利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法
【专利说明】利用传统大豆育种技术培育高油酸大豆的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2009年7月8日提交的美国临时申请系列第61/223,942号的权益。
[0003] 序列表
[0004] 本申请附有纸版和计算机可读形式的序列表，其精确复制了本文所述的序列。
[0005] 背景
[0006] 植物油在多种应用中使用。需要新的植物油组合物以及改进的从生物合成或天然 植物来源获得油组合物的方法。根据油的预期用途，需要多种不同的脂肪酸组合物。植物， 尤其是种子中合成大量油的物种，是食用和工业用油的重要来源。
[0007] 油酸是在多种动植物来源中发现的单不饱和ω-9脂肪酸。油酸被认为是饮食中较 为健康的脂肪来源之一，并且通常可用于替代饱和脂肪含量较高的脂肪来源。
[0008] 脂肪消耗中油酸含量较高的饮食被证实降低胆固醇、动脉硬化和心血管疾病的总 水平。特别地，油酸已被证实能提高被称为"好胆固醇"的高密度脂蛋白（HDL)的水平，同时 降低还被称为"坏"胆固醇的低密度脂蛋白（LDL)。因此，需要开发包含更为健康的脂肪酸形 式的新且廉价的食物来源。
[0009] 植物通过称为脂肪酸合成酶(FAS)途径的共有代谢途径合成脂肪酸。β-酮脂酰-ACP(酰基载体蛋白部分)合酶是植物细胞FAS中重要的限速酶，并且以数种形式存在。β-酮 脂酰-ACP合酶I催化链延长至棕榈酰-ACP(C16:0)，而β-酮脂酰-ACP合酶II催化链延长至硬 脂酰-ACPKlSA)。^-酮脂酰-ACP合酶IV是β-酮脂酰-ACP合酶II的变体，且也能催化链延长 至18:0-ACP。在大豆中，FAS的主要产物是16:0-ACP和18:0-ACP。18:0-ACP去饱和形成18:1 -ACP由定位于质体的可溶的△ -9去饱和酶(也称为"硬脂酰-ACP去饱和酶"）催化。
[0010] 质体FAS和Δ -9去饱和酶的产物16:0-ACP、18:0-ACP和18:1-ACP由特定的硫酯酶 (FAT)水解。基于序列同源性和底物偏爱性可以将植物硫酯酶分成两个基因家族。第一家族 FATA包括主要活性在18:1-ACP上的长链酰基-ACP硫酯酶。第二家族的酶FATB通常利用16: 0-ACP(棕榈酰-ACP)、18:0-ACP(硬脂酰-ACP)和18:1-ACP(油酰-ACP)。在植物从头生物合成 脂肪酸的过程中，这类硫酯酶在决定碳链长度上具有重要作用，并且因而这些酶可用于提 供脂酰基组合物的各种修饰，尤其关于种子贮存油中所存在的各种脂酰基的相对比例。
[0011] FATA和FATB反应的产物，游离脂肪酸，离开质体并被转化成其各自的酰基辅酶A 酯。酰基辅酶A是定位于内质网(ER)的脂质生物合成途径(Kennedy途径）的底物。该途径负 责膜脂形成以及三酰甘油的生物合成，三酰甘油构成种子油。在ER中，有其它的膜结合去饱 和酶，它们还能使18:1去饱和为多不饱和脂肪酸。
[0012] 大豆基因组具有Δ-12去饱和酶FAD2的两种种子特异的同种型，称为FAD2-1A和 FAD2-1B，它们仅在24个氨基酸残基上不同。大豆基因组序列上编码FAD2-1A和FAD2-1B的基 因分别称为Linkage Group 0上的Glymal0g42470和Linkage Group I上的Glyma 20g24530 (Glymal.O,大豆基因组计划，DoE Joint Genome Institute) DFAD2-1A和FAD2-1B见于ER 中，在那里它们能使油酸进一步去饱和为多不饱和的脂肪酸。A-12去饱和酶催化向油酸 (18:1)中插入双键，形成亚油酸（18: 2)，这导致由此引起的油酸水平的降低。Δ-15去饱和 酶(FAD3)催化向亚油酸（18:2)中插入双键，形成亚麻酸（18:3)。
[0013]表1.主要脂肪酸的特征
[0016] 名称（18:2)，（18:1)，（18:3)等是指脂肪酸链中的碳原子数以及其中的双键数，表 1。本文所用的，该名称有时代替相应的脂肪酸俗名。例如，油酸（18:1)含有18个碳原子和1 个双键，并且有时就简单地称为"18: Γ。
[0017] 尽管之前的研究已经证实FAD2-1A基因用于提高油酸的重要作用，但是还没有报 道证实FAD2-1B基因对油酸累积的直接影响。大豆是经济作物，其提供了美国饮食中脂肪和 油的主要部分。大豆被认为是含油种子，其通常含有约20%的油酸，为种子油中脂肪酸特征 的一部分。
[0018] 大豆油被食品工业用于各种食品中，包括食用油、色拉酱、三明治酱、人造黄油、面 包、蛋黄酱、无乳咖啡伴侣和点心。大豆油还用于工业市场如生物柴油和生物润滑油市场。
[0019] 对于很多油的应用，需要具有低饱和脂肪酸水平。饱和脂肪酸具有高熔点，这在很 多应用中是不想要的。当用作原料或燃料时，饱和脂肪酸在低温导致混浊，并且为燃料赋予 较差的冷流特性如倾点和冷滤点。含有低饱和脂肪酸水平的油产品可能是消费者和食品工 业所优选的，因为它们被认为更加健康和/或根据FDA指导方针被标为"饱和脂肪较低"。此 外，低饱和油降低或消除了使如色拉油的用于食品应用的油防冻的需要。在生物柴油和润 滑油应用中，具有低饱和脂肪酸水平的油赋予改善的冷流特性，并且在低温时不混浊。
[0020] 用于在大豆植物中产生中至高油酸水平的各种技术是已知的。例如，美国专利公 开号2007/0214516公开了用于获得具有中等提高水平的油酸的大豆植物的方法。然而，该 项技术需要通过转基因技术引入转基因而对大豆植物进行基因修饰。
[0021] 尽管已产生的转基因大豆品系能产生中至高水平油酸的大豆油，但是仍需要能产 生中至高油酸含量种子的非基因修饰的(非-GM0)大豆植物品系。
[0022] 发明概述
[0023] 本公开方法通过提供产生和选择在大豆种子油中含有大于约20%且高达约85% 油酸(高达商品大豆所产生水平的4倍以上）的传统非-GM0大豆品系的方法而克服上文概括 的问题并使得现有技术得到发展。本文所述的方法证实了，在无需传统大豆育种中所用的 昂贵测试和评价的情况下，将提尚的油质量性状有效并入大?植物优良品种中的能力。
[0024]本公开方法证实了，单独的AD2-1B基因突变导致油酸水平有很小的提高。然而， FAD2-1A和FAD2-1B基因突变的组合导致种子油的油酸水平显著提高。
[0025] 在一实施方案中，大豆植物在FAD2-1A和FAD2-1B基因中具有一个或多个突变，其 中来自所述植物的种子具有约75 %至约85 %的油酸含量。
[0026] 在一实施方案中，表达突变FAD2-1B基因，并且表达突变FAD2-1A基因或表达M23突 变体的大豆植物具有脂肪酸组成得到改善（即具有约75%至约85%油酸）的种子，所述突变 FAD2-1B基因由与SEQ ID N0:1 或SEQ ID N0:3序列具有至少70%、80%、90%、95%、98%或 99%同一性的多核苷酸所编码，所述突变FAD2-1A基因由与SEQ ID N0:7序列具有至少 70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的多核苷酸所编码，所述M23突变体的特征为缺 失具有SEQ ID从):5所示序列的?六02-^基因。
[0027] 在一实施方案中，描述了选择种子具有约65%至约85%油酸含量的大豆植物的方 法，所述方法包括:将在SEQ ID N0:9所示的第一多核苷酸序列中具有一个或多个突变的第 一大豆植物与在SEQ ID N0:11所示的第二多核苷酸序列中具有一个或多个突变的第二大 豆植物杂交。
[0028] 在一实施方案中，描述了编码突变形式的FAD2-1B的核酸，其包含：编码SEQ ID NO: 12或其片段的至少72个核苷酸(24个氨基酸）的序列长度，其中所述序列包括至少一个 选自以下的突变:a.在第137位氨基酸处的非保守型氨基酸取代，和b.在第143位氨基酸处 的非保守型氨基酸取代。
[0029] 在一实施方案中，表达突变FAD2-1B基因的大豆植物具有脂肪酸组成得到改善（即 具有约22%至约41%油酸）的种子，所述突变FAD2-1B基因由与SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:3 序列具有至少70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 %同一性的多核苷酸所编码。
[0030] 在一实施方案中，表达导致FAD2-1B活性降低的突变FAD2-1B基因的大豆植物具有 油酸水平大于约20%的脂肪酸组成得到改善的种子。
[0031] 在一实施方案中，表达FAD2-1B显性失活形式的转基因大豆植物具有油酸水平大 于20%的脂肪酸组成得到改善的种子，所述油酸水平优选约20%至60%，且最优选约60% 至 85%。
【附图说明】
[0032]图1A和1B是展示了脂肪酸去饱和酶的氨基酸保守性的weblogo输出。
[0033]图2是说明相对脂肪酸水平作为来自M23XPI 283327重组自交系的子代的总脂肪 酸函数的直方图。
[0034]图3是说明油酸含量作为亲本和来自M23XPI 283327重组自交系的亲本和子代的 总脂肪酸函数的直方图。
[0035]图4是说明油酸含量作为来自17DXPI 283327F2种子的子代的总脂肪酸函数的直 方图。
[0036]图5是说明油酸水平作为来自M23XPI 567189A重组自交系的子代的总脂肪酸函 数的直方图。
[0037]图6是说明油酸水平作为来自Jake XPI 283327重组自交系的子代的总脂肪酸函 数的直方图。
[0038] 图7是用于确定多种FAD2等位基因基因型的熔解曲线分析的图形表示。
[0039] 图8是说明油酸水平作为群1的总脂肪酸函数的直方图。
[0040] 图9是说明油酸水平作为群2的总脂肪酸函数的直方图。
[0041 ]图10是说明油酸水平作为群3的总脂肪酸函数的直方图。
[0042]发明的详细描述
[0043] 本文所用的"等位基因"是指基因座的一个或多个可选形式中的任一个，所有的等 位基因均涉及性状或特征。在二倍体细胞或有机体中，给定基因的两个等位基因占据一对 同源染色体的对应基因座。
[0044] 本文所用的"FAD2"是指能催化向羧基末端数第12位的脂酰基部分插入双键的基 因或所编码的蛋白。FAD2蛋白也被称为"Δ-12去饱和酶"或"ω-6去饱和酶"。术语"FAD2-1Α" 用于指 Glymal · 0全基因组序列（http : //www · phytozome · net/soybean )中 Glymal0g42470.1所限定的FAD2基因或蛋白，其以特定的方式在种子组织中天然表达，术语 "FAD2-1B" 用来指Glymal · 0全基因组序列（http : //www· phytozome .net/soybean)中 Glyma20g24530.1所限定的FAD2基因或蛋白，其是(a)不同于FAD2-1A基因或蛋白的基因，并 且其(b)在多种组织中天然表达，包括种子。
[0045] 本文所用的"基因"是指包含与基因产物表达相关的5'启动子区、任何内含子和外 显子区以及与基因产物表达相关的3'或5'非翻译区的核酸序列。
[0046] 本文所用的"基因型"指细胞或有机体的基因组成。
[0047] 本文所用的"表现型"指细胞或有机体的可检测的特征，该特征是基