一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种低温保存技术领域的方法，具体涉及一种乌桕茎尖玻璃化超 低温保存的方法。
【背景技术】
[0002] 乌桕(SapiumsebiferumRoxb.)与油桐、油茶、核桃并列为我国四大木本油料植物。 为大戟科(Euphorbiaceae)乌桕属（Sapium)落叶乔木，为我国原生油料树种，在中国已有 1400年的栽培史。乌桕种子外被蜡质，可用于制作肥皂、蜡烛和油漆等工业生产的原料;种 子含油量高达55%，种仁榨取的液体油可作为制取生物柴油的原料，是一种有前景的生物 能源树种。乌桕树姿优美，叶形秀丽，入秋后叶色呈现红、橙、黄、紫等颜色，可作庭院及行道 绿化树种。此外，由于乌桕具有较强的适用性，能在各种土质的土壤生长，具有有较强的耐 寒、耐旱、耐涝和耐盐碱的能力，为很有前景的荒山滩涂树种。因此，乌桕无论是作为油料用 经济作物，景观树种还是荒山滩涂树种，均具有重要的经济和生态价值。
[0003] 种质资源保存是乌桕育种和保持遗传多样性的重要保证，培育高产、优质和高抗 新品种离不开丰富的种质资源，因此开展乌桕种质资源的保存具有重要的意义。
[0004] 目前有关乌桕种质资源的保存方法的研究较少，主要集中在原地栽培、迀地栽培 以及种子库保存，但原地和迀地栽培管理和取材需要大量的人力、物力，且保存的种质资源 占地面积大，易受到病虫害和自然条件的影响。由于乌桕为异花授粉植物，种子高度杂合， 种子库保存很难保持母本株系的优良特性。随着生物技术的发展，基于利用植物组织培养 技术对乌桕种质资源进行保存的研究仅局限于在实验室中对研究材料的保存。一方面保存 过程繁琐、费时费力，成本较高；另一方面，随着保存时间的延长和继代次数的增加，保存的 材料易受到污染的干扰。
[0005] 超低温保存技术是20世纪70年代在低温保存的基础上发展起来的一门新兴技术。 超低温保存通常以液氮(_196°C)为冷源，生物材料保存在如此低温条件下，活细胞内的代 谢活动几乎完全停止，因而可使生物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，且保存过 程中细胞的活力及形态发生的全能性不受影响。因其具有操作简单，可保存时间长，占用空 间小且不受病虫害的干扰等优点，是目前公认的长期而稳定的保存植物种质资源的理想方 法。现已开发出多种超低温保存的方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同品种， 其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同。目前有关利用超低温保存技术对乌桕 种质资源进行保存的研究尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明针对乌桕现有保存技术的不足，提供了一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的 方法，为乌桕优良种质资源的保存提供了技术保证。
[0007] 为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0008] 本发明涉及一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，依次包括:乌桕茎尖剥取、预 培养、装载、玻璃化处理、小液滴制作、超低温冷冻保存、卸载和恢复培养的步骤。
[0009] 优选地，所述的乌桕茎尖剥取具体是指:在无菌条件下，从乌桕植株茎段诱导的不 定芽丛上剥取带有2-3个叶原基，直径大小约为2-3mm的离体茎尖。
[0010] 优选地，所述的预培养是指:将剥取的茎尖接种于添加有〇 . 2-0.5M鹿糖的MS固体 培养上，于25 ± 2°C的恒温培养室黑暗培养l-5d。
[0011] 优选地，所述的装载具体是指:将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下 装载处理10-60min;所述的装载液的组成为:MS+2M甘油+0.4M蔗糖。
[0012] 优选地，所述的玻璃化处理具体是指:将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于 0°C处理l_4h;所述的PVS2溶液的组成为:MS+30 %甘油+15%乙二醇+15 %二甲亚砜+0.4M蔗 糖。
[0013] 优选地，所述的小液滴制作具体是指:将PVS2处理后的茎尖转移到铝箱条上，并向 每个茎尖滴加8-10yL PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箱条上放5-6个 茎尖。
[0014] 优选地，所述的超低温冷冻保存具体是指:将上述制作好的含有小液滴的锡箱条 直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箱条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投 入液氮中保存。
[0015] 优选地，所述的卸载是指:将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进 行解冻和洗涤;所述的卸载液的组分为:MS+1.2M蔗糖;所述的卸载和洗涤条件为:室温下洗 涤茎尖2-3次，每次洗涤时间5-1 Omin。
[0016] 优选地，所述的恢复培养具体是指:将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表 面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养;所述的恢复培养基为MS+0.5-2. Omg/L 6-BA +3 %蔗糖+0.7 %琼脂，pH= 5.8;所述的恢复培养条件为：25 ± 2°C的恒温培养室黑暗培养 7d，最后转至光照强度为40μηιο Inf2 S^2，光照时间为14h的条件下进行植株再生。
[0017] 与现有技术相比，本发明存在以下有益效果：
[0018] 本发明的一种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，是一种长期安全、稳定可靠、简 单有效的保存乌桕优良种质资源的方法，超低温保存后乌桕茎尖成活率高达40%，茎尖再 生率为37.8%;本发明以不定芽茎尖为超低温保存材料，一方面取材方便，另一方面由于茎 尖含有茎尖分生组织，细胞再生能力较强，遗传稳定性高;此外，在利用茎尖对乌桕种质资 源进行超低温保存的同时可获得脱病毒植株，是一种很有前景的乌桕植株脱毒新技术。
【附图说明】
[0019] 图1用于超低温保存的乌桕丛生芽茎尖
[0020] 图2包埋于小液滴置于铝箱条上的茎尖 [0021 ]图3超低温保存后恢复培养14d坏死的茎尖 [0022]图4超低温保存后恢复培养14d存活的茎尖
[0023]图5超低温保存后恢复培养30d诱导出不定芽的茎尖
[0024] 图6恢复培养后茎尖丛生芽的伸长
[0025] 图7乌桕超低温保存茎尖诱导丛生芽的生根
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下 述的实施例。
[0027] 实施例1
[0028] -种乌桕茎尖玻璃化超低温保存的方法，具体操作如下：
[0029] 1)、选取于不定芽诱导培养基上诱导30d的乌桕茎段不定芽丛，剥取直径为2~ 3mm，带有2-3个叶原基的茎尖(图1);
[0030] 2)、将剥下的乌桕茎尖接种在0.3M蔗糖的MS固体培养接种，于25± 2°C的恒温培养 室黑暗预培养2d;
[0031] 3)、将预培养的离体茎尖转接于装载液MS+2M甘油+0.4M蔗糖中，于室温下装载处 理20min;
[0032] 4)、将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0°C处理4h;其中PVS2溶液的组成 为:MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亚砜+0.4M蔗糖；
[0033] 5)、将PVS2处理后的茎尖转移到铝箱条上，并向每个茎尖滴加8~IOyL PVS2溶液， 使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡