非哺乳类ras转基因动物模型的制作方法
【专利说明】非哺乳类RAS转基因动物模型
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2013年8月20日提交的美国临时专利申请序 列号61/867,979的申请日的优先权，该申请的公开内容通过引用并入本文。
[0003] 介绍
[0004] RAS(大鼠肉瘤)蛋白是在调节细胞分化、增殖和生存中发挥作用的低分子量的GTP 结合/GTP酶家族（Wennerberg等，"The RAS superfamily at a glance"，J.Cell Sci. (2005)118:843-846;Adjei，"Blocking oncogenic RAS signaling for cancer therapy"，J Natl .Cancer · Inst · (2001)93:1062-1074) JAS家族具有三个主要成员：hRAS、 nRAS和kRAS。所有成员促进癌症形成和进展（Karnoub等，"RAS oncogenes:split personalities"，Nat.Rev.Mol .Cell Biol. (2008)9:517-531)。图 1 提供了对于 RAS 系统提 出的信号传导通路。应注意的是，通过激活酪氨酸激酶的信号传导的启动与多种膜结合生 长因子相关。几乎所有这些生长因子(例如，EGF)对于肿瘤的生长很重要。
[0005] 在约30 %的人癌症中发现了 RAS的突变。图2中提供了人kRAS的序列，其中标记了 主要突变位点。已证明不存在RAS突变时，人肿瘤中RAS活性的增加是基因扩增或上游激活 增加的结果（Friday 等，" K-RAS as a target for cancer therapy"， Biochim.Biophys.Acta(2005) 1756:127-144) JAS基因的影响残基G12的单点突变(G12V) 以及影响残基G13的单点突变(G13D)通过位阻消除了 GAP诱导的GTP水解，而Q61L突变干扰 GTP水解所需的水分子的协调性（Pylayeva-Gupta等，"RAS oncogenes : Weaving a tumorigenic web"，Nat ·Rev.，Cancer(2011 )11:761-774)。这些突变使得蛋白质具有组成 型活性，并且活性GTP结合RAS的持续导致持续激活其下游效应子途径。
[0006] kRAS是最频繁突变的RAS亚型，并且在癌症中最频繁发现突变的蛋白质之一。例 如，其在90 %的胰腺癌、45 %的结直肠癌和35 %的肺腺癌中突变(Downward，"Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy"，Nat.Rev·Cancer(2003)3:11-22)〇kRAS 突变与致瘤性增加和不良预后相关。另外，在体外和体内两种情况下抑制活化的RAS使恶性 细胞回归良性表型并伴随着肿瘤退化(Podsypanina等，"Oncogene cooperation in tumor maintenance and tumor recurrence in mouse mammary tumors induced by Myc and mutant kRAS"，Proc.Natl.Acad·Sci·U.S·A.(2008)105:5242-5247;Chin等，"Essential role for oncogenic RAS in tumour maintenance"，Nature 1999;400:468-472)。
[0007] 由于RAS蛋白（包括kRAS)经常参与癌症的发作和进展，kRAS是多种癌症的有吸引 力的治疗靶标。致瘤性RAS信号传导的有效抑制即使到现在也被认为是癌症研究的"圣杯 (Holy Grail)''（Spiegel等，"Small-molecule modulation of Ras signaling.Nat Chem Biol. (2014) 10:613-22)。尽管作为癌症治疗剂的组成型活性kRAS蛋白的小分子抑制剂的 开发是理想的，但是对于革E向突变kRAS的GTP结合口袋(GTP binding pocket)的药物的25 年的研究未能产生成功的分子（Vasan等，"A RAS Renaissance:Emerging Targeted Therapies for kRAS-Mutated Non-Small Cell Lung Cancer"，Cl in Cancer Res.(2014) 20:3921-3930)。迄今，没有特异性靶向突变kRAS的有效疗法可用。靶向kRAS的组成型活性 分子开关非常困难，因为GDP或GTP的作用是稳定RAS蛋白的无活性或活性状态(Gysin等， "Therapeutic strategies for targeting RAS proteins'，，Genes Cancer(2011)2:359-372)。这种情况不同于蛋白激酶，在后者中磷酰基从ATP转移到底物是一个快速的酶促过 程。另外，由于kRAS和GTP之间的pM亲和力以及细胞内GTP的微摩尔浓度，不太可能发现竞争 性抑制剂。此外，kRAS激活和信号传导通过与鸟苷酸交换因子(GEF)、GTP酶活性蛋白（GAP) 和多种kRAS效应蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)实现(Sun等，"Discovery of small molecules that bind to K-RAS and inhibit SOS-mediated activation'，， Angew. Chem.，Int .Ed. (2012)51:6140-6143) D由于所涉及表面平凡的拓扑结构，对于革巴向 PPI来说是一个挑占戈（Fletcher等，"Targeting protein-protein interactions by rational design:mimicry of protein surfaces^,J.R.Soc. Interface(2006)3:215-233)。考虑到kRAS系统的复杂性，使用多种直接乃至几乎完全间接的方法来靶向异常kRAS 信号传导的尝试的失败是毫无意外的。
[0008] 在RAS蛋白翻译后，其必须经历图3中所示的一系列翻译后修饰（Ghobrial等， "Inhibitors of the RAS oncogene as therapeutic targets'，， Hematol.Oncol.Clin.North Am. (2002)16:1065-1088；Adjei,uFarnesyltransfeRASe inhibitors"，Cancer Chemother.Biol.Response Modif·(2001)19:149-164;Cho等， "Chemistry and biology of RAS farnesyltransfeRASe"，Arch·Pharm.Res·(2002)25: 759-769) ^最初，kRAS中末端半胱氨酸的硫醇基通过法尼基转移酶(FTase)法尼化(Casey 等，"p21RAS is modified by a farnesyl isoprenoid"，Proc·Natl·Acad·Sci·U.S·A. (1989)86:8323-8327;Cox等，"FarnesyItransfeRASe inhibitors and cancer treatment: targeting simply RAS?"，Biochim.Biophys·Acta(1997)1333:F51-F71; Hancock等，"A11 RAS proteins are polyisoprenylated but only some are palmitoylated"Ce11(1989)57,1167-1177;Hancock等，"A polybasic domain or palmitoylation is required in addition to the CAAX motif to localize p21RAS to the plasma membrane"，Cell(1990)63:133-139)。接着，CAAX(C =半脱氨酸;A =异亮氨 酸;X =丝氨酸或甲硫氨酸）（Boyartchuk等，"Modulation of RAS and a_factor function by carboxyl-terminal proteolysis"，Science(1997)275:1796-1800;Otto等，"Cloning and characterization of a mammalian prenyl protein-specific protease'，， J.Biol.Chem. (1999)274:8379-8382)蛋白酶RAS转化酶 1(RCE1)切割末端AAX氨基酸，并且 半胱氨酸的羰基通过异戊稀半胱氨酸羰基甲基转移酶I(isoprenylcysteine carboxy lme thy It ran sf erase I，ICMT I)甲基化（Clarke 等，"Post translational modification of the Ha-RAS oncogene protein: evidence for a third class of protein carboxyl methyltransfeRASes^,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85:4643-4647;Hrycyna等，"The Saccharomyces cerevisiae STE14 gene encodes a methyltransfeRASe that mediates C-terminal methylation of a-factor and RAS prote ins"，ΕΜΒ0 J.(1991)10:1699-1709;Dai等，"Mamma1ian prenyl cysteine carboxylmethyltransfeRASe is in the endoplasmic reticulum"，J.Biol.Chem.(1998) 273:15030-15034)。最后，棕榈酰基转移酶(PTase)转移棕榈酰基到位于紧接hRAS、nRAS和 kRAS的C末端的下游半胱氨酸残基上。RAS蛋白然后与细胞膜通过其法尼基和棕榈酰基以及 带正电的C末端赖氨酸残基形成稳定相互作用。
[0009] kRAS的翻译后下游修饰提供了多个可能的药物靶标：法尼基转移酶抑制剂 (FTase) (Appels 等，"Development of farnesyltransf eRASe inhibitors : a review'，， Oncologist(2005) 10:565-578)、CAAX内肽酶(Wright等，"Thematic review series: lipid posttranslational modifications.CAAX modification and membrane targeting of RAS"，J.Lipid Res.(2006)47:883-891;Manandhar等，"Chemical inhibition of CaaX protease activity disrupts yeast RAS localization"，Yeast(2010)27:327_343)、甲 基车专移酉每（Winter-Vann 等，"A small-molecule inhibitor of isoprenyl cysteine carboxyl methy11ransfeRASe with antitumor activi