物进行ISSR扩增，得 ISSR扩增产物；所述的引物序列分别如下：
[0042] P4 :5' -GGATGCAACACACACACAC-3'（SEQIDNo. 1)
[0043]P24 :5'-CACGAGAGAGAGAGAGA-3'（SEQIDNo. 2)
[0044] ISSR扩增体系为：dNTP(2. 5mM)I. 5yL，引物（10ymol)IyL，ExTaq?DNA聚合 酶 0?5U，10XExTaqPCR缓冲液2yL，DNA模板4yL，用CldH2O补齐至20yL;ISSR反应条 件：94°C4min;94°C50s，55°C50s，72°C2min，共35个循环；72°C补齐7min。将扩增产物在 I.0 %琼脂糖凝胶上进行电泳检测，检测ISSR扩增结果。
[0045] 结果以P4为引物扩增的ISSR图谱（见图2)和以P24为引物扩增的ISSR图谱 (见图3)中均可以看出中农白灵5号与华杂13、中农翅鲍、KH2、中农1号均存在明显差异性 条带，说明中农白灵5号为一种新的白灵葫（Pleurotuseryngiivar.tuoliensis)菌株。
[0046](三）利用IGS2-RFLP图谱对中农白灵5号进行分类鉴定
[0047] 试验菌株：中农白灵5号和中农1号
[0048] 试验方法：（I)、DNA提取：按常规方法提取中农白灵5号DNA。
[0049] (2)、引物！InvSRlR和 5SRNAR。
[0050]InvSRlR:5'-ACTGGCAGAATCAACCAGGTA-3'（SEQIDNo.3)
[0051] 5SRNAR:5, -ACCGCATCCCGTCTGAT-3,（SEQIDNo. 4)
[0052] (3)、限制性内切酶：HapII、RsaI。
[0053]IGS2-PCR扩增体系：dNTP(2. 5mMeach)4yL，InvSRlR、5SRNAR各 2. 5yL，ExTaq ?DNA聚合酶I. 25U，IXPCR缓冲液，模板25ng，用CldH2O补齐至50yL。IGS2-RFLP反应条 件：94°Clmin，60°Clmin，72°C3min，共35个循环；72°C，7min。酶切体系：限制性内切酶 (IOU/yL)lyL，PCR产物 6yL，IOXbufTerIyL，用水补齐至IOyL。置于 37°C下酶切 4 小时。1.2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统下检测酶切反应结果。数据处理采用 QuantityOne分析软件。
[0054] 结果中农白灵5号的IGS2经HapII酶切（见图4)生成大小为609bp、661bp、 1301bp的3个片段；经RsaI酶切（见图5)生成大小为454bp、724bp、2262bp的3个片段。 经过对比发现中农白灵5号的带型与其他白灵菇均不同，说明是一种新的白灵菇菌株。
[0055] 实施例2本发明白灵菇中农白灵5号的栽培试验
[0056] (1)母种的繁殖按1:80的重量比比例将0.3?0.5cm大小的中农白灵5号菌种 (已于2014年12月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏（保藏地 址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，邮编100101)，其保藏 编号为CGMCCN〇10195。）接种于母种培养基上，在25°C、空气相对湿度60%、避光条件下 培养12天，长满试管斜面，得到中农白灵5号母种；其中母种培养基的制备方法为：将去皮 马铃薯切块（直径约lcm) 200g，置于约600ml水中，沸水煮30min，4层纱布过滤，取汁液； 向所得汁液中加入少于400ml冷水，再加葡萄糖20g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0. 5g、琼脂粉 15g，定容至1000ml，搅拌至琼脂粉无结团，小火加热并同时搅拌，至以上成分完全溶解，分 装试管，121°C灭菌30min;摆斜面，得到母种培养基。
[0057] (2)原种培养：按照重量百分比5%的比例将步骤⑴所得中农白灵5号母种接 种于栽培培养料上，在25°C、空气相对湿度60%、避光条件下培养30天，得中农白灵5号 原种；所述的栽培培养料按照如下方法制备：按照重量百分比比例将棉籽壳81%，麦麸 12. 5%，玉米粉3. 5%，石灰3%混合，搅拌均匀；再按照料水比I:1. 86的重量比例加入水， 搅拌均匀，装菌袋，菌袋规格为17cmX33cm、厚4丝的聚丙烯袋，装袋高度10cm，皮筋扎口， 采用高压灭菌，在125°C保持150min。菌袋灭菌完毕后，取出摊凉。
[0058] (3)栽培种培养：按照重量百分比为5%的比例将步骤⑵所得中农白灵5号原种 接种于栽培培养料（其组成成分及其比例同步骤（2))上，在25°C、空气相对湿度60%、避 光条件下培养28天，得中农白灵5号栽培种。
[0059] (4)、栽培培养料的制备：参照步骤（2)准备栽培培养料，装袋，菌袋规格为 17cmX35cm、厚4丝的聚丙稀袋，料高16cm左右，中间插入长13cm的食用菌塑料空心棒，用 直径3. 5cm套环和配套棉塞盖封口；采用常压菌灭菌，在KKTC保持14小时。
[0060] (5)、冷却接种：将冷却室打扫干净后消毒，将步骤（4)所得菌袋放入冷却室至温 度降低至常温。在无菌条件下，取出菌袋中的食用菌空心塑料棒，按照重量百分比5%的比 例，将中农白灵5号栽培种接种到菌袋中央的孔洞中，用套环和配套棉塞盖封口；在25°C， 空气相对湿度60%，暗光，通风良好，培养30天长满菌袋。
[0061] (6)、搔菌：将袋口打开，用消毒刮铲除去料面3平方厘米大小的菌皮，松扎上口， 然后将菌袋松扎上，继续培养5天，直至菌丝恢复。
[0062] (7)、低温刺激：将菌袋放入冷库1°C条件下低温刺激7天。
[0063] (8)、出菇管理和采收：将经过步骤（7)处理的菌袋，转入出菇房，控制温度在 12°C，空气相对湿度85%，光照500?800勒克斯，通风良好，环境CO2S1000X10 _6条件下 培养28天；当子实体菌盖充分展开，但仍有微微卷边，孢子未释放时采收子实体；采收时 从子实体根部割下，用保鲜纸包裹后装箱。
[0064] 结果本发明中农白灵5号栽培周期为100-110天，其次，农业式栽培单菇重为 187. 6±21. 4g，而且每袋能出2个菇；本发明中农白灵5号的子实体（见图1)商品价值较 高，它的菌盖为馒头状，颜色雪白，质地硬，出菇整齐。菌盖长径平均12. 3厘米，短径平均 11. 0厘米，厚度平均4. 9厘米；菌柄中生，平均长3. 5cm，平均粗3. 9cm。适合农业式栽培。
【主权项】
1. 一种白灵葫（Pleurotuseryngiivar.tuoliensis)菌株中农白灵 5 号，已于 2014 年12月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.10195。
2. 权利要求1所述的白灵菇菌株中农白灵5号的栽培方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 、按1:80?100的重量比比例将直径大小0. 3?0. 5cm的中农白灵5号菌种接种 于母种培养基上，在22?28°C、空气相对湿度为40?60%、避光条件下培养10?12天， 得中农白灵5号母种； (2) 、按照重量百分比为3?5%的比例将步骤⑴中所得的中农白灵5号母种接种于 栽培培养料上，在22?28°C、空气相对湿度为40?60%、避光条件下培养28?35天，得 中农白灵5号原种； (3) 、按照重量百分比为3?5%的比例将步骤⑵中所得的中农白灵5号原种接种于 栽培培养料上，在22?28°C、空气相对湿度为40?60%、避光条件下培养28?35天，得 中农白灵5号栽培种； (4) 、按照重量百分比为5?8%的比例将步骤（3)中所得的中农白灵5号栽培种接种 于栽培培养料上，在22?28°C、空气相对湿度为40?60%、避光条件下培养30?40天， 菌丝长满培养料； (5) 、将袋口打开，用消毒刮铲除去料面上的菌皮，松扎上口，然后将菌袋松扎上，继续 培养3?5天，直至菌丝恢复； (6) 、将菌袋置于1?3°C低温下刺激7?14天；或大棚温度在0?15°C时，保持昼夜 温差10?15°C，刺激10?15天； (7) 、出现原基后，在温度为5?18°C(农业式栽培）或12?14°C(工业式栽培），空 气相对湿度为75?85 %，光照500?800勒克斯，通风良好，环境CO2S1000X10 _6条件下 培养20?30天；当子实体菌盖充分展开，但仍有微微卷边，孢子未释放时采收子实体。
3. 按照权利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步骤（1)中所述的菌种指菌丝。
4. 按照权利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步骤（1)中所述的母种培养基的 原料组成成分及其重量比例为：去皮马铃薯块180?300g，葡萄糖15?20g，磷酸二氢钾 0.5?38，硫酸镁0.5?38，琼脂15?258，水10001111，？11值自然。
5. 按照权利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步骤（2)、（3)或（4)中所述的栽培 培养料的原料组成成分及其重量百分比为：棉籽壳75?81%，麦麸8?15%，玉米粉2? 8%，石灰1?3% ;再以料水比为I:1. 8?2. 3的比例加入水。
6. 按照权利要求5所述的栽培方法，其特征在于所述的栽培培养料的组成成分及其重 量百分比为：棉籽壳81%，麦麸12. 5%，玉米粉3. 5%，石灰3%，料水比I:1. 86,即含水量 为 65%。
7. 按照权利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步骤（1)、（2)、（3)或（4)中所述的 温度为24?26 °C。
8. 按照权利要求7所述的栽培方法，其特征在于所述的温度为25°C。
9. 按照权利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步骤（1)、（2)、（3)或（4)中所述的 空气相对湿度为60%。
10.按照权利要求2所述的栽培方法，其特征在于其步骤（4)中所述的接种方法为先拔 出菌袋中央事先插入的空心塑料棒，将栽培种接入拔出空心塑料棒后留下的孔洞中。
【专利摘要】本发明公开了属于食用菌领域的一种出菇整齐的白灵菇。本发明白灵菇(Pleurotus？eryngii？var.tuoliensis)菌株中农白灵5号，已于2014年12月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC？No.10195。本发明还公开了农白灵5号的栽培方法，包括母种繁殖、原种培养、栽培种培养、低温刺激、出菇管理和采收等。本发明提供了一种新的白灵菇菌株，丰富了白灵菇的种类；其次，本发明中农白灵5号的子实体商品价值较高，菌盖呈馒头状，质地硬，外观漂亮，出菇整齐，形态一致性高。中农白灵5号适于农业式栽培，每袋能出2个菇。CGMCC No.1019520141212
【IPC分类】A01G1-04, C05G3-00
【公开号】CN104541978
【申请号】CN201510006876
【发明人】赵梦然, 陈强, 黄晨阳, 张金霞, 高巍, 曲积彬, 邹亚杰, 邬向丽
【申请人】中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月7日