一种g6pd118-144位点缺陷的转基因斑马鱼模型的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种G6PD118?144位点缺陷的转基因斑马鱼模型，该模型是由红系细胞特异性启动子gata1驱动118?144位点缺失的突变g6pd基因，同时也是表达EGFP的可示踪的转基因斑马鱼模型。其优点在于：gata?1是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑马鱼的血液循环开始建立，利用gata?1 作为驱动突变的g6pd 基因的启动子可以使突变型g6pd 基因在红细胞中特异性表达。gata1同时驱动g6pd与egfp基因，可实现突变型g6pd基因在红细胞中表达的“可示踪”观察。斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可以在显微镜下示踪胚胎和鱼体内荧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的动物模型。
【专利说明】
-种G6PD118-144位点缺陷的转基因斑马鱼模型
技术领域
[0001] 本发明设及一种G6PD118-144位点缺陷的转基因斑马鱼模型，属于基因工程技术 领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖-6-憐酸脱氨酶缺乏症（gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，简称G6PD缺乏症)俗称蚕豆病，是世界上最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺 陷病。红细胞在成熟的过程中丧失了细胞核和核糖体，因而不能合成蛋白质，无法进行Ξ簇 酸循环。因此成熟的红细胞主要靠憐酸戊糖途径来提供能量。G6H)是憐酸戊糖代谢途径的 限速酶。6-憐酸葡萄糖在G6PD的催化下产生烟酷胺腺嚷岭二核巧酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ,NADPH)和5-憐酸核糖（ribose-5-phosphate，R5P)。 NADPH对维持谷脫甘肤(glutathione，G細)的还原状态从而保护红细胞免受氧化剂的损害 极为重要。併机/基因突变导致G6PD酶活性降低，会影响NADPH的产生。NADPH是机体多种物 质合成代谢的供氨体，同时维持还原型谷脫甘肤(G細的还原状态）的生成量。NADPH缺乏 会减弱机体抗氧化剂(还原型谷脫甘肤GSH、过氧化氨也化）的抗氧化效果，使红细胞中的血 红蛋白及红细胞膜在接触氧化性损伤时受到损害及发生溶血。目前全世界就G6PD缺乏症 发病的详细机制尚不清楚，有待进一步的研究探讨。常见临床表现包括新生儿黄痘、药物或 感染造成的急性溶血、蚕豆病和先天性非球形细胞溶血性贫血(CNSHA)等。现今，对G6PD缺 乏症的治疗措施主要为早期筛查，避免诱发因素等预防治疗措施。一旦经确诊后的病例给 予服禁用药物，避免诱发因素。高胆红素血症予W蓝光照射、碱化血液、输白蛋白、输血等对 症治疗，W及相关辅助治疗。国内外仍未有特异性治疗G6PD缺乏症的治疗措施。
[0003] 是原始红系发育中的特异性的启动子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑马 鱼的血液循环开始建立时可检测到gata-J-雌卸标记的红细胞随循环流动。48h之后 gaia-J表达逐渐减少。所W利用gaia-J作为驱动突变的g卸基因的启动子可W使突变 型g如基因在红细胞中特异性表达。从而实现突变型g如墟因在红细胞中表达的"可示 踩'观察。
[0004] 目前并没有一种十分理想的动物实验模型可W很好的实现如机/基因的结构变化 与功能之间关系的研究。
[0005] 目前，世界已报道400多种G6PD缺乏生化型和160多种G6PD基因突变类型。G6PD基 因突变具有W下特点：多为单个碱基置换的错义突变，尚未发现整个基因或大片段基因的 缺失，也未见无义突变及移码突变。中国人群中至少鉴定出31种点突变。1388G-A、1376G-T、 1024C-T、1004C-T、871G-A和95A-T为中国人最常见的如机/基因突变类型，其累计基因频率 超过了 86%。通过蛋白质比较，本课题组发现，人和斑马鱼的蛋白具有很高的相似性(相似度 88%)dA95T是中国一个比较常见的突变位点，通过对蛋白质Ξ维结构(PDB ID: 2B化）的学 习，发现在第32号氨基酸附近存在着W下二级结构：32-37号氨基酸是β折叠的区域，38-40 号氨基酸是β转角的区域，40号氨基酸是NADP+的结合位点，42-46号氨基酸是α螺旋的区 域[19]。通过和人的G6PD蛋白序列的比对，拟敲除斑马鱼G6PD的第40-48位氨基酸，即对斑马 鱼G6PD基因序列118-144位置制造突变，通过分子生物学技术将突变型如机/基因装入特定 载体中，利用显微注射技术将目的质粒导入斑马鱼体内，实现显性负性效应，进而建立G6PD 缺乏症的斑马鱼模型，从而进一步研究斑马鱼中如机/的突变对其G6PD酶活性的影响，G6PD 的结构及功能的变化导致红细胞受损的详细机制。为人类G6PD缺乏症的详细机制及大规模 高通量药物筛选提供基础。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的主要技术问题是开发出由gaia-j启动子驱动的118-144位点突 变g卸基因与eg卸基因的转基因斑马鱼模型，并提供该转基因斑马鱼模型的建立方法及该 转基因斑马鱼模型在筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中的应用。
[0007] 本发明首先提出了一种转基因斑马鱼模型，该模型是由红系细胞特异性启动子 ga ia巧区动118-144位点缺失的突变《卸江基因，同时也是表达EGFP的可示踪的转基因斑马鱼 模型。
[0008]运种由ga iaJ启动子驱动《卸狭变基因与e紅盛因表达的转基因斑马鱼模型的建 立方法，包括W下步骤： 1)将g如c/ww-w-雌卸-PC似+，阱ia-J-P公細-/see /质粒酶切连接构建了阱姑7- g6pcfu8-W-egfp-PBSK-Isce I质'粒。
[0009] 2)将gaiaj-始护严却-视細-/洗6 /质粒通过显微注射的方式注入1细胞期 斑马鱼胚胎动物极胚盘内。
[0010] 3)通过观察24hpf期胚胎是否表达绿色巧光筛选出转基因的胚胎并解化养至成鱼 作为F0代转基因斑马鱼。
[0011] 4) WF0代转基因斑马鱼与野生型交配后产生的表达绿色巧光的胚胎解化并养至 成鱼作为F1代转基因斑马鱼。
[0012] 5)通过观察胚胎EGFP巧光情况和基因组PCR法鉴定转入的如机严峨曲基因 的表达和插入情况。
[001引其中，步骤1)中的她7湛因的突变位点是118-144位点，该位点是模拟人类G6TO缺 乏症中95A-T突变所产生的效应。
[0014]进一步的，运种由gaia-1启动子驱动始护突变基因和娜巧灌因的转基因斑 马鱼模式的应用主要是：该模型是通过显性负效应建立的葡萄糖-6-憐酸脱氨酶缺乏症 (G6P孤）的斑马鱼模型用于筛选治疗G6PD缺乏症药物的过程中能可示踪的观察到药物处理 过程中红细胞的变化。
[001引相比于传统的G6PD缺乏症动物模型，本发明具有如下优点： l.gata-J是原始红系发育中的特异性的转录因子，标记早期红系细胞。在24hpf，斑马 鱼的血液循环开始建立，利用gaia-J作为驱动突变的g如基因的启动子可W使突变型 如机/基因在红细胞中特异性表达。
[001 W 2. gaia洞时驱动她7妈e紅/遥因，可实现突变型她7湛因在红细胞中表达的"可 不踪"观察。
[0017] 3.斑马鱼胚胎与成鱼通体透明，构建的该动物模型可W在显微镜下示踪胚胎和鱼 体内巧光标记红细胞在药物诱导下的变化规律，为筛选治疗G6PD缺乏症的药物提供可视的 动物模型。
【附图说明】 [001 引 图1是gataj-g牺/w-w-e如聪基因斑马鱼胚胎F1代幼鱼巧光表达鉴定情况。
[0019] 图1中：A-E分别是Z卿加..g曲/i"-i44-e紅/泼育至11.24.36.48.72小时的巧光图； F-J野生型斑马鱼对照； 图2是基因组PCR鉴定结果。
[0020]图 2中：M:DNA mark 1.邸 aiai.'g 如/118-144-邸卸转基因系斑马鱼；2.WT; 3. zga iaJ-e 的古；4.空白； 图3是全胚胎原位杂交检测egfp鉴定转基因模型构建情况。
[0021]图帥：A.zgaiaJ.'g卸(/iis-i44-端却转基因系斑马鱼;B.zgaiaJ-e^却转基因系斑 马鱼;C. WT斑马鱼。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0023] 实施例1: 本发明提供通过胚胎显微注射质粒得到转基因斑马鱼的方法，构建了 gaiaJ- g曲的古-/?况T-/sce /质粒，将新构建的质粒与Isce I酶通过显微注射的方法一起 注入斑马鱼1细胞期胚胎，达到ga iaJ启动子驱动突变的《卸江基因与端力7基因特异性在红系 细胞表达的效果。
[0024] 其中，制备G6PD转基因斑马鱼模型的方法，包括如下步骤： (1)运用重叠延伸定点诱变的方法制备突变型zg卸/11^44基因： A.通过和人的G6PD蛋白序列的比对，确定致变斑马鱼G6PD的第40-48位氨基酸。根据 NCBI所提供的斑马鱼cDNA(NCBI Reference Sequence: XM_694076.5)序列，分别设计了两 对引物，第一对引物的上游加入BamHI酶切位点和保护碱基，第二对引物的下游加入EcoRI 酶切位点和保护碱基，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成： 第一对正向引物反向引物：
B.制备斑马鱼cDNA: 分别收集野生型斑马鱼24、36、48、72、96119巧巧个时相的胚胎各10枚，将裂解液吸入 1.5ml的化P管中，室溫5分钟，加入20化1氯仿，剧烈振荡15s，室溫放置2-3min; 12000g离屯、12min(4°C)，将上清移入RNase Free的EPP管中，加入50化1异丙醇，充分混 匀后，-20°C放置化； 将EPP管取出，12000g离屯、10min(4°C)，弃上清，向试管中加入1ml预冷的75%乙醇，充分 混匀后，7500g离屯、5分钟(4°C)，弃上清； 重复上一步； 室溫惊干lOmin. 加入预热的1化1 DEPC-出0溶解RNA，55 °C放置1 Omin，使其完全溶解； 取山1的总RNA样品，用2%凝胶电泳检测其完整性，电压5V/cm，时间15min，并用紫外分 光光度计检测其纯度及浓度。
[0025] 利用随机引物法将上述步骤制备所得的总RNA进行反转录，从而得到斑马鱼cDNA。
[0026] C.采用第一对引物对和第二对引物分别WcDNA为模板进行PCR反应。分别将PCR 产物跑凝胶电泳后割胶回收引物一和引物二的扩增片段。W回收的目的片段为模板，引物 一的上游片段与引物二的下游片段为配对引物进行第Ξ次PCR反应。切胶回收该次PCR产物 即为^如机/11^44基因片段。
[0027] (2)zg6机/"W-W-/7C5A重组质粒的建立： 将^44基因及P 载体分别用化和进行双酶切，双酶切后跑凝胶电 泳回收开链酶切产物，采用如下体系对酶切产物进行连接，获得zg?卸户+重组质 粒： 组分 体积山1) /7(5·"+割胶回收产物（lOOng/yl) 3 zg卸/11W44割胶回收产物(200ng/y 1) 5 10X T4 DNA Ligase Buffer 1 Τ4 DNA Ligase 1 总体积 10 (3 ) z ga ia 7-游細重组质粒的构建： 将zga虹7-游細及游細/5邸进行双酶切，将zga虹7启动子连接到游卻β·彷/。
[002引组分 体积(yl) /7公細淵(lOOng/yl) 3 zgaiaJ(200ng/yl) 5 10X Τ4 DNA Ligase Buffer 1 T4 DNA Ligase 1 总体积 10 (4 ) zga ia J .·《卸(/iis-i44- e紅片可公細/淵重组质粒的构建： 将zg曲/iis-w-峨曲-成沪和Z卿虹游細/5·沈巧feffl化和Afe?德切，分别跑凝胶电泳 切胶回收开链片段，将两种开链片段用W下体系连接，获得部如/11S-144-邸·卸- jOWJkcs重组质粒： 组分 体积山1) zgatal-pBSKiscE I 3 g 卸(/。8-144_峨卸 5 10X T4 DNA Ligase Buffer 1 Τ4 DNA Ligase 1 总体积 10 (5) 显微注射 取斑马鱼1细胞胚胎，采用如下体系用将zga ia J .?始p/i 18^44- eg?曲產组质粒 注入斑马鱼1细胞胚胎内。
[0029] 组分 体积(yl) 质粒(终浓度50ngAU) 1μ1 I-Scel 酶 0.5μ1 I-Scelbuffer 0.3μ1 水 3.化1 总体积 扣1 (6) 转基因系斑马鱼的筛选： A.将显微注射后的胚胎置于egg water中培养至24小时后，在巧光显微镜下挑出绿色 胚胎进行培养。
[0030] B.转基因系斑马鱼的筛选 将培养至性成熟的斑马鱼作为F0代，与野生型的斑马鱼进行交配;将收获的胚胎置于 egg water中培养至24小时，挑选出可W表达绿色巧光的胚胎作为F1代。同时将F0代斑马鱼 进行编号；将F1代鱼培养至性成熟W后，进行自交。挑选出纯合子作为F2代;将F2代鱼培养 至性成熟W后，进行自交。挑选出纯合子作为F3代。
[0031] (7)转基因系斑马鱼的鉴定 A. EGFP绿色巧光蛋白观察鉴定： 按照常规方法将转入质粒的胚胎解化出幼鱼并饲养至性成熟，然后将其和野生型斑马 鱼交配，在巧光显微镜下挑选出可W表达绿色巧光蛋白的斑马鱼作为F1代。
[0032] B. PCR法鉴定： 收集出生后5天的阳性胚胎，同时W野生型和zgaiaJ:egfp的斑马鱼做对照，提取基因 组DNA，W如下体系进行PCR反应： 组份 体积山1) 10X Buffer K孤-Plus- 5 2mM dNTPs? 5 25mM MgS〇4 4 lOymol/μΙ Primer g6pd上游 1 lOymol/μΙ Primer g6pd下游 1 基因组DNA 2 PCR grade water 31 KOD-Plus- (l.OU/yl) 1 总体积 50 C.原位杂交鉴定： 采用egfp探针对受精后25h转基因斑马鱼胚胎进行原位杂交，杂交过程如下： 甲醒梯度脱水： 加入1ml 25%甲醒/PBST，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 50%甲醒/PBST，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 75%甲醒/PBST，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 100%甲醒，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 100%甲醒，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 100%甲醒-20°C保存。
[0033] 原位杂交第一天再水化胚胎： 加入1ml 75%甲醒/PBST，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 50%甲醒/PBST，室溫轻摇lOmin，弃废液； 加入1ml 25%甲醒/PBST，室溫轻摇lOmin，弃废液； 清洗胚胎:用1 X PBST清洗Ξ遍，1 X quick，1 X 5min，1 X quick，室溫下轻摇； 胚胎再固定:加入1ml 4%多聚甲醒/PBST，4°C轻摇比后，于室溫下轻摇20min; 清洗胚胎：用1 XPBST清洗Ξ遍，1 Xquick，1 X5min，1 Xquick，室溫轻摇，将胚胎移入 RNase化ee的EPP管中； 预杂交：向RNase化ee的EPP管中加入1ml 68°C预热的HYB(-)液体，置于杂交炉中68°C 轻摇15min; 杂交:用RNase化ee枪头将HYB(-)液体弃掉，加入预热的HYB( + )溶液40化1/管，68°C杂 交炉中轻摇比，再加入带有Dig标记的峨曲探针(使其终浓度为Ing/y 1)，68 °C杂交炉轻摇过 夜。
[0034] 原位杂交第二天 洗涂胚胎： 2 X 30min，2 X SSCT/50%甲酯胺2ml，68 °C杂交炉中轻摇； IX 15min，2XSSCT 2ml，68°C杂交炉中轻摇； 2X 30min，0.2XSSCT 2ml，68°C杂交炉中轻摇， 将胚胎移至12孔板； MABT洗涂3 X 5min，室溫轻摇； 每孔加入2.5ml阻滞液，室溫轻摇比； 加入抗地高辛抗体(anti-Dig FAB antibody)，抗体终浓度为1:5000。将12孔板移入4 °C，摇床上轻摇过夜。
[0035] 原位杂交第Ξ天 洗涂胚胎： lX30min，阻滞液2.5ml，室溫轻摇； IX lh，MABT2ml，室溫轻摇； 3X 5min，staining buffe;r(PH=9.5)2ml,摇床上室溫避光轻摇；IX 5min，0.1M Tris(PH=9.5)2ml,室溫避光轻摇； 染色:在ο. IM Tris(PH=9.5)中，每2.5ml 内加入Vector BCIP/NBT试剂盒中的solution 1 一滴，混匀，加入solution 2 -滴，混匀，加入solution 3-滴，充分混匀即成。将染液加 入12孔板后，用侣锥包裹12孔板避光，室溫下轻摇，每隔20min观察一次，直至染色成功； 终止染色:染色成功后，加入1 X PBST 1ml洗涂，2 X 5min，室溫轻摇； 固定:加入4%多聚甲醒/PBST固定液，4 °C轻摇过夜； 保存:加入1ml 4%多聚甲醒/PBST固定液，4 °C保存； 当然，W上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换 或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【主权项】
1.一种G6roil8-144位点缺陷的转基因斑马鱼模型，其特征在于:该模型是由红系细胞 特异性启动子ga ia2驱动118_ 144位点缺失的突变g你 c/基因，同时也是表达EGFP的可示踪的 转基因斑马鱼模型。
【文档编号】A01K67/027GK105918255SQ201610385062
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】舒莉萍, 何志旭, 周艳华, 庹媛媛, 尚鲁俊, 吴西军, 崔冬冰
【申请人】贵州医科大学