多的氨基酸序列同一性，其中在一些情况下，同一性可以更高，例如75%、80%、 85%、90%、95% 或更高。
[0041] RAS转基因还可以编码突变RAS蛋白。突变体可以保持野生型（例如，天然存在的） 蛋白质的生物学特性，或者可以具有不同于野生型蛋白质的生物学特性。突变体可以变化， 并且可以包括单氨基酸改变、一个或更多个氨基酸(其可以连续或不连续)的插入或缺失，N 末端截短、C末端截短等。
[0042] 在一些情况下，转基因编码包括一个或更多个氨基酸取代突变的突变人kRAS蛋 白。感兴趣的取代突变包括G12突变、G13突变和Q61突变。例如，突变蛋白可以包括G12X突 变，其中X是G以外的任意氨基酸。具体的取代突变包括但不限于:G12V、G13D和Q61L。
[0043]在一些情况下，转基因动物中的RAS转基因表现为动物成体阶段中显著的非致死 性表型。所谓非致死性意味着成体是活的并且在至少足够观察表型的时间段例如1天或更 久、5天或更久、10天或更久等表现出表型。所谓可观察的表型意味着在动物的成体阶段表 型可以在视觉上观察到，以及可以在任何解剖特征中观察到。例如，对于蝇，解剖学特征包 括眼、翅、腿等。当解剖学特征是眼时，感兴趣的可观察的表型包括但不限于粗糙边缘、存 在/缺失、颜色、形状、粗糙边缘等。当解剖学特征是翅时，感兴趣的可观察的表型包括但不 限于:褶皱翅、不完全翅(翅缺失一个或更多个部分)等。
[0044] RAS转基因可以广泛表达或者以组织特异性方式表达，即其中转基因在动物的一 个或更多个组织中表达，而不是动物的所有组织中表达。例如，转基因可以仅在翅组织、仅 在眼组织等中表达等。此外，转基因可以在动物的整个生命阶段表达，或者在一个或更多个 阶段表达，而不是在动物的整个生命阶段表达。
[0045] 需要时，可以将转基因以将其表达在空间上控制在期望的细胞类型的方式稳定整 合到动物的基因组中。特别地，可以将本发明转基因在提供于感兴趣的特定组织(例如，翅 组织）中表达的启动子的控制下稳定整合到动物的基因组中。转基因可以在提供这种需要 的空间表达模式的任何便利的启动子的控制下，其中启动子可以是动物内源性的或外源性 的。
[0046] 可以以提供通过启动子直接或间接表达激活的方式，即以提供通过启动子的基因 表达的顺式或反式激活的方式，将转基因整合到蝇基因组中。换言之，转基因的表达可以通 过启动子直接介导，或者通过一种或更多种反式激活剂介导。当转基因在启动子的直接控 制下时，即，启动子以顺式方式调控转基因的表达时，转基因在足够接近启动子的位点并且 在具有启动子的框内被稳定整合到蝇的基因组中，以使得发生通过启动子的顺式调控。
[0047] 在其中转基因的表达由内源启动子直接介导的另一个实施方案中，启动子通过一 种或更多种反式激活剂，通常一种反式激活剂（即，其表达由启动子直接控制并且以足以开 启转基因的表达的方式与转基因的区域结合的试剂)来控制转基因的表达。可以使用任何 便利的反式激活剂，其中在某些实施方案中使用GAL4反式激活因子系统。
[0048]在其中转基因蝇包含GAL4靶向表达系统的这些实施方案中，以一定方式将GAL4编 码序列整合到动物的基因组中，以使得其与提供以合适的空间和时间表达的内源启动子可 操作地连接。这样的绳的实例是从布鲁明顿果绳品系中心(Bloomington Stock Center)获 得的蝇品系MS1096(Bloomington，Indiana，库存编号8860)。]\^1096在果蝇翅中表达GAL4， 因此仅驱动果蝇翅中UAS响应性kRAS转基因的表达。转基因稳定整合到基因组的不同位置， 通常基因组的随机位置，其中转基因与上游激活序列（即，UAS序列）可操作地连接，GAL4与 该UAS序列结合并且开启转基因的表达。具有UAS: GAL4反式激活系统的转基因蝇是本领域 技术人员已知的，并且描述在Brand和Perrimon，Development (1993)118: 401-415以及 Phelps和Brand,Methods(April 1998)14:367-379中。
[0049] 本发明转基因蝇可以以使用任何便利的方案制备，所述方案以足以提供转基因的 期望表达的方式(例如，以普遍或组织特异性(例如，翅特异性)方式)提供转基因在蝇基因 组中的稳定整合。可以使用许多不同策略来获得具有必要表达模式的转基因整合。通常，产 生本发明转基因蝇的方法涉及将转基因稳定整合到蝇基因组中。稳定整合通过首先将转基 因引入到蝇的细胞(例如蝇胚胎中）来实现。转基因通常存在于合适的载体(例如质粒)上。 可以使用任何便利的方案实现转基因的引入，其中合适的方案包括：电穿孔、显微注射、囊 泡递送，例如脂质体递送媒介物等。在将转基因引入到细胞中后，转基因稳定整合到细胞基 因组中。稳定整合可以是位点特异性的或随机的，但通常是随机的。
[0050] 当整合是随机的时，可以利用转座酶来整合转基因。在此类实施方案中，将转基因 在载体中引入到细胞中，所述载体包括必需的末端31个碱基对的反向重复。当待整合转基 因的细胞不包含内源转座酶时，还向细胞引入编码转座酶载体，例如包含转座酶基因的辅 助质粒，如pTURBO(如在Steller和Pirrotta，"P Transposons Controlled by the Heat Shock Promoter，"Mol · Cell ·Biol · (1986)6:1640-1649中公开）。将转基因随机整合到目标 黑腹果蝇细胞的基因组中的方法公开在美国专利号4，670，388和6，475，798中，其公开内容 通过引用并入本文。
[0051] 在其中转基因以随机方式稳定整合到蝇基因组中的那些实施方案中，还提供了在 蝇发育期间的合适时间选择性表达转基因的方法。换言之，提供了获得转基因的靶向表达 的方法。为了获得随机整合的转基因的期望的靶向表达，可以使用转基因上游的特定启动 子的整合，作为P因子载体中的单个单位。或者，可以使用调节转基因的表达的反式激活因 子。特别感兴趣的是上文的Brand和Perr imon中描述的GAL4系统，例如，上文描述的。
[0052]在某些实施方案中，如下来产生转基因蝇：（1)产生两个不同的转基因蝇品系：（a) 第一品系，其以组织特异性方式表达GAL4,例如在翅组织中，如上文所述的；以及(b)第二品 系，其中转基因稳定整合到细胞基因组中并且与UAS结构域融合；（2)使两个品系杂交；以及 (3)筛选具有期望表型（即自发出现赘生肿瘤）的后代。上述步骤中的每一步均是本领域技 术人员熟知的。参见，例如Brand 和 Perr imon，Development (1993) 118:401-415;以及 Phelps 和Brand, Methods(April 1998) 14:367-379。还参见下文的实验部分。在另一个实施方案 中，将对于G12V基因型所描述的方法用于产生表达其他常见kRAS突变体G13D和Q61L的kRAS 突变蝇。除了包含单突变的蝇外，在一些实施方案中，使用具有多突变的蝇，例如G12V和 G13DV，G12V和Q61L，G13DV和Q61L，甚至包含全部三个突变的蝇。
[0053]上述策略用于获得包含以一定方式稳定整合到基因组的转基因的受精卵，以使得 转基因以正确的空间和时间方式表达，使卵得到表现出期望表型（例如，褶皱翅表型）的成 蝇。可使受精卵在产生瘤表型的条件下成熟。
[0054]可以通过改变使动物成熟的条件来调节动物的表型。例如，可以使用温度调节本 发明动物表型的性质。
[0055] 应用
[0056] 本发明动物可用于多种应用，包括作为鉴定用于治疗细胞增殖病症的治疗性化合 物的筛选工具(例如，作为用于人肿瘤疾病病症的动物模型）。通过使用本发明转基因动物， 例如蝇(或根据特定筛选试验由其得到的细胞），可以鉴定具有关于肿瘤疾病的活性的化合 物。如果化合物调节或影响疾病的至少一种参数或症状，例如减少异常细胞分裂或与其相 关的并发症，则化合物具有关于肿瘤疾病的活性，其中根据疾病和症状的性质，调节活性可 以是降低或增强症状的量级。因此，本发明筛选方法可用于鉴定调节肿瘤疾病进展的化合 物(例如，通过与参与肿瘤疾病进展的蛋白质或肽结合、调节、增强或抑制所述蛋白质或肽 的活性），和/或改善、减轻或甚至移除疾病的表型症状的化合物，其中这样的活性可以是或 不是关于疾病的潜在机制的活性的结果。还可能感兴趣的是筛选以确定对肿瘤病症没有作 用的药物。本发明的测定可以鉴定化合物，所述化合物最终：（1)具有关于肿瘤病症的积极 影响并因此是治疗剂，例如阻止或逆转肿瘤病症或者改善或减轻此类病症的症状的药剂； 或(2)具有关于肿瘤疾病的不利影响并因此应避免作为治疗剂。
[0057]在本发明的筛选方法中，通常向动物(例如，蝇)经口施用一定量的候选药剂。在经 口施用后，测定候选药剂对于可观察的表型(例如，褶皱翅)的影响，通常通过与对照（即，未 施用候选药剂的转基因蝇）比较。通过确定与对照蝇相比试验蝇中肿瘤病症的一种或更多 种表型特征是加重还是改善来确定候选药剂的影响，其中监测的特征包括褶皱翅等。可以 如下来向蝇经口施用候选药剂:将药剂混合到蝇的营养培养基(例如，具有额外的营养剂的 水、水溶液等）中，将培养基放置到蝇(幼虫或成蝇）的面前以使得蝇进食培养基。需要时，具 有不同药剂浓度的多个测定混合物可以平行进行，以获得对于多个候选药剂浓度的不同响 应。便利地，这些浓度中的一个作为阴性对照，即，没有化合物。在某些实施方案中，使用高 通量筛选方案，其中使用大量蝇平行测试大量候选药剂。所谓"大量"意指多个，其中多个意 指10至50个或更多，例如100个或更多，并且包括1000个或更多，其中数目可以是10,000个 或50，000个或更多，并且在一些情况下，5000个或更少。
[0058] 在某些实施方案中，感兴趣的是在高通量毒性筛选测定中使用本发明蝇，例如美 国专利号6，855，504和6，365，129中所述的，其公开内容通过引用并入本文。在此类高通量 筛选测定中，如果有话，同时测定多种不同的化合物组合物，通常10种或更多种不同的化合 物组合物的活性。通过将多种中的每一种化合物组合物与具有表型的本发明转基因动物群 接触并且确定化合组合物对动物的影响来测定其活性。这样的HTS方法可用于寻找用于治 疗细胞增殖性疾病(例如，肿瘤疾病）的药剂，仅将治疗疾病并且充分无毒以允许动物存活 的那些化合物鉴定为阳性用于进一步研究。
[0059] 本发明方法可用于筛选多种不同的潜在治疗性候选药剂。候选药剂包括多种化学 类型，但是其通常是有机分子，包括分子量为50或更多以及2,500-2000道尔顿或更少的小 有机化合物。候选药剂包含用于与蛋白质相互作用的结构(特备是氢键)所必需的官能团， 并且通常包括至少胺基、羰基、羟基或羧基，优选是所述化学官能团中的至少两种。候选药 剂通常包含被一个活更多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或多环芳香 族结构。候选药剂通常还发现于生物分子，包括但不限于:肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧 啶，其衍生物、结构类似物或组合。
[0060] 候选药剂从多种来源获得，包括合成或天然化合物文库。例如，多种方法可用于随 机和直接合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，细菌、 真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库是可用的或容易产生的。或者，天然或合成 产生的文库和化合物容易通过常规化学、物理和生物化学方法修饰，并且可用于产生组合 文库。可以对已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化 等以产生结构类似物。还可以使用方法如合理药物设计或计算机建模来产生新的潜在治疗 剂。
[0061] 筛选可以针对已知的药理学活性化合物及其化学类似物，或者具有未知特性的新 药剂，例如通过合理药物设计产生的那些。可基