一种抗锈病黑杨组培苗的继代培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种黑杨组培苗的继代培养方法。
【背景技术】
[0002] 落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina)又称青杨叶锈菌，是一种分布 广，危害大的长生活史转主寄生锈菌，其引起的杨树叶锈病是杨树（Populus spp.)苗期和 幼树阶段的重要叶部病害，可侵害青杨派、黑杨派及其杂交种的20多种杨树，发生最为普 遍，为杨树5大严重病害之首。落叶松-杨栅锈菌存在生理分化现象，目前为止，已经发现 的生理小种包括E1、E2、E3,以及后来发现的生理小种E4等。通常，黑杨（Populus nigra) 及其杂交后代具有对锈菌的抗性。经过接种试验筛选出抗锈菌的黑杨，在组培扩繁过程中 遇到褐化、玻璃化以及继代培养后抗性缺失等问题。本发明所选用的技术能够保证20次继 代培养后抗性不缺失。
【发明内容】
[0003] 本发明是要解决目前组培扩繁过程中及继代培养后抗锈病的抗性易缺失的问题， 提供一种抗锈病黑杨组培苗的继代培养方法。
[0004] 本发明抗锈病黑杨组培苗的继代培养方法，按以下步骤进行：
[0005] -、抗锈病黑杨筛选：
[0006] 从活化培养的1年生黑杨休眠枝条上分离出叶间隔期指数为5~9的完全展开的 叶片，每株黑杨取叶片8~12片，接种锈菌，然后将接种叶片置于16°C的生长室，每天进行 16h光照，持续培养7天，计算每株黑杨的病情指数，选择病情指数〈25的黑杨植株，对黑杨 叶片进行清洗与消毒，接种到含300mg/LAmp的1/2MS固体培养基上，进行继代培养20天， 筛选出继代培养20天后病情指数〈25的黑杨植株为抗锈病黑杨；
[0007] 二、抗锈病黑杨组培苗的继代培养：
[0008] 将步骤一筛选得到的抗锈病黑杨组培苗在无菌操作条件下通过切分丛生芽的形 式进行扩繁增殖，将高度为1. 5~2. 5cm的丛生芽接种到继代培养基上，于温度25°C，光照 强度为1000~1500Lux，光照时间为24h/d的条件下进行培养。
[0009] 本发明所述抗锈病黑杨组培苗的继代培养方法，可保障黑杨组培苗顺利继代培 养，并保持对锈菌抗性20代。在抗病种苗扩繁和生产中有助于实现规模化生产，实现本发 明的目的。本发明通过改良培养基配方和操作技术实现继代培养20代后保持抗性，在杨树 抗病育种和种苗快速繁殖中具有重要的应用价值。
【具体实施方式】
[0010] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
[0011]
【具体实施方式】一：本实施方式抗锈病黑杨组培苗的继代培养方法，按以下步骤进 行：
[0012] -、抗锈病黑杨筛选：
[0013] 从活化培养的1年生黑杨休眠枝条上分离出叶间隔期指数为5~9的完全展开的 叶片，每株黑杨取叶片8~12片，接种锈菌，然后将接种叶片置于16°C的生长室，每天进行 16h光照，持续培养7天，计算每株黑杨的病情指数，选择病情指数〈25的黑杨植株，对黑杨 叶片进行清洗与消毒，接种到含300mg/LAmp的1/2MS固体培养基上，进行继代培养20天， 筛选出继代培养20天后病情指数〈25的黑杨植株为抗锈病黑杨；
[0014] 二、抗锈病黑杨组培苗的继代培养：
[0015] 将步骤一筛选得到的抗锈病黑杨组培苗在无菌操作条件下通过切分丛生芽的形 式进行扩繁增殖，将高度为1. 5~2. 5cm的丛生芽接种到继代培养基上，于温度25°C，光照 强度为1000~1500Lux，光照时间为24h/d的条件下进行培养。
[0016]步骤一所述锈菌为落叶松-杨栅锈菌（Melampsora larici-populina)，于2003 年在〈〈Quantitative inoculations of poplars with Melampsora larici-populina. European Journal of Plant Patho 1 ogy》（M. H. Pe i，C. Ru i z，J. Harr i s, T. Hunter. ,2003, 109:269-276.)中公开，由文章作者M.H. Pei惠赠，保存于东北林业大学森 林保护学科森林病理学标本室。
【具体实施方式】 [0017] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一中接种锈菌的 方法为：用质量百分浓度为0. 004%的Tween 20水溶液悬浮孢子，然后进行喷雾接种，其中 孢子浓度为40000个/mL。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0018] 三：本实施方式与一或二不同的是：病情指数的计算 方法为：病情指数=l〇〇X E (各级病叶数X各级代表值V(调查总叶数X最高级代表 值），病情指数〈25为抗病，25〈病情指数〈50为中度抗病，50〈病情指数〈75为感病，75〈病 情指数为高感病；其中病级及各级代表值为：叶片无夏孢子器产生为1级，代表值为〇 ;叶 片1/4以下面积有夏孢子器产生为2级，代表值为1 ;叶片1/4~1/2面积有夏孢子器产生 为3级，代表值为2 ;叶片1/2~3/4面积有夏孢子器产生为4级，代表值为3 ;叶片表面3/4 以上面积有夏孢子器产生为5级，代表值为4。其它与一或二相同。
[0019]
【具体实施方式】四：本实施方式与【具体实施方式】一至三之一不同的是：步骤一中继 代培养的条件为25°C，光照强度1000~1500LUX。其它与【具体实施方式】一至三之一相同。 [0020]
【具体实施方式】五：本实施方式与【具体实施方式】一至四之一不同的是：步骤二中继 代培养基为含有〇. lmg/L激动素、0. lmg/L 6-苄基氨基嘌呤、0.025mg/L苯基脲衍生物TDZ、 吲哚丁酸〇. 3mg/L、8g/L琼脂和30g/L蔗糖的MS培养基，pH为5. 8~6. 2。其它与具体实 施方式一至四之一相同。
【具体实施方式】 [0021] 六：本实施方式与一至五之一不同的是：步骤二中光 照强度为1200~1300Lux。其它与一至五之一相同。
[0022] 实施例1 :
[0023] 本实施例抗锈病黑杨组培苗的继代培养方法，按以下步骤进行：
[0024] -、抗锈病黑杨筛选：
[0025] 从活化培养的1年生黑杨休眠枝条上分离出叶间隔期指数（LPI)为7的完全展开 的叶片，每株黑杨取叶片10片，接种锈菌，接种锈菌的方法为：用质量百分浓度为〇. 004% 的Tween 20水溶液悬浮孢子，然后进行喷雾接种，其中孢子浓度为40000个/mL。同时设置 对照组，对照组使用含0. 004% Tween 20的去离子水进行喷雾，然后将接种叶片置于16°C 的生长室，每天进行16h光照，持续培养7天，计算每株黑杨的病情指数，选择病情指数〈