切下，将组培小鳞茎纵切2-4块分别接种于对照组(诱导培养基)和实验组(诱导培养基+一定浓度的抗病毒药物)上，继续培养；连续切割，继代三次后，RT-PCR检测病毒苗携带病毒的情况。
[0013](6)组培苗病毒检测:根据检测病毒的种类:百合无症病毒(Lily symptomlessvirus, LSV),黄瓜花叶病毒(CMV),百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMo V)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus, LRV)按照已知基因序列设计特异性引物,经RT-PCR检测无扩增为阴性脱毒苗。
[0014]脱毒率= RT-PCR检测无扩增条带样品苗数_
RT-PCR总检测苗数
阳性率= RT-PCR检测出扩增条带样品苗数_
RT-PCR总检测苗数
所述的一种使用复方盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于，最佳诱导培养基配方:MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0%蔗糖 + 琼脂粉 6.0g/L (PH 5.8)。
[0015]所述的一种使用复方盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于，实验组所使用的药剂复方盐酸金刚烧胺(Amantadini Hydrochloridum)的最适浓度14mg/L,脱毒率可达到87%。
[0016]研究发现，本发明通过正交法确定使百合直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，以及对百合进行脱毒所使用的复方盐酸金刚烷胺药剂的最适浓度，达到脱毒效率高，时间短等优点。
[0017]本发明与现有技术相比，其显著优点是极大的提高了组培苗的脱毒效率，为培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。
【具体实施方式】
[0018]
通过下面的实施例对本发明进一步的说明。
[0019]实施例:(脱毒组培苗的病毒检测)
(I)植物材料
分别以对照组和实验组的组培苗为材料。
[0020](2)病毒RNA的提取
采用TRIzoI试剂，分别对每个供试样品进行总RNA的提取，提取过程中使用的RNase-free水的配制方法:将洗净玻瓶中加满0.1% (v/v)DEPC超纯水，过夜处理后玻瓶高压灭菌；RNase-free的塑料和玻璃器皿处理方法:玻璃器皿可在150°C烘烤6小时；塑料器皿在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再高压灭菌。具体操作步骤如下:
1)供试样品直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物样品加入Iml TRIzol0样品加入TRIzoI后，室温放置5min，使样品充分裂解；
2)4。。，12，OOOrpm离心10分钟，取上清；
3)每ImlTRIzol加入200 μ I氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3_5min使其自然分相；
4)4。。，12,OOOrpm离心10_15min。将最上层水相转移到新管中；
5)在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4°C,12, OOOrpm离心lOmin，弃上清，RNA沉淀于管底；
6)RNA沉淀中加入Iml 75%乙醇(用RNase-free水酉tl制)，温和振荡离心管,悬浮沉淀；
7)4V ’ 5，000-8，OOOrpm离心l_2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀；
8)沉淀中加入50-100μ I RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70°C保存。
[0021](3)病毒各基因序列的扩增 a)病毒序列PCR扩增引物的设计
根据已报道的百合无症病毒(Lily symptomless virus, LSV),黄瓜花叶病毒(CMV),百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMoV)病毒,百合丛族病毒(Lily rosettle virus,LRV)的外壳蛋白基因的序列设计Tm = 55°C的PCR反应特异性引物。
[0022]b) cDNA第一链的合成
采用病毒外壳蛋白基因PCR下游引物作为反转录第一链的起始引物，反转录合成反应体系如下:将Iug总RNA置于离心管中，置于70°C水浴中lOmin，短暂离心后马上转移到冰中。将反应液与变性后总RNA混合，反应体系如下:
Reverse transcript1n 1Xbuffer 2.0 μ I
dNTP mixture, 1mM2.0 μ I
MgC12，25mM4.0 μ I
Recombinant RNasin?Ribonuclease inhibitor 0.5 μ I
AMV reverse transcriptase(High Cone.) 1.5u
Virus coat protein gene PCR reverse primers，1mM 1.0 μ I
Total RNA l.0ug
Nuclease-Free water to a final volume of 20 μ I
反转录反应在42°C下进行15min,反应完成后95°C,5min失活反转录酶,转入4°C保温5min。-20°C保存备用。
[0023]c)逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
以反转录cDNA产物为模板，设置不加模板cDNA的PCR反应为阴性对照，按如下体系进行:
10XPCR react1n buffer (Mg2+plus)2 μ I
dNTP mixture, 1mMI μ I
Virus coat protein gene PCR forward primer, 1mMI μ I
Virus coat protein gene PCR reverse primer, 1mMI μ I
Reverse transcript1n cDNA productslug
Taq, 5U/μ I0.2 μ I
Nuclease-Free water to a final volume of20 μ I
PCR程序:
94°C,5min ;94°C，30s，55°C，30s，72°C，lmin，30 个循环；72°C, 1min0 PCR 产物 1%琼脂糖凝胶电泳，SYBR Green染色，紫外灯下观察，检测有无目标扩增片段，照相记录。
[0024](4) RT-PCR 产物检测
当不加模板cDNA的阴性对照PCR反应无目标扩增产物时，有目标扩增条带的个体为病毒感染植株，无目标扩增条带的个体为无病毒感染植株，即脱毒植株。
【主权项】
1.一种使用复方盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于按如下步骤进行: (1)材料选取:“西伯利亚”(Siberia)、“索邦”(Sorbonne)种球； (2)百合种球病毒的检测:选取供试种球的球茎鳞片，提取总RNA，反转录后作为模板，采用反转录PCR(reverse transcript1n PCR, RT-PCR)检测,确定种球鳞片是否携带病毒; (3)培养基的配制、备用:基本培养基为MS培养基；采用正交法研究6-BA和NAA浓度对百合组培的影响，确定可直接分化成芽和无根组培苗的最适6-BA和NAA浓度，配制最佳诱导培养基；采用1，3，5，6，7，8，9，10，12，14，16，18mg/L的浓度配制含抗病毒药物的培养基；抗病毒药物采用0.2u滤膜过滤除菌； (4)外植体灭菌、接种:将检测被病毒感染的百合鳞茎用自来水冲洗过夜，0.1%升汞灭菌10分钟，然后在75%酒精浸泡20秒；取出材料，用无菌水冲洗5-6遍；将材料切割成2.0mmX 2.0mm小方块，接种于最佳诱导培养基上培养； (5)外植体培养:在温度25±1°C,光照12h/d,光照强度1500Lx的环境条件下培养45-50天，百合鳞茎外植体直接分化成鳞茎芽和无根组培苗；进一步将叶片切下，将组培小鳞茎纵切2-4块分别接种于对照组(诱导培养基)和实验组(诱导培养基+ —定浓度的抗病毒药物)上，继续培养；连续切割，继代三次后，RT-PCR检测病毒苗携带病毒的情况； (6)组培苗病毒检测:根据检测病毒的种类:百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus, LSV),黄瓜花叶病毒(CMV),百合斑驳病毒(Lily mottle virus, LMo V)病毒，百合丛簇病毒(Lily rosettle virus,LRV)按照已知基因序列设计特异性引物,经RT-PCR检测无扩增为阴性脱毒苗。2.根据权利要求书I所述的一种使用复方盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于最佳诱导培养基配方:MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.35mg/L+4.0%蔗糖+琼脂粉 6.0g/L (PH5.8) ο3.根据权利要求书I所述的一种使用复方盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法，其特征在于实验组所使用的药剂复方盐酸金刚烧胺(Amantadini Hydrochloridum)的最适浓度14mg/L，脱毒率可达到87%。
【专利摘要】本发明公开了一种使用复方盐酸金刚烷胺药剂对百合脱毒培养的方法，属于植物组培快繁技术和生物技术领域。该方法包括：百合种球病毒的检测、培养基的配制、备用、外植体灭菌和接种、外植体培养、组培苗的病毒检测等步骤，快速获得大量脱毒组培苗。本发明通过正交法获得百合直接分化成芽和无根组培苗的最佳诱导培养基配方，以及通过配制一系列浓度梯度的复方盐酸金刚烷胺抗病毒药剂，筛选出最适脱毒浓度，脱毒效率可达到？87％，不仅缩短了诱导培养周期，还具有脱毒率高，增值系数高等特点，为培育百合无病毒植株，推广无毒化栽培的研究提供了技术基础。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105557512
【申请号】CN201410582897
【发明人】杨长能
【申请人】松桃宏发肉食品有限责任公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月28日