充3%蔗糖、0.051^1/激动素和0.511^1^1的1-萘乙酸的1510培养基 (4. 4gL\pH5. 7)中培育衍生自拟南芥株L-MM1生态型Landbergerecta的叶的光能自养 (Photomixotrophic)悬浮培养的细胞。将细胞保持在16/8h的光照/黑暗光周期、在22°C、 在以每分钟115转（r.p.m)的转动摇动器上。
[0056] 低淵保存细朐培养物
[0057] 将10mL的细胞悬浮液（最后次培养（传代培养，subculture)后3天）浓缩10 倍，以获得约120mg新鲜重量每毫升的细胞密度。然后将植物细胞转移并与4mL用0. 20μm 膜过滤器进行过滤消毒并在4°C冷冻的冷冻保护二氧化硅溶胶（在1M和3M之间的H2Si03、 在1%和10% (v/v)之间的DMS0、在0. 2M和1M之间的蔗糖、约4. 4g L WSMO粉末，pH值用 0. 2M Κ0Η调节至4和8之间）混合。然后将混合物在冷室（4°C)培养约1-6小时。同时， 发生胶凝。所得到的杂化二氧化硅凝胶最后转移并存储在实验室冷冻器（约_80°C)中。
[0058] 解冻和恢复
[0059] 经将样品小瓶在室温下温热约5-10分钟将杂化二氧化硅基质快速解冻。将解冻 的凝胶铺展在包含固体培养基（琼脂0. 8%、补充有3%蔗糖、0. 05mgL1激动素和0. 5mg L1 1-萘乙酸的4.4gL1MSM0培养基）的板上，并在22°C下、以16/8小时光照/黑暗光周 期培养约7天。在此期间后，将恢复的杂化二氧化硅-细胞材料转移到含有20mL新鲜液体 培养基的厄伦美厄烧瓶（Erlenmeyerflask)中。
[0060] 解冻后的细朐活力
[0061] 在解冻约1小时至约7天后通过用Clark型氧电极（由HansatechInstruments， UK制造的Oxy-lab)监测在20°C下的02摄取来确定细胞生理功能。用活体染料染色（vital dyestaining)(荧光素二乙酸酯，FDA)确认细胞活力。将解冻的细胞用5mMFDA在室温培 育5分钟。通过使用荧光显微镜（MultizoomAZ100显微镜，购自Nikon)利用485/35nm激 发光照射样品，用彩色摄像机（DSRil，Nikon)在536/40nm采集显微照片。回收细胞生长以 及形成所谓的愈伤组织的能力也用作细胞活力的指标。
[0062] 在低温保存方法的每个三种步骤之后评估植物细胞的代谢活性（监测02摄取）： 包封（固定化）、温育（4°C)和冷冻（_80°C)。在图A中，评估杂化凝胶在不同温度（4°C或 20°C)的温育步骤对低温保存后的细胞活性的影响。
[0063] 然后，评估蔗糖（B)和DMS0(C)浓度对细胞保存的影响。100%对应于未经历任何 冻融循环的细胞的耗氧。
[0064] 图1A提供本发明方法的第二步骤中的最佳温育时间的数据。如在图1A中报告的， 最佳温育时间在约6小时到约48小时之间变化。
[0065] 图1B提供本发明方法的第一步骤中的冷冻保护二氧化硅溶液中蔗糖的最佳浓度 的数据。如在图1B中报告的，最佳蔗糖浓度在约0. 2M到约1M之间变化。
[0066] 图1C提供本发明方法的第一步骤中的冷冻保护二氧化硅溶液中的DMS0的最佳浓 度的数据。如在图1C中报告的，最佳DMS0浓度在约1 %至约10%之间变化。
[0067] 实施例2 :二氧化硅物质对拟南芥细胞的低温保存的作用
[0068] 按照在实施例1中所呈现的执行本实验。将植物细胞转移并与4mL包含不同浓度 的聚硅酸（约〇· 4%到约10% )、二氧化硅纳米颗粒（约1%到约12% )的冷冻保护二氧化 硅混合。图2比较了用聚硅酸（A)或二氧化硅纳米颗粒（B)预温育的回收细胞的耗氧。
[0069] 可以由图2推导，在测试浓度范围内，作为二氧化硅前体使用的聚硅酸提供比二 氧化硅纳米颗粒更高的代谢活性。如在图2A中报告的，最佳聚硅酸浓度在约5%至约10% 之间变化。
[0070] 最佳二氧化硅纳米颗粒浓度为约10 %。
[0071] 实施例3 :拟南芥细胞的长期冷冻保存
[0072] 按照在实施例1中所呈现的执行本实验。图3表示回收细胞在-80°C保存一个月 到24个月的时间后的耗氧。
[0073] 植物细胞在二氧化硅基质内冷冻保存两年仍有活力，如在图3中报告的。
【主权项】
1. 一种用于低温保存（基因修饰的）植物细胞、植物细胞器或植物组织的方法，其包括 以下步骤： -将所述植物细胞、植物细胞器或植物组织包封在包含一种或多种二氧化硅前体和一 种或多种冷冻保护剂的多孔二氧化硅基质中； -在4°C和20°C之间的温度下温育所获得的混合物超过1小时的时期； -将所得到的杂化二氧化硅凝胶转移到在_30°C和-196Γ之间的温度下的冷冻器中。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述冷冻器处于_80°C的温度。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自由二甲基亚 砜（DMSO)、糖、氨基酸、两性离子化合物（甜菜碱）、二醇、多元醇或其混合物所组成的组。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述糖是蔗糖或海藻糖。5. 根据权利要求3所述的方法，其中所述氨基酸是脯氨酸或甘氨酸。6. 根据权利要求3所述的方法，其中所述二醇是（聚）乙二醇。7. 根据权利要求3所述的方法，其中所述多元醇选自由山梨糖醇、麦芽糖醇、甘油、赤 藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、乳糖醇、异麦芽糖醇或其混合物所组成的组。8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述二氧化硅基质中所述二氧化硅 前体的浓度可以在5%和10%之间变化。9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种二氧化硅前体选自由 聚硅酸（H2Si03)n(优选偏硅酸H2Si03)、氢氧化硅、二氧化硅烷氧化物（例如原硅酸四甲酯 (TMOS)、原硅酸四乙酯（TEOS)、原硅酸四丙酯（TPOS)、四（2-羟乙基）原硅酸酯（EGMS)、四 (2-羟丙基）原硅酸酯（PGMS)和四（2, 3-二羟丙基）原硅酸酯（GLMS))、硅酸盐（如硅酸 钠或硅酸钾）、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐（有机改性的二氧化硅）、 三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TMOS(四甲氧基硅烷）、DGS(二甘油基硅烷），或 其混合物所组成的组。10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护剂为与所述一种或多 种二氧化硅前体混合的浓度分别在0.2M和1.0M之间（蔗糖）以及1%和10%之间（DMSO) 的蔗糖和DMSO。11. 一种用于植物细胞、植物细胞器或植物组织的低温保存试剂盒，包括一种或多种二 氧化硅前体和一种或多种冷冻保护剂。12. 根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述一种或多种二氧化硅前体选自由聚硅酸 (H2Si03)n(优选偏硅酸H2Si03)、氢氧化娃、二氧化硅烷氧化物（例如原硅酸四甲酯（TMOS)、 原硅酸四乙酯（TEOS)、原硅酸四丙酯（TPOS)、四（2-羟乙基）原硅酸酯（EGMS)、四（2-羟 丙基）原硅酸酯（PGMS)和四（2, 3-二羟丙基）原硅酸酯（GLMS))、硅酸盐（如硅酸钠或硅 酸钾）、二氧化硅纳米颗粒、山梨醇硅烷、有机改性硅酸盐（ormosils)(有机改性的二氧化 硅）、三甲氧基甲基硅烷、二甲氧基二甲基硅烷、TM0S(四甲氧基硅烷）、DGS(二甘油基硅 烷），或其混合物所组成的组。13. 根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自由DMS0 (二 甲基亚砜）、糖、氨基酸、两性离子化合物（甜菜碱）、二醇或多元醇或其混合物所组成的组。14. 根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述糖是蔗糖或海藻糖。15. 根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述氨基酸为脯氨酸或甘氨酸。16. 根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述二醇是（聚）乙二醇。17. 根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述多元醇选自由山梨糖醇、麦芽糖醇、甘 油、赤藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、甘露醇、乳糖醇、异麦芽糖醇或其混合物所组成的组。
【专利摘要】本发明涉及用于低温保存(植物)细胞、(植物)细胞器或(植物)组织的方法，其中在一种或多种具有冷冻保护剂效果的添加剂存在下将所述(植物)细胞、(植物)细胞器或(植物)组织包封在非生物材料形成的基质中。本发明的方法提供一种更快、更有效且更廉价的方式来低温保存生物材料。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105263320
【申请号】CN201480029514
【发明人】克里斯托夫·默尼尔, 卡策姆 皮埃尔·范, 巴奥-利安·苏
【申请人】那慕尔大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年6月11日
【公告号】CA2910925A1, US20160106091, WO2014198760A1