，表明了可能存在另一种诱导抗性的机制。为了调和这些矛盾，另一种模型被提供，其中影响抗性的关键因素并非转基因mRNA水平而是转基因mRNA的质量(English et at 1996)。根据此模型，如果转基因被转录产生“畸变”RNA其只能诱导抗性(或基因沉默)。有很多后转录基因沉默和转基因甲基化(Hobbs et at 1990；lngelbrecht et at 1994)的实施例并且转基因甲基化也被发现与一些极端病毒抗性的情况相关(Smith et at 1994,English 1996)。在所提出的模型中，转基因的甲基化导致畸变RNA的产生其诱导细胞质RNA监测系统。Baulcombe与English认为此诱导方法与发现met2在A.immersus中的沉默相同。在此系统中，met2 RNA的转录在内源基因的甲基化区域被终止因此产生畸变的平端RNAs。有人提出甲基化是转基因与内源基因的相关区域的同源区域之间的异位相互作用的结果(Barry et aL 1993)。多种转基因的存在将引起异位配对可能性的增加并且因此与高拷贝数与极端病毒抗性之间的联系相符(Mueller et at,1995；Goodwin et at 1996；Panget at,1996)。
最近整个领域被综述(e.g.Baulcombe(1996)and Stam et at(1997))且提出了一些模型。所有的模型要求高度的序列特异性，因为抗性是非常(严紧)特异的且因此引起与来自转基因的RNA与碱基配对的相互作用。用有义转基因诱导病毒抗性或沉默基因的解释之一是植物的RNA依靠聚合酶产生利用转基因mRNA作为模板的互补RNAs(Schiebel et at I993a,b)。此假设的互补RNA(cRNA)尚未被检测到(Baulcombe 1996)，但是人们认为cRNA会小的和非均一的RNA而不是完整的互补序列(Schiebel I 993ab,Baulcombe 1996)，因此很困难来检测。
cRNA在介导病毒抗性或基因沉默中作用的可行性方法(Baulcombe建议，1996)为1cRNA与转基因mRNA或病毒RNA杂交且双链成为dsRNA酶的靶点；2cRNA与靶RNA杂交来形成一个双链，其能抑制翻译且因此对稳定性有间接的影响(Green,1993)；3cRNA和病毒RNA之间形成的双链引起病毒复制需要的辅因子翻译的杂交抑制；以及4．cRNA的杂交影响病毒复制需要的分子内碱基配对。
目前病毒抗性和基因沉默的模型因此包括通过高水平的转基因转录或通过产生异常的单链mRNA来诱导细胞质监视系统。一旦该系统被引发，依赖RNA的RNA聚合酶由转基因mRNA产生cRNA。这些cRNA杂交于靶RNA，直接影响其翻译能力或稳定性，或使RNA降解。
US5,190,131和EP0467349Al描述了方法和措施，通过将一段非天然的核酸序列与细胞的遗传物质结合或缔合来调节或抑制细胞内的基因表达，其中非天然的核酸序列被转录产生互补于并能结合于细胞的遗传物质产生mRNA的mRNA。
EP 0223 399 Al描述影响植物中有用体细胞的改变的方法是通过引起植物细胞中基本上互补于靶RNA链的负RNA链转录来进行的。靶RNA链可以是产生在基因表达中的mRNA转录本，病毒RNA，或存在于植物细胞中的其它RNA。负RNA链互补于至少在体内抑制其活性的一部分靶RNA链。
EP0240208描述调节用于植物细胞基因组编码的基因的表达的方法，其通过在宿主中起作用的启动子的转录调节下的基因整合来完成，并且其中被转录的DNA链互补于来自人们希望去调节的内源基因的被转录的DNA链。
EP0647715Al和US5034323,5231020以及5283184描述的方法和措施用于产生表现出所需要的表型特征的植物，其通过筛选含有有效连接启动子的DNA片段的转基因子，其中片段的转录产物实际上同源于内源基因特别是内源的类黄酮生物合成途径基因的相关转录本。
WO93/23551描述的方法和措施用于抑制两个或更多的靶基因，其包括导入一个单调节基因到植物中，单调节基因具有同源于每个靶基因的不同DNA区域以及一个在植物中可操作地适于由抑制每个靶基因表达的不同区域RNA中转录的启动子。
W0921/3070描述的方法用于调节核酸的翻译，表征一个编码多肽的反应的RNA分子并且进一步包括一个调节区域，一个底物区以及一个核糖体识别序列。此应答RNA分子在调节区具有一个抑制区其调节区互补于应答RNA分子的底物区以及互补于一个信号核酸的抗抑制区，例如，相对于存在信号核酸时观察到的一个蛋白编码区的翻译水平，在缺乏信号核酸时，抑制剂以及底物区形成碱基对区减少了在应答RNA分子中的一个蛋白编码区的翻译水平。
Metzlaff et at,1997描述的为RNA介导的RNA降解和查耳酮合成酶A在Petunia中沉默的模型，包括在互补序列间的RNA-RNA配对循环，然后通过内溶核RNA裂解来描述RNA降解如何可能被促进的。
Fire等，在1998年描述了通过在Caenorhabdftis elegans中导入双链RNA的特异性遗传干扰。这些功能性基因组发现的重要性被讨论(Wagner and Sun,1998)。
Que et at,1998年描述了通过等位有义和反义查耳酮合成酶转基因在矮牵牛花中产生的色素抑制的不同模型并且也分析有义和反义查耳酮合成酶等位基因杂合植物中的花色模型。
WO98/05770公开了携带特异性二级结构的反义RNA，其可以被用来抑制基因表达。
WO94/18337公开了转化的增加或减少了亚麻酸的植物以及表达亚油酸脱氢酶的植物。
US5,850,026公开了一种来自芥属种子的内源油，该种子在破碎和提取后含有超过86％的油酸和低于2.5％的α-亚麻酸。油也含有低于7％的亚油酸。芥属种子由含有种子特异性抑制的微粒体油酸脱氢酶以及微粒体亚油酸脱氢酶基因表达的植物产生，其中的抑制可通过共抑制或反义技术来产生。
US5,638,637公开了来自油菜籽的植物油以及产生该油的油菜籽，该植物油具有非常高的相对于总脂肪酸含量的80％至90％油酸含量。
发明的概述本发明提供了一种减少通常能够在真核细胞中表达的目的核酸的表型表达的方法，特别是减少整合到真核细胞的基因组中的基因，特别是内源基因或外来转基因的表型表达，或减少被包含在感染病毒的基因组中的目的核酸的表型表达，包括步骤导入，优选整合在真核细胞的核基因组中，一种嵌合DNA，包含启动子，能够在那个真核细胞中表达，且任选地一种涉及到转录终止和聚腺苷酸化的DNA区域以及其间的DNA区域，当其转录时，产生一个RNA分子，此RNA分子携带含有至少10个连续核苷酸，特别是至少550个连续核苷酸与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的有义核苷酸序列，以及包括至少10个连续与有义核苷酸序列的互补序列(complement)的10个核苷酸序列有大约75％到大约100％的序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列，其中的RNA通过在带有有义和反义核苷酸序列的区域间碱基配对能够形成一个人为的携带双链RNA茎区的发夹RNA结构，从而至少有义序列的10个连续核苷酸与反义序列的10个连续核苷酸进行碱基配对，结果产生，优选地人工的发夹结构。优选地，嵌合DNA稳定地整合到DNA的基因组中。
本发明也提供了一种减少通常能够在真核细胞中表达的目的核酸表型表达的方法，其包括导入一段携带含有至少10个连续的与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；以及一段包括至少10个连续的与有义核苷酸序列的互补序列的10nt序列有75％到100％序列同一性的反义核苷酸序列的核苷酸序列的嵌合RNA分子；其中的RNA通过在携带有义和反义核苷酸序列的区域间进行碱基配对能够形成一个双链RNA区域，从而至少10个连续的有义序列的核苷酸与10个连续的反义序列的核苷酸碱基配对，结果产生一种(人工的)发夹RNA结构。
本发明进一步提供了一种减少目的基因在植物细胞中基因表达的方法，包括下述步骤导入连接在一个重组DNA上的第一和第二嵌合DNA，因此两个嵌合DNA均被一起整合到转基因植物细胞的核基因组中；其中的第一嵌合DNA含有一个植物可表达的启动子，能够被转录成一段携带含有至少10个连续的与目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的有义核苷酸的有义RNA分子的第一DNA区域，以及任选地，涉及植物细胞中的转录终止聚腺苷酸功能的DNA区域。第二嵌合DNA含有一个植物可表达的启动子，一个能够被转录成一段携带含有至少10个连续的与有义核苷酸序列的至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的反义核苷酸的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域，和任选地，涉及在植物细胞中转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区域。有义和反义RNA分子通过在互补的区域间碱基配对能够形成一个双链，双螺旋RNA。
本发明也提供了一种获得抗病毒生物，特别是植物的方法，包括步骤给生物体细胞提供第一和第二嵌合DNA，其中的第一嵌合DNA含有启动子，能够被转录成一段携带含有至少10个连续的与能够感染植物的病毒的基因组的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸的有义RNA分子核苷酸序列的第一DNA区域，以及涉及在植物细胞中转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区域。第二嵌合DNA含有一个启动子，一个能够被转录成一段携带含有至少10个连续的与有义核苷酸序列的至少10个连续核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的反义核苷酸的核苷酸序列反义RNA分子的第二DNA区域，以及涉及在植物细胞中行使转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区域。有义和反义RNA分子通过在互补区域间碱基配对能够形成一个双链RNA区域。
第一和第二嵌合DNA被独立地整合到转化的植物细胞核基因组中或被连接到一个重组DNA上从而两个嵌合DNA被一起整合到转基因植物细胞的核基因组中。
本发明也提供了一种鉴定与真核细胞中目的核酸表达相关的表型的方法，包括在目的核苷酸序列中筛选，一段至少10个连续核苷酸的靶序列；设计一段与被筛选的靶序列的长度对应并与所筛选的靶序列有至少大约75％到100％序列同一性的有义核苷酸序列，设计一段与有义核苷酸序列的互补序列有至少大约75％到100％序列同一性以及含有一段至少10个连续的与部分有义核苷酸序列的互补序列有100％序列同一性的核苷酸的序列的反义核苷酸序列。该方法进一步包括步骤导入含有所设计的有义和反义核苷酸序列的RNA分子到一个合适的真核宿主细胞中，此真核宿主细胞含有表达迄今未鉴定的表型的核苷酸序列的核酸；以及通过一种合适的方法观察表型。
本发明也提供了一种含有正常地能够被表型表达的目的核酸的真核细胞，进一步含有包含能够在此真核细胞中表达的启动子，当转录时产生一个RNA分子的DNA区域，其中的RNA分子带有含至少10个连续与目的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列以及含有至少10个连续的与有义核苷酸序列的至少10个连续核苷酸的互补序列具有大约75％到大约100％的序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列，其中的RNA分子通过在携带有义和反义核苷酸序列的区域间进行碱基配对能够形成双链RNA区域，从而至少所说的10个连续的有义序列的核苷酸与所说的10个连续的反义序列的核苷酸碱基配对，结果产生一个发夹RNA结构，优选地为一个人工的发夹结构及涉及转录终止和聚腺苷化的DNA区域，其中目的核酸的表型表达显著地减少。
本发明也提供了一种含有正常地能够被表型表达的目的核酸的真核细胞，进一步含有一个嵌合RNA分子，此RNA分子带有含至少10个连续的与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列以及含有至少10个连续的与有义核苷酸序列的至少10个连续核苷酸的互补序列具有大约75％到大约100％的序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列，其中的RNA通过在携带有义和反义核苷酸序列的区域间进行碱基配对能够形成一个双链RNA区域，从而所说的至少10个连续的有义序列的核苷酸与所说的10个连续的反义序列的核苷酸碱基配对，结果产生一个人工发夹RNA结构。
本发明的另一个目的是提供一个含有正常地能被表型表达的目的基因的真核细胞，真核细胞进一步包含连接在重组DNA上的第一和第二嵌合DNA，从而此两种嵌合DNA被一起整合到此真核细胞的核基因组中，其中的第一嵌合DNA含有下述可操作地连接的部分能够在真核细胞中表达的启动子，能够被转录成具有含有至少10个连续的与目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义RNA分子的核苷酸序列的第一DNA区域；以及涉及转录终止与聚腺苷化的DNA区域；且其中的第二嵌合DNA含有以下可操作地连接的部分在真核细胞核中起作用的启动子；能够被转录成具有含有包括至少10个连续的与有义核苷酸的至少10个连续的核苷酸的互补序列有大约75到大约100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域；以及一个涉及转录终止与聚腺苷化的DNA区域；其中的有义和反义RNA分子能够在互补的区域间通过碱基配对形成一个双链RNA区域。
本发明的另一个目的是提供一种病毒抗性植物，其含有被整合到其细胞的核基因组中的第一和第二嵌合DNA，其中的第一嵌合DNA含有植物可表达的启动子，能够被转录成一段携带含有至少10个连续的与能够感染植物的病毒的染色体组的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的序列的核苷酸序列的有义核苷酸的有义RNA分子的第一DNA区域，以及一个涉及在植物细胞中行使转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区域。第二嵌合DNA含有一个植物可表达的启动子，一个能够被转录成一段携带含有包括至少10个连续的与至少10个连续的有义核苷酸序列的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域，以及一个涉及在植物细胞中行使转录终止和聚腺苷酸化功能的DNA区域。有义和反义RNA分子能够在互补的区域间通过碱基配对形成一个双链RNA区域。第一和第二嵌合被整合到核基因组的同一位点或不同的位点。
本发明也提供了一种改变脂肪酸在来自植物，优选地来自油籽油菜(oilseed rape)的油中的分布的方法，优选增加油酸的含量，方法包括步骤导入嵌合DNA到植物细胞中，含有下述可操作地连接部分a)．植物可表达的启动子，优选的为种子特异性启动子；b)．DNA区域，特别是携带SEQ ID No 6的核苷酸序列，当其转录时产生一个含有能够形成人工茎环结构的RNA区的RNA分子，其中茎环结构的退火RNA序列之一含有一段实际上与Δ12脱氢酶编码开放阅读框架的至少部分核苷酸序列相似的核苷酸序列，且其中第二个退火RNA序列含有一段实际上与Δ12脱氢酶编码开放阅读框架的至少部分核苷酸序列的至少部分互补序列相似的序列；以及任选地；c)涉及转录终止和聚腺酸化的DNA区。本发明也提供了改变了脂肪酸分布，特别是增加了油酸含量的含有所述嵌合基因的植物。同时也包括从这些植物或种子中获得的油。
由于前面所述的和其它的目的，本发明的优点和特点将在下文显得清晰，发明的本质通过参照下面优选实施方案的详述以及附加的权利要求可以被更清楚的理解。
附图的简要描述附


图1图示了用于获得病毒抗性(图ⅠB)或用于减少转基因Gus基因表型表达(图ⅠA)的不同的有义和反义构建体，以及所谓的CoP(互补配对)构建体。
附图2A图示了所谓的锅柄结构或Cop结构，用于减少Δ12脱氢酶基因在Arabidopsis中的表型表达(Nos Pro胭脂氨酸合酶基因启动子；nptll新霉素磷酸转移酶编码区；Nos term胭脂氨酸合酶基因终止子；FP1截短的种子特异性napin启动子；480bp:Arabidopsisthaliana的Fad2基因在有义方向的5′末端；623bp间隔区；480bp:Arabidopsis thaliana的Fad2基因在反义方向的5′末端。
附图2B图示了一个用于减少Δ12脱氢酶基因在Arabidopsisthaliana的表型表达的普通的共抑制结构。
本发明优选实施例的详述本发明的目的之一是提供一种真核细胞，特别是携带含有包括确定的有义部分与确定的反义部分的发夹结构的RNA分子。潜在地，RNA分子能够形成几种二级结构，其中的一些可能含有所需要的发夹结构。希望细胞中的RNA的真实二级结构具有最低的自由能。根据本发明，细胞中产生的RNA分子以这样的方式被设计以致于至少是在其最低自由能状态，其可假定在该细胞中，其含有所希望的发夹结构。
此处的“发夹RNA”是指任意自我退火的双链RNA分子。在其最简单的代表中，发夹RNA由一种由退火RNA链组成的双链茎所构成，其由一个单链的RNA环相连，也被称为“锅柄RNA”。然而，术语“发夹RNA”也用来泛指更复杂的含有自我退火的双链RNA序列以及内部凸起或环的二级RNA结构。适宜的特定二级结构将通过RNA分子的自由能确定，且可被通过利用合适的软件例如FOLDRNA(Zuker andStiegler,1981)来预测其不同的状态。
此处的关于核苷酸序列(DNA或RNA)“序列同一性”是指相同核苷酸的位点数除以二序列中较短的核苷酸数。两个核苷酸序列的排列被Wilbur与Lipmann algorithm(Wilbur与Lipmann,1983)通过利用20个核苷酸为一个窗口大小，4个核苷酸为一个单词长度，以及一个缺口占4个核苷酸来进行。序列数据的计算机辅助分析和译码，包括上述的序列排列可以利用InteiligeneticsTMTM Suite(Intelligenetics Inc.,CA)方便地操作。当序列具有至少约75％，特别的至少约80％，更特别地至少约85％，相当特别的约90％，尤其是约95％，更尤其的约100％的序列同一性，相当尤其完全相同时，这些序列被定义为“本质上相似”。很显然，当RNA序列被认为是本质相似于或与DNA序列有一定程度的序列同一性时，DNA序列的胸腺嘧啶(T)与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。
此处的术语“植物可表达的启动子”是指一段DNA序列，其能够控制(引发)植物细胞中的转录。其包括任意植物来源的启动子，以及任意的非植物来源的能够在植物细胞中指导转录的启动子，例如一些病毒或细菌来源的启动子，例如CaMV35S，地下三叶草病毒启动子No 4或No 7，或T-DNA基因启动子。
术语“基因表达”是指其中的可操作连接于合适的调节区，特别是启动子的DNA区被转录为一个具有生物活性的RNA的过程，即其中的RNA能够与另外的核酸互相作用或者可以被翻译为多肽或蛋白。当基因的表达的末端产物是有活性的RNA例如一个反义RNA，一个核酶或者一个复制中间体时，基因被认为编码了RNA。当基因的表达的末端产物是蛋白或多肽时，基因被认为编码了蛋白。
目的核酸是“能够被表达的”，当所述核酸被导入一个适宜的宿主细胞，特别是一个植物细胞时，在宿主中被转录(或被复制)产生RNA，和/或被反义产生多肽或蛋白。
术语“基因”是指含有在细胞中可操作的连接于适宜的调节区例如植物可表达的启动子被转录为RNA分子(例如mRNA)的DNA区(“转录的DNA区”)的任意DNA片段。基因因此含有很多可操作连接的DNA片段例如启动子，5′前导序列，编码区，含有聚腺苷酸化位点的3′区。一种内生于特定植物种类的植物基因(内源植物基因)是一个天然发现于此植物种类或可通过常规的育种被导入此植物种类的基因。一个嵌合基因是任意不能正常在一个植物种类发现的基因或，可选择性地，任意其中启动子不是天然地与部分或全部被转录的DNA区或者至少基因的一个其它调节区相关联的任意基因。
此处所用的“目的核酸的表型表达”是指任意的在宿主细胞中与核酸的分子表达相关的定量特性并且可能因此包括被转录或复制的RNA分子的量，转录后修饰的RNA分子的量，被翻译的多肽或蛋白的量，这些多肽或蛋白的活性。
与一个目的核酸的表型表达相关的“表型特征”是指任意质或量的特征，包括上述的的特征，以及在RNA分子，肽或蛋白，或转录后修饰多肽或蛋白的存在下，直接或间接的对细胞或含有此细胞的生物的影响。仅核酸在宿主细胞中存在，并不被认为是表型特征表达或者该核酸的表型特征，尽管其能被定量或定性的示踪。直接或间接的对细胞或生物的影响的实例例如为农业或工业的有益的特征，例如对害虫或疾病的抗性；较高的或改变的油含量等。
此处所用的“表型表达的减少”是在本发明的RNA或嵌合基因存在下，真核细胞目的核酸的表型表达与本发明的RNA或嵌合基因不存在时目的核酸的表型表达相比较而言的。在本发明的嵌合RNA存在下真核细胞目的核酸的表型表达因此应低于嵌合RNA不存在时目的核酸的表型表达，优选仅仅为大约25％，特别仅仅大约10％，更特别的仅仅大约5％。尤其在嵌合RNA或编码RNA的嵌合基因存在下表型表达将被完全抑制用于所有实用目的。
其表型是定性特征的核酸的表型表达的减少意味着在本发明嵌合RNA或基因存在下，当相对于该RNA或基因缺失时，表型特征转化为一种不同的离散状态。核酸的表型表达的减少因此可以通过(部分的)该核酸转录的减少，(部分的)该核酸翻译的减少或存在的被转录的RNA或被翻译的多肽对真核细胞或生物的影响的减少来测定，并且将最终导致变化的表型特征。很显然，目的核酸表型表达的减少可以伴随或相关于表型特征的增加。
此处所用的“目的核酸”或“靶核酸”是指能够存在于真核细胞特别是植物细胞中任意特定的RNA分子或DNA序列。
此处所用的“含有”是被解释为说明所述的特征，整体，步骤或所提及组成的存在，并不排除出现或增加一个或多个特征，整体，步骤或组成，或其集合。因此，例如含有一段核苷酸序列或氨基酸序列的核酸或蛋白，可含有较实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，例如被包含于一个较大的核酸或蛋白中。一个含有结构或功能已被限定的DNA区的嵌合基因可以含有其它的DNA区等。
发明人出乎意料地发现，导入能够被转录为带有包含被整合到植物细胞的核基因组中的靶基因或其部分的有义和反义核苷酸序列的核苷酸序列的RNA分子的嵌合基因，能够有效地并特异地减少目的基因的表型表达。表型表达的减少较当分离的编码有义或反义RNA分子的嵌合基因被导入到带有靶基因的相似细胞所观察到的更有效且更可预料。
同时，发现同时导入编码携带分别含有有义和反义的核苷酸序列的RNA分子的嵌合基因到细胞中，导致产生了极端病毒抗性，甚至当嵌合基因从较弱的启动子中被转录时。众所周知，基因沉默和病毒抗性可以被相似的现象介导。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种减少正常能在真核细胞中特别是植物细胞中表达的目的核酸表型表达的方法，包括导入含有下列可操作连接部分的嵌合DNAa)一个启动子，在此细胞中有效，特别为一个植物可表达的启动子；b)一个能被转录为带有如下核苷酸序列的RNA分子的DNA区ⅰ．一个至少10nt，优选15nt连续的与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；以及ⅱ．一个含有至少10nt，优选15nt连续的与有义核苷酸序列的至少10，优选15nt的连续核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列；其中的RNA能够通过在具有有义和反义核苷酸序列的区域间进行碱基配对产生发夹RNA结构形成双链RNA；和
c)一个涉及在适宜的真核细胞中，特别是在植物细胞中，行使转录终止及聚腺苷酸化功能的DNA区。
在本发明的一个优选实施方案中，从嵌合基因中转录的RNA分子，基本上由发夹RNA构成。
RNA分子中的有义和反义核苷酸序列的顺序被认为是不重要的。
因此，换句话说，嵌合DNA具有一个被转录的DNA区，当被转录时，产生一个含有能够形成人工茎环结构的RNA区的RNA分子，其中茎环结构的退火RNA序列之一含有实质上相似于至少部分目的核酸的核苷酸序列的序列，并且其中的第二个退火RNA序列含有实质上相似于至少部分目的核酸的核苷酸序列的至少部分互补序列的序列。
RNA分子可能含有几种人工发夹结构，其可被设计来用于减少不同目的核酸的表型表达。
在一个优选的实施方案中，目的为减少其表型表达的目的核酸是一个被整合到真核细胞特别是植物细胞基因组的基因。可以理解本发明的方法和措施可被用于减少细胞自然产生的基因组的基因的表型表达(内源基因)，也可用于减少不属于细胞自然产生的基因组但可在此细胞中被导入的基因(转基因)的表型表达。转基因可被稳定或瞬时导入，且可被整合到细胞的核基因组中，或被呈递在复制载体例如病毒载体上。
在另一个优选的实施方案中，目的是降低其表型表达的目的核酸是能够感染真核细胞特别是植物细胞的病毒核酸，特别是病毒RNA分子，在此情况下，将被减少的表型为病毒的复制，最终是减少由病毒感染引起的疾病症状。
优选地，与有义核苷酸序列对应的靶核酸的核苷酸序列为被转录的DNA区，特别是被转录和翻译的DNA区(换句话说为一个编码区)的一部分。特别优选靶序列对应于一个或多个连续的外显子，更特别的是位于编码区的一个单外显子中。
有义核苷酸序列的长度可在从大约10个核苷酸(nt)到等于靶核酸的长度(在核苷酸中)的长度内变化。优选的有义核苷酸序列的全长至少为10nt，优选的为15nt，特别地为至少50nt，更特别的为至少100nt，尤其至少大约150nt，更尤其地为至少大约200nt，相当尤其的至少大约550nt。希望除了靶核酸的全长外，有义核苷酸序列的全长没有上限。然而，因为实际的原因(例如嵌合基因的稳定性)，希望有义核苷酸序列的全长不超过5000nt，特别地不超过2500nt且可被限制到大约1000nt。
可以理解，有义核苷酸序列的全长越长，总有义核苷酸序列和靶基因的对应的序列之间的序列同一性的要求越不严紧。优选地，有义核苷酸序列的全长与对应的靶序列至少有约75％的序列同一性，特别至少为约80％，更特别的为至少约85％，相当特别的为约90％，尤其为大约95％，更尤其的为大约100％，相当尤其的同等于对应于部分靶核酸。然而，优选的有义核苷酸序列总是包括大约10个连续核苷酸，特别地为大约20nt，更特别的为大约50nt，尤其大约100nt，相当尤其的大约150nt，与对应的部分靶核酸有100％的序列同一性。优选地，为了计算序列同一性和设计对应的有义序列，间隙的数目应被减到最少，特别是用于较短的有义序列。
反义核苷酸序列的长度主要通过有义核苷酸序列的长度被测定，且优选的对应于后者序列的长度。然而，使用其长度区别为大约10％的反义序列是可能的。类似地，反义区域的核苷酸序列主要通过有义区域的核苷酸序列被测定，且优选地，同等于有义区域的核苷酸序列的互补序列。然而，特别地，对于较长的反义区域，使用带有与有义核苷酸序列有较低序列同一性的反义序列是可能的，优选地至少大约75％同一性，更优选地有至少大约80％的序列同一性，特别地为有至少大约85％的序列同一性，更特别的有至少大约90％的序列同一性，尤其地与有义核苷酸序列的互补序列有至少大约95％的序列同一性。然而，优选地反义核苷酸序列总是包括大约10，优选大约15个连续核苷酸，特别地为大约20nt，更特别的为大约50nt，尤其大约100nt，相当尤其的大约150nt，与对应的部分有义核苷酸序列的互补序列有100％的序列同一性。很显然，一段与有义核苷酸序列的互补序列有100％序列同一性的连续核苷酸的长度不能够长于有义核苷酸序列本身。再一次地，优选地，间隙的数目应被减到最少，特别是对于较短的有义序列。进一步地，优选反义序列与靶序列的互补序列有大约75％到100％的序列同一性。
由嵌合DNA转录而来的RNA分子可含有一个位于有义和反义序列间的间隔核苷酸序列。在此间隔核苷酸序列缺失的情况下，RNA分子也能够形成一个双链RNA，特别地，如果有义和反义核苷酸序列长于约10个核苷酸以及部分的有义和/或反义核苷酸序列将被用于形成允许在具有有义和反义核苷酸序列的区域间碱基配对并产生双链RNA的环。希望没有长度的限制或与间隔区域相关的序列的要求，只要这些参数不与带有有义和反义核苷酸序列来形成双链RNA的RNA区域的能力冲突。在一个优选的实施方案中，间隔区域在从4到大约200bp的长度内变化，但是如前面所述，其可能会不存在。
在一个优选的实施方案中，由有义和反义区域以及合适时的间隔区形成的发夹RNA，是一个人工的发夹RNA。“人工发夹RNA”或“人工茎环RNA结构”是指此发夹RNA不是天然产生的，因为所定义的有义和反义区域不是在一个RNA分子中同时产生的，或有义和反义区域在对应的有义核苷酸序列的5′或3′末端被一个与靶基因异源的间隔区域隔开，尤其是，间隔的核苷酸序列与靶序列的核苷酸序列有不到75％的序列同一性。发夹RNA如果不被包含在其通常关联的RNA分子中，也可被认为是人工的。可以理解，本发明使用其转录产生带有提供此发夹RNA的自然产生的核苷酸序列(或者其受本说明书所述的限制)的发夹RNA结构的嵌合DNA缺乏环境RNA序列(不涉及发夹结构的形成)。
尽管优选含有发夹RNA的RNA分子不进一步含有内含子序列，很显然编码此RNAs的嵌合DNA基因可以在其被转录的区域含有一或多个内含子。
事实上，发明人出乎意料地发现在编码含有发夹RNA的RNA分子的嵌合DNA基因中，优选在间隔区域中，以及优选地在有义方向含有内含子序列，增强了减少靶核酸表达的效率。效率的增强可表达为其中产生沉默的植物的频率的增加或表现为表型特征的减少的水平的增加。在一个特别优选的实施方案中，内含子实际上等同于Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸盐二激酶2内含子2的序列，更特别的其含有SEQ ID No 7的序列，已注意到与单独使用反义或有义核苷酸序列来减少靶核酸的表型表达(其通常依靠有义和反义分子的剂量且因此编码有义和反义分子的嵌合基因需要相关强烈启动子的调节)不同，本发明的方法不依靠此强烈启动子区域的存在来驱动含有有义和反义区的RNA的转录功能。换句话说，所有的启动子，特别是植物可表达的启动子，对于指导本发明嵌合基因的转录是有效的。这些启动子包括但不限于强烈启动子例如CaMV35S启动子(例如.，Harpster et al.,1988)。如本领域技术人员所公知的，由于CaMV35S启动子存在不同的形式，本发明的目的通过使用这些可供选择的CaMV35S启动子及其变体而同样地被达到。很显然，其它植物可表达的启动子，特别是组成型启动子，例如AgrobactedumTi-或Ri-质粒的冠瘿碱合酶启动子，特别是胭脂碱合酶启动子，或地下三叶草病毒启动子可被用来获得相似的影响。本发明还考虑降低在细胞中的核酸的表型表达的嵌合基因，其是在单亚基噬菌体RNA聚合酶特异性启动子的调控下，例如T7或T3特异性启动子，只要在宿主细胞中也含有活性形式的相应的RNA聚合酶。
本发明的进一步的目的是提供一种通过在组织特异性或器官特异性启动子的调控下放置本发明的嵌合基因减少特定细胞，特别是特定的植物细胞中的核酸表型表达的方法。这种组织特异性或器官特异性启动子是本领域公知的且包括但不限于种子特异性启动子(e.g.,W089/03887)，器官-原基的特异性启动子(An et al.,1996)，茎特异性启动子(Keller et al.,1988)，叶特异性启动子(Hudspeth et aL,1989)，叶肉特异性启动子(例如光诱导的Rubisco启动子)，根特异性启动子(Keller et aL,1989)，块茎特异性启动子(Keil et aL,1989)，维管组织特异性启动子(Peleman et at,1989)，雄蕊选择性的启动子(WO89/10396,WO92/13956)，裂开区特异性启动子(WO97/13865)等等。
在本发明的另一个实施方案中，减少靶核酸表型表达的嵌合基因的表达可通过适当的化学诱导物的应用被任意地调控，通过可操作地连接本发明的嵌合基因的转录DNA区与其表达被化学化合物诱导的启动子，例如公开在欧洲专利申请(“EP”)0332104上的基因的启动子，或公开在WO90/08826上的启动子。
已发现相似的真核细胞中，特别是在植物细胞中目的核酸的表型表达的减少，可通过提供有义和反义RNA编码可转录的DNA区域作为独立的转基因，优选的在一个基因座(locus)，特别的作为一个等位基因来获得。
因此，在本发明的另一个实施方案中，提供了一种减少正常能够在真核细胞特别是在植物细胞中表达的核酸的表型表达的方法，包括步骤导入连接在一个重组DNA上的第一和第二嵌合DNA，从而两个嵌合DNA被一起整合到转基因细胞的核染色体中；其中的第一嵌合DNA含有下述的可操作的连接部分a)一个启动子，在此细胞中有效，特别为一个植物可表达的启动子；b)能被转录为带有含有至少10nt，优选15nt连续的与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的有义核苷酸序列的核苷酸序列的有义RNA分子的DNA区；和c)涉及在相应的真核细胞中行使转录终止及聚腺苷酸化功能的DNA区；以及其中的第二嵌合DNA含有下述的可操作的连接部分a)一个启动子，在此细胞中有效，特别为一个植物可表达的启动子；b)能被转录为带有包括含有至少10nt，优选15nt连续的与有义核苷酸序列的至少10，优选15nt的连续核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列的反义RNA分子的DNA区；和c)涉及在相关的真核细胞中行使转录终止及聚腺苷酸化功能的DNA区；其中的有义和反义RNA能够通过互补的区域间的碱基配对形成双链RNA。
本方法的不同结构和功能特性例如有义，反义和间隔区的长度与序列的优选实施方案如说明书其它地方所描述。
通过嵌合基因的转录产生的含有能够形成发夹结构的有义和反义核苷酸序列的RNA分子，可被直接导入到植物细胞中来减少靶核酸的表型表达，特别是减少靶内源的基因或一个靶转基因的表型表达。这种RNA分子可以被产生，例如通过1．克隆能够被转录为带有包含一段至少10个连续的与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％的序列特异性的有义核苷酸序列以及包含一段至少10个连续的与有义核苷酸序列的至少10个连续核苷酸的互补序列有75％到100％的序列特异性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列的RNA分子的DNA区，因此此RNA能够通过在有义和反义核苷酸序列间碱基配对形成双链RNA产生发夹RNA结构，其是在适用于被依赖DNA的RNA聚合酶在体外转录反应中识别的启动子的调节下，例如但不限于T7聚合酶特异性启动子；2．通过添加特别是适宜的依赖DNA的RNA聚合酶以及产生RNA分子所需要的试剂在体外进行转录反应；以及3．分离RNA分子。
体外转录的方法以及其它的体外产生RNA的方法为本领域公知的技术并且商业的试剂盒也适用。直接导入RNA到植物细胞中的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于电穿孔，微注射等等。
在一个细胞中减少目的靶核酸表型的嵌合基因可以被瞬间导入或者被稳定整合于细胞的基因组。在一个实施方案中，嵌合基因定位于一个病毒载体，其能够在真核细胞特别是植物细胞(参见e.g.,WO95/34668和WO93/03161)中复制。
含有使宿主细胞中目的核酸表型表达减少的嵌合基因的重组DNA可以伴随嵌合标记基因，特别是当预计转基因稳定整合于宿主细胞的基因组时。嵌合标记基因可以含有标记DNA，其可操作的在其5′端连接于一个能够在目的宿主细胞中有功能的特别是植物可表达的启动子，优选的为一个组成性启动子，例如CaMV 355启动子，或者一个光诱导的启动子例如编码Rubisco小亚基的基因的启动子；以及其可操作的在其3′端连接于合适的植物转录体3′结构以及聚腺苷酸信号。预期标记DNA的选择是不重要的，任意的合适的标记DNA都可被利用。例如，一个标记DNA可以编码一种蛋白，其对被转化的植物细胞提供可分辨的颜色，例如Al基因(Meyer et at,1987)，可提供给被转化的植物细胞除草剂抗性，例如bar基因，编码对phosphinothricin的抗性(EP 0,242,246)，或可提供给被转化的细胞抗生素抗性，例如aac(6′)基因，编码对庆大霉素的抗性(W094/01560)。
含有能够减少目的基因表型表达的嵌合基因的重组DNA，可被稳定地合并到植物细胞的基因组中。基因转移可利用一个被解除的Ti质粒载体来进行，其中的质粒载体含有本发明的嵌合基因，并且被Agrobactedum携带。此转化可以利用例如EP 0116718中描述的方法来进行。
或者，任意类型的载体可被用于转化植物细胞，适用的方法例如直接的基因转移(例如EP 0233 247所述)，花粉介导的转化(例如EP 0270356,W085/01856及US4,684,611所述)，植物RNA病毒介导的转化(例如EP0067553以及US4,407,956所述)，脂质体介导的转化(如US4,536,475中所描述的)，等等。
其它的方法例如Fromrn等(1990)以及Gordon-Kamm等(1990)所述的对谷类的微粒轰击，也同样适合。单子叶植物的细胞，例如主要的谷类，也可用损伤的和/或酶降解的能够形成致密胚发生愈伤组织的致密胚发生组织，或如W092/09696所述的损伤的和/或降解的不成熟的胚被转化。所产生的转化的植物细胞可以通过常规的方法被用于重新产生转化的植物。
获得的转化植物可用于常规的繁殖方案产生更多的具有相同特性的转化植物或导入减少本发明的目的核酸的表型表达的嵌合基因到相同或相关植物种类的的其它品种中，或杂交植物中。由转化植物获得的种子含有本发明的嵌合基因作为一个稳定的基因组插入片段。
本发明的另一个目的是提供含有本发明所述的导致靶核酸表型表达减少的嵌合基因的真核细胞，优选的为植物细胞及生物体(优选的为植物)。
本发明的另一个目的是提供含有正常能被表型表达的目的核酸的植物细胞，其进一步含有具有包括下列核苷酸序列的RNA分子ⅰ．至少10个连续的与至少部分的目的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10个与至少10个连续的有义核苷酸的。核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的连续核苷酸且能够通过与有义核苷酸序列相关联形成双链RNA的反义核苷酸序列；其中当与该RNA分子不存在时相比，目的核酸的表型表达在该RNA分子的存在下显著地减少。RNA分子可以由嵌合DNA编码。有义和反义的核苷酸序列，特别是关于长度和序列的优选实施方案，如说明书的其它地方所述。
可以理解说明书所述的方法和措施也可以用在高通量筛选(HTS)方法中，用于鉴别或证实与迄今尚未在真核细胞中特别是在植物细胞中鉴定的功能的核酸序列的表达相关的表型。
此方法包括步骤1．选择当表达时带有未确认或未证实的功能/表型的目的核酸序列中的靶序列。优选地，如果核酸具有推定的开放阅读框架，靶序列应含有至少这些开放阅读框架之一的一部分。靶核酸序列的长度可在10个核苷酸到等同于未确认功能的目的核酸的长度(核苷酸)间变化。
2．根据本发明设计含有有义核苷酸和反义核苷酸序列的RNA分子。
3．导入含有以靶序列为基准设计的有义和反义核苷酸序列二者的RNA分子到合适的宿主细胞中，特别是植物细胞中，其含有带有迄今未确认表型的核苷酸序列的核酸。RNA可被直接导入，或通过嵌合DNA的方式被导入，其中的嵌合DNA含有在目的宿主细胞中有效的，特别是植物可表达的启动子以及一段在宿主细胞中起适宜的3｀端结构作用以及聚腺苷酸化信号功能的DNA区，两者之间还有一个DNA区，其能够被转录产生含有有义和反义核苷酸序列的RNA分子。嵌合DNA可被瞬时导入或整合到核基因组中。嵌合DNA也可在病毒载体上被提供(见，例如.,WO95134668以及WO93103161)4．通过合适的方法观察表型。依赖于所预料的表型，可以在单细胞中充分的观察或测定表型，但是也可能需要培养细胞获得(具有机体构造的)多细胞的水平，或甚至再生转基因生物体，特别是转基因植物。
在最直接的实施方案中，含有适用于本发明方法的至少部分的目的核酸的有义和反义核苷酸序列的RNA分子，能够通过克隆带有在合适的启动子下以反向重复方向(优选的被短的不含有转录终止信号并编码间隔序列的DNA区分隔开)存在的选择的靶序列的DNA区的两个拷贝来获得。然后，此嵌合DNA在体外转录方法中被用作模板DNA产生RNA分子，其被导入宿主细胞中或者嵌合DNA本身被导入到宿主细胞中。
本发明的方法和措施因此可被用于真核细胞或生物体特别是植物细胞或植物中的核酸表型表达的减少，来获得脱落抗性(WO97/13865)，获得改变的花色模型(EP522880,US5,231,020)，获得抗线虫植物(WO92/21757,WO93/10251,WO94/17194)，延迟果实成熟(WO91/16440,WO91/05865,WO91/16426,WO92/17596,WO93/07275,WO92/04456,US5,545,366)，得到雄性不孕(WO94/29465,W089/10396,WO92/18625),减少生物体中不需要的(次级的)代谢物的成熟，例如植物中葡萄糖酮醛盐(W097/16559)或叶绿素的含量(EP 779 364)，通过代谢工程在真核细胞或生物体中改变代谢物合成的途径，例如通过减少涉及碳水化合物代谢(WO92/11375,WO92/11376,US5,365,016,WO95/07355)或脂类的生物合成(WO94/18337,US5,530,192)的特定基因的表达，延迟衰老(WO95/07993)，改变植物的木质化(WO93/05159,WO93/05160)，改变棉花中纤维的品质(US5,597,718)，通过减少多酚氧化酶来增加马铃薯的压伤抗性(WO94/03607)，等。
当与利用传统的有义或反义核苷酸序列相比时，本发明的方法产生较好的结果和/或较高的效率以及可以相信其它的调节靶核酸表型表达的特异性序列机制可由本说明书描述的双链RNA分子存在而被涉及和/或被引发。
尤其是通过反义或有义的方法来减少植物细胞中转基因的表型表达的具体应用，已被描述用于恢复雄性的生育力，后者通过导入含有雄性不孕DNA的转基因来获得的(WO 94/09143,WO 91/02069)。目的核酸特异性地是雄性不孕DNA。再者，本发明所描述的方法和产物可被应用到这些方法中来达到较高效率的雄性生育力的恢复。
本发明的方法和措施，特别是那些涉及含有发夹RNA的RNA分子以及编码的嵌合基因的，已被证实特别适用于改变植物中特别是种子中油含量的组成。特别优选的植物是用于油料生产的农作物例如但不限于油籽油菜(oilseed rape)(Brassica juncea,napus,rapa,oleracea,campestris)，谷类，棉花，花生，向日葵，蓖麻籽，亚麻，椰子，亚麻籽，大豆。优选的靶基因为脱氢酶基因，特别Δl2脱氢酶编码基因例如由Fad2基因编码的，特别是其核苷酸序列可在注册号为AF 123460(来自Brassicacarinata),AF12042841(Brassica rapa),L26296(Arabidopsis thaliana)或A65102(Corylus avellana)的Genbank数据库中找到的基因。很显然，本领域的技术人员很容易地例如通过杂交和/或PCR技术从其它的种中获得同源于已公开的fad2基因的基因。
构建特别关于长度和序列的有义和反义核苷酸序列的优选实施方案也在说明书的其它位置描述。而且编码含有RNA分子的发夹的嵌合基因，特别关于启动子元件的优选实施方案也在说明书的其它位置描述。为了此应用，特别优选的启动子为种子特异性启动子。
在一个的优选的实施方案中，含有RNA分子的人工发夹RNA因此含有在有义方向编码Δl2脱氢酶ORF的部分以及在反义方向的相似部分，优选地被一段间隔序列分隔开。在一个特别优选的实施方案中，人工发夹RNA(或其编码嵌合基因)含有SEQ ID No 6的核苷酸序列或基于上述的Brassica fad2基因的类似构建的核苷酸序列。
优选的编码人工发夹RNA的嵌合基因在种子特异性启动子的调控下被转录，特别的在如本申请其它地方所述的FPI启动子的调控下。
在含有油类的植物中的Δl2脱氢酶基因表达的减少导致油酸的增加以及伴随的亚麻酸与亚油酸的减少。使用本发明的措施和方法较之于带有通常共抑制构建物的在转基因植物中，其中的显著的油酸增加以及伴随的亚麻酸与亚油酸减少的植物出现的频率更高。此外，增加的与减少的绝对水平分别地比带有通常的共抑制构建物的转基因植物中的更高或更低。
利用本发明的措施和方法，因此获得含有其在压榨和提取后有增加了的油酸含量(表示为总脂肪酸组成的百分比)的油的植物和种子是可能的，特别的当与对照植物比较时，有三倍的增加。
可以预料利用本发明的方法和措施，可获得转基因芸苔属(Brassica)植物，其种子中含有其中的油酸含量超过总脂肪酸含量的90％的油。
本发明的方法和措施将特别适用于在真核细胞或生物体，特别是在植物细胞和植物中获得病毒抗性，特别是极端病毒抗性。可被获得抗性的植物抵抗的病毒的非限制列表被描绘在表1中。
本发明的方法和措施进一步允许使用除了通常使用的外壳蛋白基因或复制酶基因外的至今从未用于获得病毒抗性植物的病毒基因。这些不同的病毒基因包括蛋白酶编码基因(Pro)基因组连接蛋白(Vpg)编码基因，细胞质包含体编码基因(Cl)作为靶核酸序列用来获得病毒抗性植物。
很显然，本发明特别适用于降低属于多基因家族的基因的表型表达。
很显然，本发明的方法和措施适合用于减少所有植物的所有植物细胞的核酸的表型表达。无论其是单子叶植物还是双子叶的植物，特别的为农作物例如担不限于谷类，稻，小麦，大麦，甘蔗，棉花，油菜籽，大豆，蔬菜(包括菊苣，芥属蔬菜，莴苣，西红柿)，烟草，马铃薯，以及甜菜，还有用于园艺，花卉栽培或林业上的植物。本发明的方法和措施特别适用于具有复合基因组的植物，例如多倍体的植物。
可以预料到由此处所述嵌合基因转录产生的嵌合RNA分子，可被传播到整个植物的全身，且因此减少被嫁接到含有本发明嵌合基因的转基因茎干上的植物的非转基因接穗的细胞中核酸的表型表达(或反之亦然)是可能的，此方法对园艺，葡萄栽培或水果生产可能是重要的。
下述的非限制实施例描述了用于减少真核细胞中目的核酸的表型表达的嵌合基因的构建以及这些基因的应用。除非另有说明，否则在实施例中，所有的重组DNA技术通过描述在Sambrook et aL(1989)分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约以及在Ausubel等卷1和2(1994)现代分子生物学方法，现代方法，USA，上的标准方法来进行。植物分子工程的标准材料和方法被描述在植物分子生物学Labfax中(1993)R.D.D.Croy，由BIOS Science Publications Ltd(UK)以及Blackwell Scientific Publications,UK.共同出版。
在说明书以及实施例中引用的序列如下SEQ ID NO 1用于不同有义和反义构成物的构建获得病毒抗性的Nia基因的马铃薯Y病毒片段的序列。
SEQ ID NO 2实施例1中Gusd CoP构成物的编码区的序列。
SEQ ID NO 3来自Johnsongrass花叶病毒的被修饰的5′未翻译区的序列。
SEQ ID NO 4带有S7增强子的地下三叶草病毒启动子No 4的序列。
SEQ ID NO 5地下三叶草病毒二倍增强子启动子No 4的序列。
SEQ ID NO 6用于Δ12脱氢酶基因表达抑制的CoP构建物的序列。
SEQ ID NO 7 Flaveri trinervia丙酮酸正磷酸二激酶内含子的序列。
下列自由原文被包含在序列表中<223>NIa ORF的片段<223>人工序列的说明Gusd CoP构成物的编码区<223>缺陷的Gus编码区
<223>反义于Gus编码区的5′末端<223>人工序列的说明Johnson花叶病毒的5′UTR<223>人工序列的说明带有S7增强子的地下三叶草病毒S4启动子<223>人工序列的说明带有S4增强子的地下三叶草病毒启动子S4<223>人工序列的说明脱氢酶CoP构建物的编码区<223>对应于Δ12脱氢酶(fad2)编码区的5′末端，在有义方向<223>对应于Δ12脱氢酶(fad2)编码区的5′末端，在反义方向<223>人工序列的说明Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶内含子2下面实施例的描述是为了更全面地阐明本发明的优选实施方案。然而它们不应被解释为对本发明的宽范围的限制。
实施例1实验步骤基因构建标准的基因克隆方法(Sambrook等1989)被用于产生嵌合基因。所用构建物的图示见图ⅠA和ⅠB中。
这些构建物的成分为*自Cabb-JI(35S)分离物的花椰菜花叶病毒35S启动子(Harpster等，1988)*章鱼碱合酶终止子(ocs-t)(MacDonald等，1991)*地下三叶草病毒启动子No 4(S4)(WO 9606932)
*地下三叶草病毒终止子No 4(s4t)(WO 9606932)*地下三叶草病毒双倍增强子启动子No 4(S4S4)(SEQ ID NO 5)*带有S7增强子的地下三叶草病毒启动子No 4(S7S4)(SEQ ID NO4)*玉米遍在蛋白启动子(Ubi)(Christensen与Quail,1996)*农杆菌属肿大形态基因Ⅰ终止子(tml｀)(Zheng等，1991)*马铃薯Y病毒澳大利亚株的Nia基因(Nia)(SEQ ID NO 1)*机能障碍β-葡萄糖醛酸酶开放阅读框编码DNA(Gusd)(SEQ IDNO 2从核苷酸1到核苷酸1581)*得自Johnsongrass花叶病毒的修饰的5′未翻译区(5′UTR)(JGMV5′)(SEQ ID NO 3)。
其含有在ATG起始密码子处的NcoⅠ位点插入以及随后的框架中的三个终止密码子，和Pstl位点(内含子的插入如
图1A中的构建物4和5)。在
图1A的载体构建物2和6中，Gusd开放阅读框架被插入在Ncol位点中，除去该终止密码子；在
图1A的所有其它构建物中，在Pstl位点的下游被插入。
*被Wang等修饰的蓖麻子过氧化氢酶内含子(Ohta等，1990)(1997)(“内含子”)。
嵌合基因通过可操作的装配图示于
图1A或
图1B的不同部分并且在左边T-DNA的边缘与嵌合植物可表达的neo基因之间插入获得的在T-DNA载体pART27与pART7载体(Gleave,1992)中的嵌合基因被构建。
编码机能障碍β葡萄糖醛酸酶开放阅读框架(GUSd)的DNA通过删除两个EcoRV限制位点间的gus编码区的序列被获得。为了构建编码含有β葡萄糖醛酸酶基因有义和反义核苷酸序列的RNA分子的嵌合基因，一段序列被加至Gusd基因以允许5′末端的超过558个碱基进行碱基配对产生SEQ ID NO 2所述的序列。此序列在玉米遍在蛋白质启动子和tml′终止子间被克隆并被插入到T-DNA载体中。
所构建的T-DNA载体含有第一和第二嵌合病毒抗性基因，其中的第一嵌合基因由以下成分构成1．CaMV35S启动子序列，偶联于2．在有义方向，来自PVY的核苷酸序列，其编码·Vpg蛋白质(参见例如.,Genbank注册号Nr ZZ9526的1013核苷酸到1583核苷酸)，或·部分Cl蛋白质(参见例如.,Genbank注册号Nr M95491的3688核苷酸到4215核苷酸)或·蛋白酶(Pro)(参见.例如，EMBL注册号Nr D00441的从5714核苷酸到7009核苷酸)，以及随后的3．得自如上所述的地下三叶草花叶病毒的S4终止子，第二嵌合基因由如下成分构成1．如上所述的S4启动子，偶联于2．在反义方向，来自PVY的核苷酸序列，其编码·Vpg蛋白质，或·Cl蛋白质，或·蛋白酶，以及随后的3．如上所述章鱼碱合酶终止子。
一个T-DNA载体中的有义和反义序列来自相同的PVY编码区，同样地，被构建用于改变油中脂肪酸组成的T-DNA载体(见图2)，含有1．一个FPI启动子(载短的种子特异性napin启动子)含有-309与+1之间的序列，如Stalberg等描述的；连接于2．SEQ ID No 6的核苷酸序列，其在有义和反义方向含有位于编码来自Arabidopsis thaliana的Δ12脱氢酶的ORF(Fad2)的5｀处的480bp，被一个623bp间隔序列连接；以及随后的3．胭脂碱合酶基因的终止子。
此外，构建T-DNA载体来评价编码CoP构建体的嵌合基因中的内含子序列存在的影响。为此，产生的构建物含有
1．CamV35S启动子，以及2．在有义方向来自PVY的蛋白酶编码ORF；3．SEQID No 7序列(编码Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶的内含子2)4．在反义方向来自PVY的蛋白酶编码ORF；以及5．章鱼碱合成酶基因终止子。
植物转化Nicotiana tabacum(W38)组织被转化和再生成整个植株，如Landsman等人(1988)所述。稻(Oryza sativa)基本上如Wang等所述的被转化(1997)。
稻的超转化来自表达GUS和潮霉素磷酸转移酶(HPT)活性的稻类植物的成熟胚被从成熟的种子中切除并置于愈伤组织诱导培养基上7周。从这些培养物中回收愈伤组织，用含有不同二元载体构建物的农杆菌培养2天，然后放置在含有潮霉素，bialaphos以及TimentinTM的愈合组织培养基上。在接下来的四个星期中，潮霉素与bialaphos抗性的愈伤组织发育。在被测定GUS活性之前，这些愈合组织系被维持在含有潮霉素及bialaphos的培养基上2个月。
GUS测定通过使用基本上如Jefferson等人描述(1987)的组织化学染色X-葡糖苷酸或萤光基质4-甲基-伞形酮葡糖苷酸(MUG)检测稻愈伤组织中的GUS活性。
实施例1仅含有反义，仅含有有义，或有义与反义(互补配对(CoP))序列均含有的嵌合基因对整合的β-葡萄糖醛酸酶基因的表型表达的减少的比较表达来自单个转基因的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)(和来自hph基因的潮霉素抗性)的转基因水稻组织利用含有赋予膦丝菌素抗性的bar基因以及不同的有义，反义和来源于缺损的GUS(GUSd)基因的CoP构建物(见
图1A)的载体超转化。超转化的组织被维持在潮霉素以及bialaphos选择性培养基3个星期，然后用于GUS的活性分析。利用缺损的GUS基因从而该基因的表达不会叠加在内源性GUS活性上。
表2中的图表示MU的产率，其通过365nm处激发200μl的反应体积中的总蛋白为1.5μg并在455nm处测量吸收来测得。产率在37℃下30分钟内测得。非转基因水稻愈伤组织的读数为0.162。跟在被导入的构建体的描述后的括号内的数字参见
图1A，结果(表2)表明用不具有GUSd基因的具有的bar基因的二元载体的超转化对内源GUS活性无沉默作用。在有义或反应方向带有GUSd，带有或不带有内含子或早期终止密码子的超转化，显示出内源GUS活性一定程度的减少(大约被分析愈伤组织的25％)(参见表2的最后两行，代表用MUG试验测到的少于2.000的被分析愈伤组织的百分比)。然而，带有CoP构建物的超转化在大约75％到100％被分析的愈伤组织中，内源GUS活性减少了。此CoP构建物被设计为产生的mRNA的3′端的能够与转录体的5｀端形成双链从而产生“锅柄”结构。
这些数据表明一个互补配对能够使用一个自身退火的转录体产生，这种设计比传统的有义或反义构建物更有效，并且该方法可被用于降低植物细胞中出现的基因的表型表达。
表2．超转化水稻愈伤组织的MUG测定
实施例2．利用只含有反义基因，只含有有义基因，或二基因同时存在的嵌合基因获得转基因植物中病毒抗性的效率比较利用在有义方向，反义方向以及在互补配对(CoP)方向的PVY蛋白酶编码序列(SEQ ID NO 1)进行基因构建，其中T-DNA包括在它们自身的启动子调控下的有义和反义嵌合基因。在所有的三种安排中，CaMV35S启动子被利用。制备5种不同类型的CoP构建物，其中第二个启动子为CaMV35S启动子，S4启动子，二倍S4启动子，S7增强的S4启动子，或维管特异性rolC启动子(见
图1B)。
这些构建物被转化到烟草(通过农杆菌介导的DNA转移)中并且每个嵌合基因构建物有大约25个独立转化植株被收获得。转基因植株被移栽到土壤并且在温室中培育。移植到土壤中大约一个月后，利用标准的实验方法，人工接种马铃薯Y病毒。2到4周后，记录植物的病毒症状。结果表明一个月后，仅含有有义基因27株中的2株，以及只含有反义基因25株中的1株没有症状。
分别形成对照的是，含有有义和反义基因的24株中的11株(35S-Nia/S4-反义Nia构建体)，25株中的7株(35S-Nia/RolC-反义Nia构建物)，27株中的10株(35S-Nia/35S-反义Nia)，26株中的7株(35S-Nia/S4S4-反义Nia构建物)，和25株中的7株(35S-Nia/S7S4-反义Nia构建物)没有显示症状。没有显示症状的植物被认为对PVY显现出极端的抗性。进一步监控2个月后，其继续不显示症状(在表3中显示为极端抗性(ER))。一些其它的植物，特别是那些含有CoP构建物的，表现出延迟及有限制性症状。在接种2周后不表现症状，但是在4周后有一些植物显示出微小的损伤。这些植物显著地比非转基因或易感烟草受PVY的影响少得多并且被记为有抗性(在表3中显示为ER*)。
表3含有有义嵌合PVY蛋白酶构建物，反义嵌合PVY蛋白酶构建物，或二者(不同的CoP构建物)的转基因烟草植株对PVY感染的抗性。
这些数据表明使用CoP构建物比通过利用单独的有义或反义构建物产生具有极端抗性和抗性的转基因植物的频率高得多。
然后，病毒抗性转基因植物中转基因的拷贝数被测定。因此，DNA被从所有显示极端抗性或抗性的转基因植物中提取。DNA也可以从每一构建体的5株易感植物中提取。DNA被通过Southern分析测定其基因拷贝数。数据(表4)显示了表现出极端抗性的一些CoP植物的基因组，特别是35S-Nia/S4-反义Nia植物，仅仅含有单拷贝的基因构建物。表4极端抗性，抗性以及易感的植物的含有有义嵌合PVY蛋白酶构建体，反义嵌合PVY蛋白酶构建体，或二构建体(不同的CoP构建体)的转基因的拷贝数
实施例3实施例2中的植物极端抗性的遗传实施例2中的植物被允许自我受精并且收集其种子。来自显示出极端抗性与CoP构建物35S-Nia/S4-反义Nia和35S-Nia/35S-反义Nia的低基因拷贝数植物的种子，以及来自显示极端抗性的有义和反义植物的种子，被置于温室中萌芽和发育。也种植收集自两个易感CoP株系，两个易感仅含有有义基因的株系，两个易感仅含有反义基因的株系的种子的植株。筛选来自每一株系的总的同一大小与发育阶段的20株植株，被分别置入盆中，允许其恢复一周，然后用PVY接种。在接种后2,4以及7周记录植物的病毒症状。结果(表5)显示所用8个含有一个或两个基因拷贝的355-Nia/S4-反义Nia与35S-Nia/35S-反义Nia的植物株系显示出大约3∶1的极端抗性∶易感的分离比率。仅含有单个反义基因的在T0有极端抗性株系的子代与含有一个基因拷贝的极端抗性有义植物的子代，产生了异常的分离比率(2∶18,ER∶易感的)。显示极端抗性和含有6个基因拷贝的有义植物的子代显示大约3∶1的比率(ER∶易感的)。所有的易感T0植物的子代显示对PVY的完全易感。
这些数据表明来自CoP构建体的极端抗性产生了抗性的稳定表达，其通过孟德尔途径被遗传。其也显示了在这些株系中PVY CoP基因座在赋予极端抗性方面是～100％有效的，而在反义株系以及两个有义株系之一中的转基因座在赋予极端抗性上仅仅是部分有效的。
表5．
实施例4带有转基因植物中不同基因座的不同成分(有义基因和反义基因)的极端病毒抗性转基因烟草。
含有有义转基因(其含有单基因拷贝；见表6)的PVY易感性植物与含有反义转基因(其也通过Southern分析分析拷贝数；见表6)的PVY易感性植物杂交。每一杂交的20个子代被繁殖在温室中，然后PVY接种并如实施例2中所述记录病毒感染。杂交(含有单基因/基因座的植株间)的子代将被期望出现下列的比率1/4含单独有义基因的，1/4含单独反义基因的，1/4含有义和反义基因都有的，以及1/4根本不含基因的。结果(表4)显示，有一个例外，一定比例的所有成功杂交的子代显示出极端抗性，然而没有来自自交的有义或反义植物的子代显示出极端抗性。从含有8个反义基因拷贝的亲代植株反义2(As2)中获得一个没有产生极端抗性子代的杂交。来自有义1I(S1)(雄性)x反义1(Asl)(雌性)以及有义3(S3)(雌性)x反义4(AS4)(雄性)的杂交的所有20个子代植株通过Southem分析被检测。结果显示在两种杂交中，显示极端抗性(或在个案抗性)的植株含有有义和反义基因，然而，不携带转基因(裸)，或携带单独的有义或反义基因的植株全部对PVY易感。为了进一步证实植物中的互补配对(有义与反义基因)对与极端抗性之间的绝对的相互关系，所有显示极端抗性的植株被通过Southern印迹法来分析。结果显示每一种极端抗性或抗性植株都含有有义和反义两种基因。
这些数据表明互补配对对产生了抗性或极端抗性，即使当编码有义和反义基因的基因并不共同位于基因组中。“互补配对现象”并不简单的取决于增加的转基因量，因为可以预料自交的后代的1/4将是纯合的并且因此具有了双倍的基因量，然而它们仍是易感的。
表6在含有35S-有义Nia基因(S-株系)的易感转基因烟草植株与含有35S-反义Nia基因(As-株系)的易感转基因烟草植株杂交产生的子代植株中的PVY抗性。
极端抗性植株在7周后没有显示出PVY感染症状。抗性植株在PVY感染7周后显示微小的损伤。S1,S2,S3,S4和S5是含有35S-有义Nia基因构建物的PVY易感转基因烟草植株，其中都具有一个拷贝的整合转基因。
As1,As2,As4以及As5是含有35S-反义Nia基因构建物的PVY易感转基因烟草植株，其分别具有1,8,2和1个拷贝的被整合的转基因。
实施例5不同病毒基因作为靶核酸序列在获得极端病毒抗性基因中的应用的评价含有基于得自本申请所述的PVY的蛋白酶，Vpg或Cl蛋白的编码区的序列的第一和第二嵌合病毒抗性基因的T-DNA载体被用于获得转化的烟草植株，其随后用PVY攻击。结果被概括在下列表中
表7．
实施例6内含子增强的沉默含有其中的内含子(Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶内含子2)在有义或反义方向被插入到与PVY(如本申请其它地方所述的)的蛋白酶编码ORF相对应的有义与反义序列之间的编码CoP构建物的嵌合基因的T-DNA载体被用于获得转化的烟草植株，其随后被用PVY攻击。结果被概括在下列表中表8．
实施例7．在拟南芥属(Arabidopsis)中使用CoP构建体来改变油的分布改变如本申请其它地方所述的从被压碎种子提取的油中脂肪酸组成的T-DNA载体被用于导入编码CoP构建物的嵌合基因来减少拟南芥(Arabidopsis thallana)中Δ12脱氢酶基因(Fad2)的表达(见图2A；SEQ ID No 6)。
为了比较效率，转基因拟南芥属植株被产生，其中的Fad2基因表达通过一个普通共抑制构建体被减少，其中的构建体含有连接来自拟南芥的Δ12脱氢酶基因(Fad2)的完全ORF以及胭脂氨酸合酶启动子(见图2B)的FPI种子特异性启动子。
作为对照植株，用不相关的T-DNA构建体转化的转基因拟南芥属被使用。
种子被收获，压榨和提取且通过本领域的有效的方法检测主要脂肪酸在油中的百分比。结果是两种读数的平均值，被概括在表9中。
表9
结果的分析表明带有CoP构建体的转基因植物(在表中显示为“发夹x.x”)具有其中显著的油酸的增加以及伴随的亚麻酸和亚油酸的减少的含油植物的频率比带有共抑制构建体的转基因植物中的频率更高。此外，增加与减少的绝对水平分别高于或低于在带有共抑制构建体的转基因植物中的。
实施例8在芸苔属(Brassica)中使用CoP构建体来改变油的分布带有编码实施例6中描述的CoP构建物的嵌合基因的T-DNA载体被导入到芸苔属油籽油菜中。从转基因芸苔中收获的种子被压榨和提取油且分析油中脂肪酸的组成。
来自带有CoP构建物的转基因芸苔中的油有显著地油酸含量的增加以及亚油酸和亚麻酸含量的减少。带有编码CoP构建物的嵌合基因的T-DNA被构建并导入到Brassica油菜籽中，其中的CoP构建物类似于实施例6中描述的，但是其中的与Δ12脱氢酶编码ORF相关的有义和反义区的序列是以来自芸苔的同源ORF为基准的。
同源于来自拟南芥属的Δ12脱氢酶编码ORF的芸苔ORF的序列可从Genbank数据库中的目录号nrs AF042841和AF 124360得到。
从转基因芸苔中收获的种子被压榨和提取油且分析油中脂肪酸的组成。来自带有CoP构建物的转基因芸苔中的油有显著地油酸含量的增加以及亚油酸和亚麻酸含量的减少。
实施例9亚麻中内源锈病抗性基因的抑制用于内源锈病抗性基因抑制的CoP构建物被构建，其由如下成分构成1．CaMV35S启动子；可操作地连接于2．部分的在有义方向的来自亚麻(大约1500bp长)的内源锈病抗性基因(n)；连接到
3．在反义方向的来自亚麻(大约1450bp长)内源锈病抗性基因的类似部分，因此产生了没有间隔序列的完美的反向重复序列，其中的每一重复序列大约1450bp长；以及4．nos终止子。
通过在CaMV35S启动子和nos终止子间插入上述3中的类似片段产生普通的反义构建物。
含有n基因(其产生对亚麻锈病菌株的抗性)的亚麻植株通过这些CoP和反义构建物被转化。如果抑制产生了，植株变的对锈病菌株易感。如果构建物没有影响，转化的植株保留对锈病菌株的抗性。
结果ngc-b有义/反义7个中3个被抑制ngc-b反义 12个中0个被抑制尽管本发明在此通过引用不同的具体材料，方法以及实施例来描述和例证，但可以理解本发明不限于特定的材料，材料的组合，以及用于此目的所选择的方法。此详述的很多的变化形式可被应用以及被本领域的技术人员所理解。
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2186<210>3<211>208<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Johnson花叶病毒的5′UTR<400> 3cgccccgggc ccaacacaac acaacagaac ctacgtcaat tgattttatc aatcgcaaag 60ccttacaaag atcttcgcag tcgttcatca acagattcac cgaaccattc ttgttagctc 120tcgcacagag ataagcagga aaccatggca ggtgagtgga acacagtttg atagtaagag 180aaaccagagg aagactgcag gtacccgc208<210>4<211>1150<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述带有S7增强子的地下三叶草病毒S4启动子<400>4aatctgcagc ggccgcttaa tagtaattat gattaattat gagataagag ttgttattat 60gcttatgagg aataaagaat gattaatatt gtttaatttt attccgcgaa gcggtgtgtt 120atgtttttgt tggagacatc acgtgactct cacgtgatgt ctccgcgaca ggctggcacg 180gggcttagta ttaccccgtg ccggatcaga gacatttgac taaatattga cttggaataa 240tagcccttgg attagatgac acgtggacgc tcaggatctg tgatgctagt gaagcgctta 300agctgaacga atctgacgga agagcggaca tacgcacatg gattatggcc cacatgtcta 360aagtgtatct ctttacagct atattgatgt gacgtaagat gctttacttc gcttcgaagt 420aaagtaggaa attgctcgct aagttattct tttctgaaag aaattattta attctaatta 480aattaaatga gtcgctataa atagtgtcga tgctgcctca catcgtattc ttcttcgcat 540cgtctgttct ggttttaagc gggatccagg cctcgagata tcggtacctt gttattatca 600ataaaagaat ttttattgtt attgtgttat ttggtaattt atgcttataa gtaattctat 660gattaattgt gaattattaa gactaatgag gataataatt gaatttgatt aaattaactc 720tgcgaagcta tatgtctttc acgtgagagt cacgtgatgt ctccgcgaca ggctggcacg 780gggcttagta ttaccccgtg ccgggatcag agacatttga ctaaatgttg acttggaata 840atagcccttg gattagatga cacgtggacg ctcaggatct gtgatgctag tgaagcgctt 900aagctgaacg aatctgacgg aagagcggac aaacgcacat ggactatggc ccactgcttt 960attaaagaag tgaatgacag ctgtctttgc ttcaagacga agtaaagaat agtggaaaac 1020gcgtaaagaa taagcgtact cagtacgctt cgtggcttta tataaatagt gcttcgtctt 1080attcttcgtt gtatcatcaa cgaagaagtt aagctttgtt ctgcgtttta atgatcgatg 1140gccagtcgac1150<210>5<211>1052<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述带有S4增强子的地下三叶草病毒S4启动子<400>5ggatccaggc ctcgagatat cggtaccttg ttattatcaa taaaagaatt tttattgtta 60ttgtgttatt tggtaattta tgcttataag taattctatg attaattgtg aattattaag 120actaatgagg ataataattg aatttgatta aattaactct gcgaagctat atgtctttca 180cgtgagagtc acgtgatgtc tccgcgacag gctggcacgg ggcttagtat taccccgtgc 240cgggatcaga gacatttgac taaatgttga cttggaataa tagcccttgg attagatgac 300acgtggacgc tcaggatctg tgatgctagt gaagcgctta agctgaacga atctgacgga 360agagcggaca aacgcacatg gactatggcc cactgcttta ttaaagaagt gaatgacagc 420tgtctttgct tcaagacgaa gtaaagaata gtggaaaacg cgtggatcca ggcctcgaga 480tatcggtacc ttgttattat caataaaaga atttttattg ttattgtgtt atttggtaat 540ttatgcttat aagtaattct atgattaatt gtgaattatt aagactaatg aggataataa 600ttgaatttga ttaaattaac tctgcgaagc tatatgtctt tcacgtgaga gtcacgtgat 660gtctccgcga caggctggca cggggcttag tattaccccg tgccgggatc agagacattt 720gactaaatgt tgacttggaa taatagccct tggattagat gacacgtgga cgctcaggat 780ctgtgatgct agtgaagcgc ttaagctgaa cgaatctgac ggaagagcgg acaaacgcac 840atggactatg gcccactgct ttattaaaga agtgaatgac agctgtcttt gcttcaagac 900gaagtaaaga atagtggaaa acgcgtaaag aataagcgta ctcagtacgc ttcgtggctt 960tatataaata gtgcttcgtc ttattcttcg ttgtatcatc aacgaagaag ttaagctttg 1020ttctgcgttt taatgatcga tggccagtcg ac 1052<211>1583<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述脱氢酶CoP构建体的编码序列<221>misc_特征<222>(1)..(480)<223>在有义方向，对应于Δ12脱氢酶(fad2)编码区的5′末端<220><221>misc_特征<222>(1101)..(1583)<223>在反义方向，相应于Δ12脱氢酶(fad2)编码区的5′末端<400>6atcattatag cctcatgctt ctactacgtc gccaccaatt acttctctct cctccctcag 60cctctctctt acttggcttg gccactctat tgggcctgtc aaggctgtgt cctaactggt 120atctgggtca tagcccacga atgcggtcac cacgcattca gcgactacca atggctggat 180gacacagttg gtcttatctt ccattccttc ctcctcgtcc cttacttctc ctggaagtat 240agtcatcgcc gtcaccattc caacactgga tccctcgaaa gagatgaagt atttgtccca 300aagcagaaat cagcaatcaa gtggtacggg aaatacctca acaaccctct tggacgcatc 360atgatgttaa ccgtccagtt tgtcctcggg tggcccttgt acttagcctt taacgtctct 420ggcagaccgt atgacgggtt cgcttgccat ttcttcccca acgctcccat ctacaatgac 480cgagaacgcc tccagatata cctctctgat gcgggtattc tagccgtctg ttttggtctt 540taccgttacg ctgctgcaca agggatggcc tcgatgatct gcctctacgg agtaccgctt 600ctgatagtga atgcgttcct cgtcttgatc acttacttgc agcacactca tccctcgttg 660cctcactacg attcatcaga gtgggactgg ctcaggggag ctttggctac cgtagacaga 720gactacggaa tcttgaacaa ggtgttccac aacattacag acacacacgt ggctcatcac 780ctgttctcga caatgccgca ttataacgca atggaagcta caaaggcgat aaagccaatt 840ctgggagact attaccagtt cgatggaaca ccgtggtatg tagcgatgta tagggaggca 900aaggagtgta tctatgtaga accggacagg gaaggtgaca agaaaggtgt gtactggtac 960aacaataagt tatgagcatg atggtgaaga aattgtcgac ctttctcttg tctgtttgtc 1020ttttgttaaa gaagctatgc ttcgttttaa taatcttatt gtccattttg ttgtgttatg 1080acattttggc tgctcattat gttcagtaac atctaccctc gcaacccctt ctttaccgtt 1140cgcttgggca gtatgccaga cggtctctgc aatttccgat tcatgttccc ggtgggctcc 1200tgtttgacct gccaattgta gtactacgca ggttctccca acaactccat aaagggcatg 1260gtgaactaac gactaaagac gaaaccctgt ttatgaagta gagaaagctc cctaggtcac 1320aaccttacca ctgccgctac tgatatgaag gtcctcttca ttccctgctc ctccttcctt 1380accttctatt ctggttgaca cagtaggtcg gtaaccatca gcgacttacg caccactggc 1440gtaagcaccc gatactgggt ctatggtcaa tcctgtgtcg gaactgtccg ggttatctca 1500ccggttcggt tcattctctc tccgactccc tcctctctct tcattaacca ccgctgcatc 1560atcttcgtac tccgatatta cta 1583<210>7<211>786<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Flaveria trinervia丙酮酸正磷酸二激酶的内含子2<400>aagcttggta aggaaataat tattttcttt tttcctttta gtataaaata gttaagtgat 60gttaattagt atgattataa taatatagtt gttataattg tgaaaaaata atttataaat 120atattgttta cataaacaac atagtaatgt aaaaaaatat gacaagtgat gtgtaagacg 180aagaagataa aagttgagag taagtatatt atttttaatg aatttgatcg aacatgtaag 240atgatatact agcattaata tttgttttaa tcataatagt aattctagct ggtttgatga 300attaaatatc aatgataaaa tactatagta aaaataagaa taaataaatt aaaataatat 360ttttttatga ttaatagttt attatataat taaatatcta taccattact aaatatttta 420gtttaaaagt taataaatat tttgttagaa attccaatct gcttgtaatt tatcaataaa 480caaaatatta aataacaagc taaagtaaca aataatatca aactaataga aacagtaatc 540taatgtaaca aaacataatc taatgctaat ataacaaagc gcaagatcta tcattttata 600tagtattatt ttcaatcaac attcttatta atttctaaat aatacttgta gttttattaa 660cttctaaatg gattgactat taattaaatg aattagtcga acatgaataa acaaggtaac 720atgatagatc atgtcattgt gttatcattg atcttacatt tggattgatt acagttggga 780aagctt78权利要求
1．一种减少正常能够在真核细胞中表达的目的核酸的表型表达的方法，包括导入含有下列可操作地连接的部分的嵌合DNA的步骤a)启动子，在所述的真核细胞中有效；b)DNA区，当被转录时产生一种含有能够形成一种人工茎环结构的RNA区的RNA分子，其中茎环结构的退火RNA序列之一含有与所述目的核酸的至少部分核苷酸序列基本上相似的序列，而其中的第二个所述的退火RNA序列含有与所述目的核酸的至少部分所述核苷酸序列的至少部分互补序列基本上相似的序列；以及任选地c)涉及转录终止及聚腺苷酸化的DNA区。
2．一种减少正常能够在真核细胞中表达的目的核酸的表型表达的方法，包括导入含有下列可操作地连接的部分的嵌合DNA的步骤a)启动子，在所述的真核细胞中有效；b)DNA区，当被转录时产生一种具有包括如下的核苷酸序列的RNA分子ⅰ．至少10个连续的与至少部分的所述目的核酸的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10个与所述有义核苷酸的所述至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的连续核苷酸的反义核苷酸序列；其中的RNA能够通过在带有有义和反义核苷酸序列的区域间的碱基配对从而至少所述的有义序列的10个连续核苷酸与所述的反义序列的10个连续核苷酸进行碱基配对形成一种带有双链RNA茎的人工发夹RNA结构；以及任选地c)．涉及转录终止及聚腺苷酸化的DNA区。
3．如权利要求2所述的方法，其中的所述RNA分子进一步含有位于所述有义和反义核苷酸序列之间的间隔核苷酸序列。
4．如权利要求2所述的方法，其中所述的有义核苷酸序列含有至少约550个连续的与所述核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸。
5．如权利要求2所述的方法，其中所述的目的核酸是整合到所述真核细胞基因组中的基因。
6．如权利要求5所述的方法，其中所述基因是一个内源基因。
7．如权利要求5所述的方法，其中所述基因是一个外源基因。
8．如权利要求2所述的方法，其中所述嵌合DNA被稳定地整合到DNA的基因组中。
9．如权利要求5所述的方法，其中所述目的核酸包含在感染病毒的基因组中。
10．如权利要求9所述的方法，其中所述感染病毒是RNA病毒。
11．根据权利要求1的方法，其中的真核细胞是植物细胞。
12．如权利要求11所述的方法，其中所述植物细胞被包含在植物中。
13．一种减少正常能够在真核细胞中表达的目的核酸的表型表达的方法，包括导入含有至少一个具有一种核苷酸序列的RNA区的嵌合RNA分子的步骤，其中核苷酸序列包括ⅰ．至少10个连续的与至少部分的目的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10个与所述的有义核苷酸的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的连续核苷酸的反义核苷酸序列；其中的RNA区能够通过在带有有义和反义核苷酸序列的区域间的碱基配对从而至少所述有义序列的10个连续的核苷酸与所述反义序列的10个连续核苷酸进行碱基配对形成一个带有一个双链RNA茎的人工发夹RNA结构。
14．一种减少植物细胞中目的基因的基因表达的方法，所述的方法包括导入一个连接在重组DNA上的第一和第二嵌合DNA从而两个嵌合DNA被一起整合到转基因植物细胞的核基因组中的步骤；其中所述的第一嵌合DNA含有下列的可操作地连接的部分a)植物可表达的启动子；b)能够被转录成具有含有至少10个连续的与所说目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列的核苷酸序列的有义RNA分子的第一DNA区域；以及任选地c)在植物细胞中涉及转录终止与聚腺苷化功能行使的DNA区域；和其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)植物可表达的启动子；b)能够被转录成具有含有包括至少10个连续的与所述有义核苷酸序列的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域；以及任选地c)在植物细胞中涉及转录终止与聚腺苷化功能行使的DNA区域；其中所述的有义和反义RNA分子能够通过在互补的区域间的碱基配对形成双链RNA。
15．一种获得病毒抗性真核生物的方法，所述方法含有步骤提供第一和第二嵌合DNA给所述生物的细胞，其中所述的第一嵌合DNA含有下列的可操作地连接的部分a)在所述细胞中有效的启动子；b)能够被转录成具有含有至少10个连续的与能感染所述生物的病毒基因组的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列的核苷酸序列的有义RNA分子的第一DNA区域；以及任选地c)在所述细胞中涉及转录终止与聚腺苷化功能行使的DNA区域；以及其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)在所述细胞中有效的启动子；b)能够被转录成具有包括含有至少10个连续的与所述有义核苷酸序列的所述至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域；以及任选地c)在所述细胞中涉及转录终止与聚腺苷化功能行使的DNA区域；以及其中所述的有义和反义RNA能够通过在互补的区域间的碱基配对形成双链RNA。
16．如权利要求15所述的方法，其中所述的生物是植物。
17．如权利要求16所述的方法，其中通过含有所述第一或第二嵌合DNA的亲本杂交来提供给所述植物的所述细胞第一和第二嵌合DNA。
18．如权利要求16所述的方法，其中通过用所述第一和第二嵌合DNA转化植物细胞，并且从所述的转化植物细胞再生植物给所述植物的所述细胞提供第一和第二嵌合DNA。
19．如权利要求16所述的方法，其中所述第一和第二嵌合DNA被分别整合到所述植物细胞的所述核基因组中。
20．如权利要求16所述的方法，其中所述第一和第二嵌合DNA被连接于一个重组DNA上从而两种嵌合DNA被一起整合到转基因植物细胞的核基因组中。
21．一种鉴定与真核细胞中的目的核酸的表达相关的表型的方法，所述的方法包括a．在所述的目的核苷酸序列中选择，至少10个连续核苷酸的靶序列；b．设计一段与所选的靶序列的长度相符并且与所选的靶序列有至少75％到100％的序列同一性的有义核苷酸序列；c．设计一段反义核苷酸序列，其ⅰ．与所述有义核苷酸序列的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有至少大约75％到100％的序列同一性；ⅱ．含有一段与所述有义核苷酸序列的一部分的互补序列有100％序列同一性的至少10个连续的核苷酸的序列；d．导入含有所述有义和反义核苷酸序列的RNA分子到含有包括迄今尚未确定表型的核苷酸序列的核酸的合适的真核细胞中；以及e．通过合适的方法观察该表型。
22．一个真核细胞，含有目的核酸，其正常能被表型表达，进一步含有包含下列可操作地连接部分的嵌合DNA分子a)启动子，在所述的真核细胞中有效；b)DNA区，当被转录时，产生带有至少一种具有一种核苷酸序列的RNA区的RNA分子，其中核苷酸序列含有ⅰ．至少10个连续的与至少部分的所述目的核酸的核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10个与所述有义核苷酸序列的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有大约75％到100％序列同一性的连续核苷酸的反义核苷酸序列；其中的RNA能够通过在带有有义和反义核苷酸序列的区域间的碱基配对形成一个带有一个双链RNA茎的人工发夹RNA结构；以及任选地c)涉及转录终止及聚腺苷酸化的DNA区，其中所述目的核酸的表型表达被显著地减少。
23．真核细胞，含有目的核酸，其正常能被表型表达，进一步含有包含至少一个具有一种核苷酸序列的RNA区的嵌合RNA分子，其中的核苷酸序列含有ⅰ．至少10个连续的与目的核酸的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列；和ⅱ．含有至少10个与所述有义核苷酸序列的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有大约75％到100％序列同一性的连续核苷酸的反义核苷酸序列；其中的RNA能够通过在带有有义和反义核苷酸序列的区域间的碱基配对从而至少所述的有义序列的10个连续核苷酸与所述反义序列的10个连续的核苷酸进行碱基配对形成带有双链RNA茎的人工发夹RNA结构。
24．一个真核细胞，含有目的核酸，其正常能被表型表达，进一步含有连接于一个重组DNA上的第一和第二嵌合DNA，从而两个嵌合DNA被一起整合到所述真核细胞的核基因组中；其中所述的第一嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)在该真核细胞中有效的启动子；b)能够被转录成具有含有至少10个连续的与目的基因的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列的核苷酸序列的有义RNA分子的第一DNA区域；以及任选地c)在植物细胞中涉及转录终止与聚腺苷化的DNA区域；以及其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)在该真核细胞中有效的启动子；b)能够被转录成具有包括含有至少10个连续的与所述有义核苷酸序列的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域；以及任选地c)在植物细胞中涉及转录终止与聚腺苷化的DNA区域；其中所述的有义和反义RNA分子能够通过在互补的区域间的碱基配对形成一个双链RNA区。
25．权利要求22中的真核细胞，其是植物细胞。
26．一种含有权利要求25的植物细胞的植物。
27．病毒抗性植物，含有被整合到其细胞的核基因组中的第一和第二嵌合DNA，其中所述的第一嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)植物可表达的启动子；b)能够被转录成具有含有至少10个连续的与能感染所述植物的病毒基因组的至少部分核苷酸序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的有义核苷酸序列的核苷酸序列的有义RNA分子的第一DNA区域；以及任选地c)在植物细胞中涉及转录终止与聚腺苷化功能行使的DNA区域；以及其中的第二嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)植物可表达的启动子；b)能够被转录成具有包括含有至少10个连续的与所述有义核苷酸序列的所说至少10个连续的核苷酸的互补序列有75％到100％序列同一性的核苷酸的反义核苷酸序列的核苷酸序列的反义RNA分子的第二DNA区域；c)任选地，涉及在植物细胞中行使转录终止与聚腺苷化功能的DNA区域；其中所述的有义和反义RNA分子能够通过在互补的区域间的碱基配对形成一个双链RNA区。
28．权利要求27所述的植物，其中所述的第一和第二嵌合DNA被整合到核基因组的一个基因座中。
29．权利要求27所述的植物，其中所述的第一和第二嵌合DNA被整合到核基因组的不同基因座中。
30．一种改变得自植物的油中脂肪酸分布的方法，所述的方法包括导入嵌合DNA到所述植物的细胞中的步骤，所述的嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)植物可表达的启动子b)DNA区，当被转录时产生RNA分子，其含有一个能形成人工茎环结构的RNA区，其中茎环结构的退火RNA序列之一含有与Δ12脱氢酶的编码开放阅读框架的至少部分核苷酸序列基本上相似的序列，以及其中的第二所述的退火RNA序列含有与所述Δ12脱氢酶编码开放阅读框架的至少部分核苷酸序列的至少部分互补序列基本上相似的序列；以及任选地；c)涉及转录终止及聚腺苷酸化的DNA区。
31．如权利要求30所述的方法，其中所述DNA区含有SEQ ID No 6的核苷酸序列。
32．权利要求30的方法，其中所述脂肪酸分布的改变包括增加油酸的含量。
33．如权利要求30所述的方法，其中所述植物可表达的启动子是种子特异性启动子。
34．如权利要求30所述的方法，其中所述的植物是油籽油菜。
35．一种产生被改变了脂肪酸分布的油的植物，所述的植物含有嵌合DNA，所述的嵌合DNA含有下列可操作地连接的部分a)植物可表达的启动子b)DNA区，当被转录时产生一种RNA分子，其含有能形成人工茎环结构的RNA区，其中茎环结构的退火RNA序列之一含有与Δ12脱氢酶编码开放阅读框架的至少部分核苷酸序列基本上相似的核苷酸序列，以及其中的第二所述的退火RNA序列含有与所述Δ12脱氢酶编码开放阅读框架的至少部分所述核苷酸序列的至少部分互补序列基本上相似的序列；以及任选地；c)涉及转录终止及聚腺苷酸化的DNA区。
36．权利要求35所述的植物，其中所述的DNA区含有SEQ ID No 6的核苷酸序列。
37．权利要求35所述的植物，其中所述的植物可表达启动子为种子特异性启动子。
38．权利要求35所述的植物，其中所述的植物是油籽油菜。
全文摘要
提供了一种通过导入编码目标在于靶核酸的有义和反义RNA分子的嵌合基因或通过导入RNA分子本身减少真核细胞特别是植物细胞中的目的核酸的表型表达的方法和措施,其中的RNA分子能够通过在带有有义和反义核苷酸的区域间碱基配对形成一个双链RNA区。优选地,该RNA分子同时含有有义和反义核苷酸序列。
文档编号A01H5/00GK1306571SQ99805925
公开日2001年8月1日 申请日期1999年4月7日 优先权日1998年4月8日
发明者P·M·沃特豪斯, 王明波, M·W·格莱汉姆 申请人:联邦科学和工业研究组织