6) DPI3K途径激活 AKT并且导致促存活基因的转录、细胞骨架重塑和多种转录因子途径(最显著的NF-κΒ)的激 活（Rodriguez-Viciana等，"Phosphatidylinositol-3-OH kinase as a direct target of RAS"，Nature(1994)370:527_532;Pacold等，"Crystal structure and functional analysis of RAS binding to its effector phosphoinositide 3-kinaseγ'，，Cel1 (2000) 103:931-943) AAL1结合蛋白的激活导致参与细胞生长、增殖和分化的FOX转录因子 被抑制（De Ruiter等，"Regulation of the Forkhead transcription factor AFX by Ral-dependent phosphorylation of threonines 447and 451?，,Mol.Cell.Biol.(2001) 21:8225-8235) Aal⑶S还可以通过JNK途径进行信号传导以刺激促存活基因和细胞周期进 展基因的转录(6〇112含162-6&1'(^&等，"1^1603 is required for tumor formation in a model of skin carcinogenesis"，Cancer Cell(2005)7，219-226;Hofer等，"Activated RAS interacts with the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator"， Proc .Natl. AcacL Sci.U.S. A. (1994)91:11089-11093) JLCe的激活导致蛋白激酶 C(PKC)激 活以及来自细胞内储库的f丐的动员。
[0014] kRAS的这些下游效应子代表了当前在制药工业中研究的一些最重要的癌症靶标。 kRAS的这些下游靶标的重要性提供了 kRAS在癌症进展和传播中的重要性的进一步证据。
[0015] 除了kRAS在促进癌症中的显著作用外，这种GTP酶还在影响抑制EGF途径的主要类 型抗癌药物的效力中具有关键作用。如之前提到的，kRAS是控制细胞增殖、分化和存活的 EGFR下游信号传导级联中的主要效应分子。kRAS从EGFR受体向主要信号传导系统如MAPK和 PI3K-AKT系统传递生长信号。突变的kRAS允许EGFR系统绕过存在于EGF系统中的天然控制， 并且锁定在促生长模式连续工作(野生型kRAS是自失活的，而致癌性kRAS不是自失活的）。 与该机制一致，突变kRAS的存在预示着缺少对用于治疗结直肠癌和许多其他癌症的抗EGF 单克隆抗体药物如帕尼单抗(Vectibix? )或西妥昔单抗(E_r bitux? )的响应。事实上，当前 预测结直肠癌患者是否响应于这些常用EGFR抑制药物之一的最可靠方法是测试编码kRAS 的基因中的"活化"突变。在这点上，作为缺乏对抗EGF治疗剂的响应的预测，G12V突变似乎 比 G13D 突变更有效。（Chen 等，"Association between kRAS codon 13 mutations and clinical response to anti-EGFR treatment in patients with metastatic colorectal cancer:results from a meta-analysis"，Cancer Chemother Pharmacol. (2013)71:265_72;Mao C等，"kRAS p.G13D mutation and codon 12 mutations are not created equal in predicting clinical outcomes of cetuximab in metastatic colorectal cancer:a systematic review and meta-analysis"，Cancer.(2013)119: 714-721)。
[0016] 在2009年，FDA将治疗转移性结直肠癌的帕尼单抗和西妥昔单抗的标签更新为包 括关于利用这些具有kRAS突变的试剂失活的信息。因此，靶向造成使这些药物失活的突变 形式的kRAS而不影响其正常形式的药物应恢复抗EGF药物的活性。
[0017] 概述
[0018] 提供了包含RAS转基因的非哺乳类转基因动物，例如蝇。还提供了使用本发明的转 基因非哺乳类动物来鉴定具有关于细胞增殖疾病（例如，肿瘤疾病）的活性的化合物的方 法。
[0019] 附图简述
[0020]图1.RAS的信号传导途径。与活化的生长因子受体缔合的酪氨酸激酶经历自磷酸 化并且与接头蛋白SHC和GRB2相互作用。这些蛋白质与多种GEF缔合，后者将⑶P交换成GTP， 从而激活RAS蛋白。GAP刺激RAS蛋白的固有GTP酶活性，引起GTP水解成GDP，从而使蛋白质失 活。
[0021] 图2.标记了主要突变位点的人kRAS的序列。
[0022] 图3.RAS蛋白的翻译后加工。法尼基转移酶(FTase)催化法尼基向新合成的RAS蛋 白的末端半胱氨酸转移。接下来，通过内肽酶RAS转化酶1 (RCE1)切割三个C末端氨基酸。通 过异戊烯半胱氨酸羧甲基转移酶1(ICMT I)实现末端半胱氨酸残基的羧甲基化。最后，棕榈 酰基转移酶(PTase)将棕榈酰基转移到HRAS、NRAS和kRAS-4A同种型的C末端半胱氨酸残基 上。
[0023]图4.RAS的下游信号传导。RAS与多种下游效应子相互作用。主要包括RAF蛋白激 酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、RAS相关蛋白Ral的鸟苷酸交换因子(RalGDS)和磷脂酶Ce (ΡΙΧε)0
[0024] 图5.示出了使用根据本发明实施方案的基因修饰蝇的药物筛选方案的图。
[0025] 图6.12V 人 kras基因。
[0026] 图7.示出了Bgl II和Xho I位点的位置的pUAST图。
[0027] 图8.对照（仅GAL4)蝇、kRAS突变(G12V)蝇以及利用溶解在DMS0中的de 1 taras in类 似物从kRAS/kRAS X MSI 096GAL4突变F1表型中拯救的蝇的图片。
[0028] 发明详述
[0029] 提供了包含RAS转基因的非哺乳类转基因动物，例如蝇。还提供了使用本发明转基 因非哺乳类动物来鉴定具有关于细胞增殖疾病(例如，肿瘤疾病)的活性的化合物的方法。
[0030] 在非常详细描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于描述的特定实施方案，其 本身无疑可以变化。还应理解的是，本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而 不是旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求限制。
[0031] 当提供值的范围时，应理解的是，该范围的上限和下限之间的每一个介入的值(除 非上下文另外明确指出，否则为下限单位的十分之一）以及该指出的范围中的任何其他指 出的或介入的值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在较小范围 内，并且也涵盖在本发明内，符合指出的范围中的任何特定排除限。当指出的范围包含一个 或全部两个界限时，排除一个或全部两个这些包含的界限的范围也包括在本发明内。
[0032] 某些范围在本文中通过前面带有术语"约"的数值表述。术语"约"在本文中用于为 其后面的精确数字以及紧接或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定一个 数字是否接近或近似于特别叙述的数字时，接近或近似的未叙述数字应该为在其所存在的 语境中提供特别叙述的数字的基本等效果的数字。
[0033] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通 技术人员的通常理解相同的含义。虽然在本发明的实践和测试中可以使用与本文描述的那 些类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述代表性示例性方法和材料。
[0034] 本说明书引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独出版物或 专利均被明确和单独地指出通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与出版物 引用的那些相关的方法和/或材料。对于任何出版物的引用是为了其在申请日之前的公开 内容，并且不应解释为承认本发明没有资格凭借在先发明而先于该出版物。另外，提供的出 版物的日期可能不同于实际公开日，后者可能需要单独确认。
[0035] 应注意，如本文以及所附权利要求中所使用，单数形式的"一个(a)"、"一种(an)" 和"所述(the)"包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。还应注意，权利要求可能拟定 为排除了任何任选的要素。因此，该陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述联用的此类 排他性术语如"唯"、"仅"等或使用"负性"限制的前提基础。
[0036] 在阅读本公开内容后，对本领域技术人员将显而易见的是，本文描述和示例的每 一个单独实施方案具有离散元件和特征，其可以容易地与任意其它若干个实施方案的特征 分离或组合而不脱离本发明的范围和精神。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或者 任意其他逻辑上可行的顺序实施。
[0037]转基因动物模型
[0038] 如上文概括的，本发明的方面包括非哺乳类RAS转基因动物。许多不同类型的非哺 乳类多细胞生物体可用于本发明方法，其中这些类型的生物体包括昆虫、两栖类、鱼等。具 体的感兴趣的生物体包括但不限于：爪蟾（Xenopus)、斑马鱼（Zebraf ish)、隐杆线虫 (Caenerhabditis)、果绳(Drosophila)等。在某些实施方案中感兴趣的是无脊椎动物，例如 节肢动物门的成员，包括昆虫纲的成员。在某些实施方案中感兴趣的是蝇。在一些情况下， 绳是果绳(Drosophilidae)科的成员，例如黑腹果绳（Drosophila melanogaster)。本发明 中使用的多细胞生物体可以处于其生命中的任何年龄段，例如，幼体阶段、成体阶段等。
[0039] 感兴趣的转基因动物的一些方面是动物具有稳定整合的RAS转基因。术语"转基 因"在本文中用于描述已经被或将要被人为插入到细胞基因组中的遗传物质。因为感兴趣 的动物的整合的转基因是RAS转基因，转基因包括编码RAS蛋白的ras核酸编码序列。在一些 情况下，RAS蛋白是hRAS、nRAS或kRAS。在一些情况下，编码的RAS蛋白是哺乳动物RAS蛋白， 例如小鼠或人RAS蛋白。
[0040] 在一些情况下，转基因编码野生型RAS蛋白的变体，其中感兴趣的变体包括同源 物、突变体等。在一些情况下，编码的RAS蛋白是RAS同源物。所谓同源物意指与野生型RAS蛋 白（例如，具有图2中提供的序列的人kRAS)相比具有至少10%或更多，例如20%或更多，并 且包括30 %或更多，例如35 %或更多，40 %或更多，并且包括60 %或更多的氨基酸序列同一 性的蛋白质，如使用D.G.Higgins和P.M.Sharp,"Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer，"（1989)CABI0S，5:151-153中描述的MegAlign，DNAstar (1998)clustal算法(使用的参数为ktuple 1，缺口罚分3,窗口5以及diagonal saved 5)确 定的。在一些实施方案中，感兴趣的同源物具有更高的序列同一性，例如65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%或更高。还感兴趣的是与野生型蛋白质基本相同的蛋白质，其中所谓基本 相同意味着该蛋白质与野生型蛋白质的序列具有60%或更多，例如65%或更多，并且包括 70%或更