龄幼虫太小，测不出酶活性，因此从2龄虫开始测酶活性。
[0017] 2?供试药剂
[0018]碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide, ATch)、5, 5' -二硫双硝基苯甲 酸（5,5' - Dithiobis，DTNB)和毒扁豆喊（Eserine)购自 Fluka ;曲拉通（Triton X-100) 购自北京鼎国生物技术有限责任公司，Genview分装；邻苯二酷购自天津化学试剂公司；氯 化硝基四氮唑蓝（NBT)购自上海前进化学试剂厂；核黄素和L-甲硫氨酸（MET)购自上海伯 奥生物科技有限公司；其他试剂购自广州化学试剂厂。
[0019] 3?测定方法
[0020] 酶液制备：
[0021] 酚氧化酶、超氧化物歧化酶的酶液提取方法是将采集的幼虫放入1. 5ml离心管 中，加入少量石英砂，按每1头幼虫加入〇. 20mL缓冲液的剂量，加入预冷的pH为7. 0、浓度 为0. lmol/L的PBS液，在冰浴条件下研磨，所得勾衆于16500Xg离心lOmin。其上清液 0. lml为待测的酶液。10次重复。
[0022] 乙酰胆碱酯酶酶液的提取，研磨时用预冷的pH为7. 8、浓度为0.lmol/L含0.3% 曲拉通（W/V)的PBS液，其它条件同上。
[0023] 酶活性测定：
[0024](1)酚氧化酶活性测定
[0025]参照 Benjamin 和 Montgomery 方法进行（Benjamin N Dand Montgomery M W， 1973)〇
[0026] 反应体系中含有0?05mol/L pH6. 8的磷酸缓冲液、0?2mol/L的邻苯二酚和0?lml 酶液。于30°C反应30min后测其0D42(I值。10次重复
[0027] (2)超氧化物歧化酶活性测定
[0028]参照 NBT法进行（Beauchamp&Fridovich，1971;Maleckaetal，2001)〇
[0029] 反应体系中含有80 ymol/L的核黄素、77 ymol/L的NBT、13mmol/L的MET、 0. lmmol/L的EDTA和0. lml酶液。于40001x下光照5min后，遮光停止反应，测定0D56Q，并 测定酶液的蛋白质含量。10次重复。
[0030] (3)乙酰胆碱酯酶活性测定
[0031]参照 Gorun 改进的 Ellman 方法（Gorun V，1978)。
[0032] 反应体系中含有10mmol/L的碘化硫代乙酰胆碱、0.lmol/L pH7. 8的磷酸缓冲液 和0. lml酶液。于30°C反应15min后在每管中加入0.3mL lmmol/L毒扁喊和0.2mL DTNB。 混合后，在30min内测其0D412值。10次重复。
[0033] 4?数据分析
[0034] 试验数据分析采用Excel (MS Office 2003版）和DPS数据处理系统（Data Processing System) 11. 50专业版进行统计与分析。
[0035]实施例1辐照桔小实蝇卵和各龄幼虫后对其酚氧化酶活性的影响
[0036]测定Y射线辐照桔小实蝇卵后和各龄幼虫对其酚氧化酶活活性影响，结果见表 1、表2、表3。
[0037]表1 y射线辐照桔小实蝇24小时卵后对其2-7天幼虫体内酚氧化酶（0D42Q值） 酶活性影响
【主权项】
1. 一种辐照处理桔小实蝇的方法，其特征在于：以40 - 160 Gy剂量的6°C〇y射线辐 照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160 Gy以上剂量的6°C〇y射线辐照桔小实蝇3龄幼 虫。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以80 - 160 Gy剂量的6°Co Y射线辐照 桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160 Gy以上剂量的6°C〇y射线辐照桔小实蝇3龄幼虫； 或者用160 Gy以上剂量的6°C〇y射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄、3龄幼虫。
3. -种鉴别桔小实蝇是否经达标的辐照处理的方法，其特征在于：采集被检测植物或 水果上的桔小实蝇活虫以检测其酚氧化酶、超氧化物歧化酶或/和乙酰胆碱酯酶酶活性， 如果酚氧化酶酶活性为对照80%以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下或/和乙酰 胆碱酯酶酶活性低于对照，则确定幼虫是经过辐照处理。
4. 按照权利要求3所述的方法，其特征在于：进一步检测被检测植物或水果上的桔小 实蝇幼虫是否能够黑化，将发现的活虫放入-18°C冰箱急冻后，确定虫体死亡后，将虫体拿 出放入室温下，lh后观察，如果虫体呈黄白色，如果没有变黑色，可以确定幼虫经过辐照处 理；如果黑化表明没有经过辐照处理。
5. 按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：如果酚氧化酶酶活性为对照80%以 下，则确定幼虫是经过辐照处理。
6. 按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：如果超氧化物歧化酶酶活性为对照 85%以下，则确定幼虫是经过辐照处理。
7. 按照权利要求3或4所述的方法，其特征在于：如果酚氧化酶酶活性为对照80%以 下、超氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下，则确定幼虫是经过辐照处理。
8. 按照权利要求7所述的方法，其特征在于：如果酚氧化酶酶活性为对照80%以下、超 氧化物歧化酶酶活性为对照85%以下，并且乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，则确定幼虫是 经过辐照处理。
【专利摘要】本发明公开了一种辐照处理桔小实蝇的方法：以40－160 Gy 剂量的60Coγ射线辐照桔小实蝇卵、1龄、2龄幼虫；或者用160 Gy 以上剂量的60Coγ射线辐照桔小实蝇3龄幼虫，同时本发明还公开了一种鉴别桔小实蝇是否经达标的辐照处理的方法：采集被检测植物或水果上的桔小实蝇活虫以检测其酚氧化酶、超氧化物歧化酶或/和乙酰胆碱酯酶酶活性，如果酚氧化酶酶活性为对照的80%以下、超氧化物歧化酶酶活性为对照的85%以下或/和乙酰胆碱酯酶酶活性低于对照，那么就可以确定幼虫是经过辐照处理。本发明通过测定酚氧化酶、超氧化物歧化酶（SOD）或/和乙酰胆碱酯酶（AChE）这三种酶活性，能够明确桔小实蝇是否经过辐照，及辐照时处于的虫期，该方法非常灵敏可靠，针对进口水果截获虫量少的特点，鉴定时只需一条虫。
【IPC分类】C12Q1-26, A01M1-22, C12Q1-46
【公开号】CN104521926
【申请号】CN201410789917
【发明人】赵菊鹏, 武目涛, 赵立荣, 梁帆, 马骏, 梁广勤
【申请人】广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月17日