一种无需解剖可判断中华鳖胚胎发育时相的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于温度决定型性别决定动物性别分化和性别调控领域，特别是涉及一种 无需解剖可判断中华鳖胚胎发育时相的方法。
【背景技术】
[0002] 中华鳖(Trionyx sinensis)隶属爬行纲(Reptilia)、龟鳖目（Testudinata)、鳖科 (Trionychidae)、鳖属(Pelodiscus)，是我国名贵的食用水产动物，其营养丰富，可以入药， 在国内外市场上十分畅销。中华鳖属于温度性别决定型动物，它的性别取决于孵化过程中 某一特定时期(温度敏感期）的孵化温度，在此期间高温孵化会产生较多雄性鳖苗，反之产 生较多雌性鳖苗。由于雄性中华鳖生长速度快于雌鳖，食用价值也高于雌鳖，因此，中华鳖 的定性育种技术备受关注。
[0003] 由于温度性别决定型动物的性别是在其胚胎发育的温度敏感期(龟多数在15~17 期）内由温度决定的，因此，其胚胎发育时相的准确划分(特别是14时相以后)对于其性别调 控非常重要。胚胎发育时相的划分方法通常是通过定期解剖在解剖镜下观察来确定的。
[0004] 国际上普遍米用Yntema([l]Yntema C.A series of stages in the embryonic development of Chelydra serpentine[J].Journal of Morphology,1968,125:219-251) 的分期标准进行龟胚胎发育时相的划分，关于中华鳖胚胎发育时相的划分国内外至今没有 一个系统报道。
[0005] 国内外关于中华鳖已有一些报道，主要涉及提高中华鳖产卵量及长卵质量的养殖 方法（中国专利CN 103918605)、纯种繁育方法（中国专利CN 103843722A)和性别控制方法 (中国专利CN 102988986A、CN 102487883A、CN 102934623A)。目前未见到通过外观判断龟 鳖胚胎发育时相的文献报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种无需解剖可判断中华鳖胚胎发育时相的方法。
[0007] 本发明包括以下步骤：
[0008] 1)在中华鳖孵化季节，采集中华鳖受精卵进行裸孵；
[0009 ] 2)在整个裸孵过程中观察受精斑的变化情况，通过光照观察血丝的变化情况并拍 照记录。孵化第一周时相变化很快且胚胎太小无法对其肉眼观察进行准确判断，因而，孵化 第一周并未进行胚胎解剖观察，从孵化第8天开始每天取4~6枚受精卵观察外观随后解剖， 在立体显微镜下观察胚胎发育情况，进行文字描述并拍照记录，参考Yntema [1]描述的龟胚 胎发育时相的划分标准对中华鳖的胚胎发育时相进行划分。
[0010]在步骤1)中，所述裸孵可采用孵化装置进行裸孵，所述孵化装置设有离心管和解 剖盘，受精卵的动物极向上平放在离心管架上，受精卵间距保持在1~1.5cm，离心管架置于 解剖盘上，解剖盘中盛水，水深2~3cm，将孵化装置置于可控温、控湿的孵化室内，孵化室的 相对湿度为65 %~88 %，孵化温度为26~33 °C。
[0011] 在步骤2)中，所述整个裸孵过程涵盖中华鳖胚胎发育敏感期开始前直到胚胎发育 结束的整个过程。
[0012] 中华鳖胚胎发育时相判断可参考Yntema[1]的划分方法并对中华鳖的时相发育做 了重新定义。根据受精卵外观、胚胎日龄及胚胎形态特征变化将整个胚胎发育过程分为26 期，主要以头部、四肢、背甲及腹甲的变化作为分期依据。
[0013] 本发明首次与国际通用的龟胚胎发育时相标准进行比对，确定了中华鳖胚胎发育 时相，使得从事中华鳖性别分化与调控研究的学者得到的结果具有可比性，为龟鳖性别分 化比较研究奠定基础。本发明解决中华鳖胚胎发育时相的准确判断问题，特别是无需解剖 受精卵，仅通过外观观察确定其胚胎发育时相，为提高中华鳖性别调控技术奠定了基础;对 于生产企业而言，本发明为普通生产者成功进行中华鳖单性育种奠定了坚实的基础。
[0014] 本发明首次按照国际通用的Yntema[1]标准对中华鳖温度敏感期开始以前至胚胎 发育结束期间胚胎发育时相进行了系统描述。
[0015] 本发明在于无需解剖受精卵，通过受精卵外观观察可以得到中华鳖温度敏感期开 始前到胚胎发育结束整个过程的准确的发育时相。
[0016] 本发明首次提出通过外观观察确定中华鳖胚胎发育时相划分的方法，特别是首次 参考国际通用的龟胚胎发育时相划分标准对中华鳖的胚胎发育进行划分，特别是给出了中 华鳖温度敏感期开始前直到胚胎发育结束整个过程中华鳖受精卵外观形态特征。本发明可 以准确定位中华鳖胚胎发育时相，为后期进行中华鳖性别调控研究和操作提供了有力支 撑。
[0017] 运用本发明进行中华鳖胚胎发育时相判断的主要优点在于：
[0018] 参照国际通用的龟胚胎发育时相划分标准(共计26期)对中华鳖的时相进行划分， 使得中华鳖性别分化及性别调控研究学者的研究工作具有可比性。
[0019] 由于可以通过外观形态对中华鳖的发育时相进行判断，减少了研究过程中解剖动 物进行判断的工作量，多大提高工作效率。而对于养殖企业而言，技术人员无需通过解剖、 解剖镜下观察，无需高端仪器设备，仅仅通过手电筒就可以准确进行发育时相的判断，大大 提高了中华鳖性别调控的可操作性和操作的成功率。
【附图说明】
[0020] 图1为受精卵表面观和胚胎侧面观图版。在图1中，（1)为受精卵表面观，（2)为胚胎 左侧面观，（3)为胚胎右侧面观；11-1~11-3表示孵化8天；12-1~12-3表示孵化9天；13-1~ 13-3表不解化10天；14-1~14-3表不解化12天；15-1~15-3表不解化14天；16-1~16-3表不 孵化16天。
[0021] 图2为受精卵表面观、胚胎背面观和胚胎腹面观图版。在图2中，（1)为受精卵表面 观，（2)胚胎背面观，（3)胚胎腹面观；17-1~17-3表示孵化18天；18-1~18-3表示孵化20天； 19-1~19-3表示孵化23天；20-1~20-3表示孵化26天；21-1~21-3表示孵化29天；22-1~ 22-3表示孵化32天。
[0022]图3为受精卵表面观、胚胎背面观和胚胎腹面观图版。在图3中，（1)为受精卵表面 观，（2)胚胎背面观，（3)胚胎腹面观;23-1~23-3表示孵化36天;24-1~24-3表示孵化40天； 25-1~25-3表示孵化44天；26-2~26-3表示孵化48天。
【具体实施方式】
[0023]中华鳖胚胎发育时相具体划分方法如下：
[0024]中华鳖胚胎发育时相判断主要参考Yntema[1]的划分方法并对中华鳖的时相发育 做了重新定义。根据受精卵外观、胚胎日龄及胚胎形态特征变化将整个胚胎发育过程分为 26期，主要以头部、四肢、背甲及腹甲的变化作为分期依据。
[0025]以下结果是受精卵在29°C孵化温度下的发育过程。
[0026] 第^^一期(2%~，第 8 天，图 1，11_1 ~11-3)
[0027] 受精卵外观:受精斑发育至受精卵表面积的1/2,血丝环完整，细长胚体隐约可见。 [0028]胚体外观:胚体细长稍弯曲，肢芽已出现，眼睛黑色素覆盖不完全。
[0029]第十二期（29 °C，第9天，图 1，12-1 ~12-3)
[0030] 受精卵外观:血丝环完整且明显，胚体弯曲隐约可见，眼睛隐约可见。
[0031]胚体外观:胚体加粗，弯曲幅度加大，肢芽更明显，眼睛仍未完全黑亮。
[0032] 第十三期（2%~，第 10 天，图 1，13_1 ~13-3)
[0033] 受精卵外观:胚体上方有两簇较细的血丝，胚体可见。
[0034]胚体外观:胚体呈最大幅度弯曲，肢芽明显可见；头部较大，头突明显，眼睛黑亮； 尾部完全向腹侧弯曲蜷缩;胚体内血管较丰富，心跳活跃。
[0035]第十四期（2%~，第 12 天，图 1，14_1 ~14-3)
[0036]受精卵外观：受精斑超过受精卵表面积的1/2，胚体上方两簇血丝明显，胚体有些 明显可见，有些隐在血丝下面。
[0037] 胚体外观:胚体开始拉伸变粗，肢芽明显可见，指板开始形成；背甲雏形开始出现； 尾部向腹侧蜷缩一直持续到18期。
[0038] 第十五期（2%~，第 14 天，图 1，15_1 ~15-3)
[0039] 受精卵外观:胚体上方两簇血丝开始沿两头延长变粗。
[0040] 胚体外观:背甲出现，其长度约占胚体线轴的1/3;指板发育良好，外周平滑不存在 指间凹槽;吻突出现;部分肠道穿过体壁突出体外。
[0041] 第十六期（29°C，第 16天，图1，16-1 ~16-3)
[0042]受精卵外观:胚体上方两簇血丝明显延长加粗成血管，两侧并延伸出数条较细血 丝。
[0043] 胚体外观:背甲变大，隐约可见背甲肋纹，腹甲雏形开始出现;指板较大，外周平滑 出现轻微的指间凹槽;上颚突出较明显，下颚末端到达晶状体水平;肠道突出体外一直持续 到22期。
[0044] 第十七期(29°C，第 18 天，图 2，17-1 ~17-3)
[0045] 受精卵外观:受精斑发育至受精卵的表面积2/3,胚体上方血丝簇延伸加粗并包围 整个胚体。
[0046]胚体外观:背甲长度约占胚体线轴的1/2,背甲肋纹明显，约8对，脊柱明显并有轻 微色素沉积，裙边开始出现;腹甲形成更明显；指板四周出现轻微锯齿状突起，头部小于身 体部分，眼睛大而突出，下颚末端到达眼睛前端水平，鼻突出现。
[0047]第十八期（29°C，第 20 天，图 2，18_1 ~18-3)
[0048]受精卵外观:胚体变大而不再透明。
[0049]胚体外观:背甲变宽大，其长度超过胚体线轴的1/2,背甲肋纹明显8对，脊柱明显 且色素沉积更多，裙边明显，将尾部全部盖住;腹甲形成更明显；四肢可自由摆动并伴有轻 微色素沉积，足趾突出使得指板四周锯齿状突起更深;头部小于身体部分，眼睛大而突出， 下眼睑出现，下颚末端延伸远远超出眼睛前端水平，鼻突明显；由于腹甲的良好的形成逐渐 遮挡了心脏的跳跃情况。
[0050]第十九期(29°C，第 23 天，图 2，19-1 ~19-3)
[0051 ] 受精卵外观:血管明显且包围整个胚体，胚体明显变大。
[0052]胚体外观:背甲约占胚体线轴2/3,脊柱色素沉积更明显，裙边明显，尾部不再向腹 侧蜷缩;腹甲形成良好；四肢色素沉积