天的上午，剪取树干基部萌枝，去叶后用纯净水清洗干净，备用；
[0045](2)外植体消毒和腋芽诱导:在超净工作台上，将枝条用无菌水清洗一遍，再用浓度70?75%酒精溶液浸泡时间为20?30s，倒掉酒精溶液后无菌水冲洗I?2次，然后加Λ 0.05%?0.1 %升未溶液，浸泡3?lOmin，其间不断摇动，倒掉升未溶液后用无菌水冲洗5?6次，用无菌水冲洗后，无菌滤纸吸干无菌材料表面水珠，将茎段切成2cm带叶腋切并接种到诱导分化培养基(诱导分化培养基:MX培养基+0.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+蔗糖30g/L+卡拉胶8g/L，pH为5.8-6.0 (激素购自Sigma-Aldrich公司))，放到培养室，于25±2°C、60 μπιο?.m_2.s—1光照12h/d ;诱导培养25d，将长度大于2cm的腋芽切下转接到增殖培养基培养；培养30d，腋芽分化形成新芽丛，将芽高3 3cm幼嫩枝条切割成1.0?1.5cm的茎段转接入增殖培养基培养；每瓶接种一个外植体；4?5d之后，叶柄开始松动脱落，腋芽萌动，一个月后一个叶腋能萌出多个腋芽(图1)，将其继续培养，继而形成芽丛，每丛有芽4?6株，芽苗健壮，翠绿(图2)，诱导率为100% ；
[0046](3)增殖培养:将步骤⑵的诱导出的腋芽截成1.0?1.5cm的茎段并转接到增殖培养基(MX培养基+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖 30g/L+卡拉胶 8g/L，pH为 5.8-6.0)上进行培养，温度控制在25±2°C，光照(60ymOl.m_2.^1)时间12h/d ;4周后，单芽形成芽丛，芽伸长生长快，增殖系数高达4.32，芽苗粗壮，叶片开展，翠绿(图3);有效芽(芽高^ 2cm)可达3.31个/丛，芽高可达5?6cm(图4)。
[0047](4)生根培养:从步骤(3)得到的增殖苗中切取2.0cm芽转接至生根培养基(MX培养基+NAA 0.3mg/L+蔗糖15g/L+卡拉胶7g/L，pH为5.8-6.0)上进行培养，温度控制在25±2°C，光照(60 μ mo 1.m^2.s-1)时间12h/d，15d后，不定根的诱导率为100% (图5)，生根苗健壮，高达4?5cm，基部愈伤组织少，平均根数可达13.4条/株(图6)。
[0048](5)炼苗与移栽:将步骤(4)组培生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到容器苗。将生根培养20d的生根瓶苗移到温室中适应外界环境5?7d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗ld，将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土:珍珠岩=3:1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理，该移栽成活率高于90%;一个月后移栽苗生长良好，新叶嫩绿光亮(图7)。
[0049]步骤(I)中，所述的剪取树干基部萌枝采用基部环割促进基部萌枝；采集外植体前，每隔1d用多菌灵、百菌清交替喷洒萌枝4?5次；采集后的枝条除叶，用纯净水清洗干净，低温保湿备用。
[0050]所述的MX 培养基含有如下成分:720mg/L NH4N03+400mg/L KN03+660mg/L Ca(NO3)2.2H20+370mg/L MgSO4.7H20+170mg/L KH2P04+65mg/L KC1 + 22.3mg/L MnSO4.4H20+8.6mg/L ZnSO4.7H20+6.2mg/L H3B03+0.83mg/L KI+0.25mg/LNa2MoO4.2H20+0.25mg/L CuSO4.5H20+0.05mg/L NiSO4.6H20+0.025mg/L CoC12+27.8mg/LFeSO4.7H20+37.3mg/L Na2.EDTA.H20+150mg/L 肌醇 +2.0mg/L 甘氨酸 +0.5mg/L 盐酸硫胺素+0.2mg/L烟酸+0.2mg/L盐酸吡哆醇；pH 5.8、121°C灭菌15-20分钟。
[0051]本方法中，外植体的腋芽速度快；诱导率高、达100% ;增殖系数大、达4.32以上，增殖芽伸长生长快，培养30d芽高达5?6cm ;生根率100%，平均根数为13.4根/株；组培生根苗健壮、移栽成活率高。
[0052]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)外植体采集:选取干型通直圆满、生长速度快、无病虫害的优良单株为母本，剪取树干基部萌枝，去叶后用纯净水清洗干净，备用； (2)外植体消毒和腋芽诱导:将枝条用无菌水清洗一遍，再依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒，用无菌水冲洗后接种到诱导培养基，放到培养室培养，得到腋芽； (3)增殖培养:将步骤(2)的腋芽切下并转接到增殖培养基上进行培养，得到增殖苗； (4)生根培养:从步骤(3)得到的增殖苗中切取芽转接至生根培养基上进行培养，得到组培生根苗； (5)炼苗与移栽:将步骤(4)组培生根苗移到温室进行炼苗移栽，得到容器苗。
2.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤(2)中所述的诱导分化培养基为MX培养基+0.2?2.0mg/L 6-BA+0.02?0.2mg/LNAA+25 ?40g/L 鹿糖 +8g/L 卡拉胶；pH 为 5.8-6.0。
3.根据权利要求2所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，所述的MX培养基含有如下成分:720mg/L NH4N03+400mg/L KN03+660mg/L Ca(NO3)2.2H20+370mg/L MgSO4.7H20+170mg/L KH2P04+65mg/L KC1 + 22.3mg/L MnSO4.4H20+8.6mg/L ZnSO4.7H20+6.2mg/L H3B03+0.83mg/L KI+0.25mg/LNa2MoO4.2H20+0.25mg/L CuSO4.5H20+0.05mg/L NiSO4.6H20+0.025mg/L CoC12+27.8mg/LFeSO4.7H20+37.3mg/L Na2.EDTA.H20+150mg/L 肌醇 +2.0mg/L 甘氨酸 +0.5mg/L 盐酸硫胺素+0.2mg/L烟酸+0.2mg/L盐酸吡哆醇；pH5.8、121°C灭菌15-20分钟。
4.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤(2)中所述的用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒采用如下方法进行:用浓度70?75%酒精溶液浸泡时间为20?30s，倒掉酒精溶液后无菌水冲洗I?2次，然后加入0.05%?0.1 %升汞溶液，浸泡3?lOmin，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后用无菌水冲洗5?6次。
5.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤⑵中所述的培养采用如下方法进行:于25±2°C、60ymol.m_2.s—1光照ia/d ;诱导培养25d，将长度> 2cm的腋芽切下转接到增殖培养基培养；培养30d，腋芽分化形成新芽丛，将芽高3 3cm幼嫩枝条切割成1.0?1.5cm的茎段转接入增殖培养基培养。
6.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤⑵中所述的腋芽为芽高为I?2cm的腋芽。
7.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤(3)中所述的增殖培养基为MX培养基+0.5?1.5mg/L 6-BA+0.05?0.15mg/L NAA+25?40g/L蔗糖+8g/L卡拉胶；pH为5.8-6.0 ;所述的培养采用如下方法进行:于25±2 °C、60 μ mo 1.m 2.s 1 光照 12h/d。
8.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤(4)中所述的生根培养基为MX培养基+0.1?0.5mg/L NAA+15?20g/L蔗糖+7g/L卡拉胶；pH 为 5.8-6.0o
9.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤⑷中所述的培养采用如下方法进行:于25±2°C、60ymol.m_2.s—1光照ia/d ;所述的芽为2cm芽。
10.根据权利要求1所述的米老排成年优良单株的离体植株再生方法，其特征在于，步骤(5)中所述的培养采用如下方法进行:生根培养20d后，将生根瓶苗移到温室中适应外界环境5?7d,然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗ld，将组培苗取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到泥炭土:珍珠岩=3:1混合基质上，移栽后前20d采用盖膜保湿，然后揭开薄膜按常规幼苗管理。
【专利摘要】本发明公开了一种米老排成年优良单株的离体植株再生方法，属于植物的组织培养技术领域。该方法通过基本培养基设置、不同激素成份及浓度水平配比优化，以成年优株基部萌枝为外植体，经腋芽诱导、腋芽增殖和生根培养，形成完整植株，移栽到基质后，得到生长整齐、表型一致的健壮苗木；造林成活率高，林相整齐。本发明克服了米老排外植体无菌性建立时污染率高、增殖培养时芽伸长生长慢、增殖倍率低、生根率低等问题，可进行规模化快速育苗，生产出健壮、整齐一致的米老排幼苗，生产成本低，为实现米老排优良单株的无性化推广，为提高米老排人工林的经济效益提供技术支撑和良种保障，应用前景广阔。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104620981
【申请号】CN201510031367
【发明人】邓小梅, 陈怡佳, 陈晓阳, 湛欣, 张晓明
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月21日