专利名称：鉴别冬虫夏草的基因序列及方法
技术领域：
本发明涉及鉴别冬虫夏草的基因序列及方法，是利用冬虫夏草在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列的独特性，做为鉴别冬虫夏草和其他虫草的异同指标。
在冬虫夏草的既有研究文献中只见于标本的采集、描述和鉴定，而对于一些具药用价值的冬虫夏草也只停留在代谢产物所具有何种防治效用的活性成份介绍；由于冬虫夏草的有性世代对应多种无性世代，且目前的生活史仍不清楚，加上其菌种不易采集、保存困难，至今尚无法以人工形成子座，因此无论生活史中的有性世代对应无性世代的关系及分类鉴定都呈现混乱无一定标准可参照的现象；这种现象相对于近年来华人地区将冬虫夏草列为健康食品而大量食用的情形，实令人担忧，因为厂商可能用了未经证实的非纯正的冬虫夏草去生产这类食品，而消费者则因此食用了不具有冬虫夏草某些活性成份的无效产品，这样的恶性循环将违背了冬虫夏草原本对人类健康的贡献良意。
有鉴于目前冬虫夏草的分类鉴定仍无一套标准可循的缺陷，本发明的主要目的是提供一种鉴别冬虫夏草的基因序列以及应用该基因序列作为鉴别冬虫夏草真伪的方法，填补这方面的空白，该方法可作为鉴别纯正冬虫夏草的重要手段。
为此本发明人试著利用物种分类鉴定上最常用的核糖体RNA基因，希望透过对核糖体RNA基因的分析能找到鉴别冬虫夏草的参考依据；而在既有的技术中18S核糖体RNA基因曾被做为真菌的属与属之间的分类依据，因此本发明更将核糖体RNA基因的利用限定在18S核糖体RNA基因。另外供做本发明操作找寻鉴定依据的冬虫夏草标本是在不同时间、地点所分别取得的，此举是为达到其客观性，并且可观察这些来源不同的冬虫夏草的物性；另外本发明的其他供试标本也包括其他的虫草及寄存于菌种中心的似冬虫夏草和已存于基因资料库(Gen Bank)与冬虫夏草亲缘关系相近的其他虫草，借着这些供试标本所施做后的资料数据与冬虫夏草做比对，以确定所获得的依据能客观地鉴别出冬虫夏草的专一特性。
本发明是将所有供试样本的DNA萃取物经既知的引子组NS1/NS2、NS3/NS4、NS5/NS6及NS7/NS8去进行其18S核糖体RNA基因的PCR扩增，再将PCR扩增产物以自动定序仪进行基因序列的排序，接著利用基因序列进行冬虫夏草标本与各供试标本的异同比较。由基因序列的对比发现，冬虫夏草在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列具有和其他虫草甚至亲缘关系最接近的其他虫草属都不同的独特排列，借着这段基因序列和其他物种的同一段基因序列的比较，可以马上确立其冬虫夏草的真实性，因此该段基因序列足可称做鉴别冬虫夏草的参照性指标；另外，在确立冬虫夏草于引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列为鉴别冬虫夏草的参照性依据后，通过将任一物种的DNA萃取物分别进行以引子组NS3/NS4、NS5/NS6去扩增其18S核糖体RNA基因的PCR反应，并将PCR产物定序排列而获得该段基因序列的排列结果，再将该结果与既知的冬虫夏草同段基因序列做比较以确认该物种是否符合冬虫夏草的特有象征的整个作业程序，也成为鉴别冬虫夏草的方法。以下是本发明进行上述标本操作的实施例，因最终结果是存在于引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列的变化，故本发明未列出存在于引子组NS1/NS2及NS7/NS8间的18S核糖体RNA基因序列的排列结果。
下面结合较佳实施例对本发明作进一步详细说明如下。
图1是各引子在18S核糖体RNA基因的位置示意图；图2是表5在引子组NS3/NS4间18S核糖体RNA基因序列的部份排列情形；图3是表5在引子组NS5/NS6间18S核糖体RNA基因序列的部份排列情形；图4是虫草属菌株在引子组NS3/NS4间18S核糖体RNA基因序列的部份排列情形；图5是虫草属菌株在引子组NS5/NS6间18S核糖体RNA基因序列的部份排列情形；
图6是表8的演化树图；图7是表9的演化树图；图8是表10的演化树图；图9是冬虫夏草在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列排列图。
本发明所利用的冬虫夏草标本、虫草属标本及虫草属菌株分别如表1～表3所示，其中表1的冬虫夏草标本在同一标本中又分以菌核和子座两部份，藉以比对在同一标本中菌核和子座的差异，这些待试的样品经培养及DNA萃取后开始进行其18S核糖体RNA基因(18SrRNA gene)于不同引子组的PCR扩增，其利用的引子的来源及序列如表4所示，而该引子在18S核糖体RNA基因的作用位置如
图1所示；本发明进行PCR扩增时，其PCR的反应条件为起始变性温度98℃、2分钟；变性温度(denature)95℃；炼合温度(annealing)52℃、45秒；延展温度(extension)72℃、2分钟，循环35周期；最后延展温度72℃、10分钟。经PCR扩增后的产物直接以纯化试剂(High Pure PCR Product Purification Kit)进行纯化并利用自动定序仪(Applied Biosystems 373 DNA Sequencer)进行DNA的定序，再以萤光试剂(Tag Dye Deoxy Terminor Cycle Sequencing Kit)进行标定分析；上述经定序后的基因序列分别向欧洲分子生物实验室EMBL(EuropeanMolecular Biology Laboratory)登录并取得登录号码，其中表1的登录号码条列于表5，表2的登录号码条列于表6，表3的登录号码条列于表7，在表5～表7中分别就NS3、4及NS5，6引子组分别登录，其中表2中的酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)由于为既知的菌种，故不重复登录而未列于表6中。
将冬虫夏草标本的18S核糖体RNA基因序列全部列出其资料是庞大的且对于确定冬虫夏草所具有的特殊序列模式也未有明显的帮助，故本发明人在分析比较整段18S核糖体RNA基因序列后，只归纳出引子组NS3/NS4及引子组NS5/NS6间的部份18S核糖体RNA基因序列的排列情况并做部份列出，做为冬虫夏草物性的判断，其中图2是表5在引子组NS3/NS4间18S核糖体RNA基因序列的部份排列结果，其第1～16栏分别为标本代号Cs824af、Cs824b、W1023f、Cs7528A1、Cs7528A2、Cs7528Jf、Cs7528Jh、Cs7528Hf、Cs7528Hh、T1023f、S1023f、H102-3f、K1023f、Cs1014df、Cs824ab、Cs824ab。图3则是表5在引子组NS5/NS6间18S核糖体RNA基因序列的部份排列结果，其第1～15栏分别为标本代号Cs824af、Cs824ab、W1023f、Cs7528A1、Cs7528A2、Cs7528Jf、Cs7528Jh、Cs7528Hf、Cs7528Hh、T1023f、S1023f、H1023f、K1023f、Cs1014df、Cs1014db。由图2、图3可知，所有冬虫夏草标本在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列均相同，以此可证明表1中由各个不同来源、时间所搜集到的野生冬早夏草标本为相同的真菌物种，及同一个冬虫夏草标本的子座及菌核具有完全相同的18S核糖体RNA基因序列，为同一真菌物种所组成。
图2、图3的18S核糖体RNA基因序列的排列结果让我们了解了冬虫夏草的物性以及其在引子组NS3/NS6间18S核糖体RNA基因序列的排列情况，惟该区域的序列是否足以成为冬虫夏草与其他虫草的分辨关键，仍需针对冬虫夏草标本以及其他虫草属类缘近属样品在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列的排列进行比较才能有定论，而这些基因序列的排列情形分别如图4、图5所示，其中图4是冬虫夏草标本和其他虫草属类缘近属样品在引子组NS3/NS4间的18S核糖体RNA基因序列的部份排列情形；图5是冬虫夏草标本和其他虫草属类缘近属样品在引子组NS5/NS6间的18S核糖体RNA基因序列的部份排列情形。在图4所显示的菌株由第1～18栏分别为冬虫夏草C.Sinensis Cs824af、Cs7528A1、Cs7528Jf、Cs7528Hh、T1023f、H1023f；其他虫草标本C.liangshanensis CC1014af；C.militaris Cm824a、LM1207f；P.ninchukispora CCRC 31900；C.memorabilisATCC 36743；C.militaris ATCC 26848；C.ophioglossoides ATCC 36865；Cordyceps sp.ATCC 36337；C.sinensis CCRC 36421；C.capitata(取自基因资料库from Gen Bank)；C.ophioglossoides(取自基因资料库)。由图4的基因序列排列情况可区别出冬虫夏草和其他虫草的不同，由于图4只是就该引子组的18S核糖体RNA基因序列的一部份呈现，所以在第15栏的ATCC 36337和第16栏的CCRC 36421的基因序列与冬虫夏草的基因序列感觉非常近似，甚至第8栏的CC1014af则完全一致，如此是否将难以借此印证冬早夏草的基因序列在此段引子组间的特殊排列性？惟在发明人实际就整段基因序列的观察上，在此段基因序列570个盐基(base pair)中，ATCC36337有16个盐基而CC1014af也有4个盐基和冬虫夏草标本不同，故其近似度虽高，但在引子组NS3/NS4间的冬虫夏草的18S核糖体RNA基因序列的排列情形仍与其他虫草不同，故可藉此区别出真正的冬虫夏草。
图5各个虫草属菌株在引子组NS5/NS6间部份18S核糖体RNA基因序列的排列情形，其中第1-15栏的菌株分别为冬虫夏草C.sinensisCs7528A1、Cs7528Jf、Cs7528Hh、S1023f、H1023f；C.liangshanensisCC1014af、CC1014ab；C.militaris Cm824a、LM1207f；P.ninchukispora CCRC31900；C.memorabilis ATCC 36743；C.militaris ATCC 26848；C.ophioglossoides ATCC 36865；Cordyceps sp.ATCC 36337；C.sinensis CCTC36421。在图5中与冬虫夏草基因序列最相近的是CC1014af及CC1014ab，但在引子组NS5/NS6这段基因序列290个盐基中仍有14个盐基是不同；因此由此段基因序列的排列情形仍可将冬虫夏草和其他虫草做明确的区别。由图4及图5的基因序列排列结果可得到一个结论，那就是冬虫夏草的18S核糖体RNA基因序列在引子组NS3/NS6间具有其序列的独特性，并藉此成为鉴别冬早夏草和其他虫草异同的重要指标。上述的过程证明了本发明所提供的野生冬虫夏草在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列的独特性及与其他虫草基因序列的相异性，以下则是藉由演化图来验证本发明的冬虫夏草的属性，以便支持其确是为冬虫夏草无误。其是将表1～表3中及由基因资料库(Gen Bank)中已发表的虫草属与本发明的冬虫夏草进行亲缘关系的比较；如表8是将冬虫夏草在引子组NS3/NS4间的18S核糖体RNA基因序列与取自基因资料库上的虫草属类缘近属以自动定序仪(Seq App)定序，再以S.cerevisiae为out group利用PAUP4.0(Phylogenetic Analysis Using Parsimony 4.0)进行演化树计算及以Tree View 3.0(Diving of Environmental and Evolutionary BiologyIBLS)建立一个如图6所示的演化树图；从图6显示的结果得知，包括冬虫夏草的所有内座菌目(Hypocreales)的菌种均分在同一群，证明了本发明所供试的冬虫夏革标本隶属于一种内座菌目。另外表9及表10的菌种同样经定序、演化树计算后所得的演化树图如图7、图8所示，其中图7是取引子组NS3／NS4间的18S核糖体RNA基因序列以H．luta为Outgroup，图8是取引子组NS5／NS6间的18S核糖体RNA基因序列以A.terveus为Outgroup；由图7、图8的结果显示，本发明所供试的不同产地、来源和时间的冬虫夏草标本均分在同一群，证实其源于同一物种，而凉山虫草C.liangshanensis和冬虫夏草的亲缘关系虽然最近，但由演化图上仍可清楚地判别其群属。由图6至图8也证明了本发明所供试的不同来源的标本确为纯正的冬虫夏草无误。
综上所述，借着冬虫夏草在引子组NS3／NS6间的18S核糖体RNA基因序列的特有排列结果(如图9)可以成为鉴别冬虫夏草与其他虫草差异性的指标。
表1．本发明所使用的冬虫夏草标本
表2本发明所使用的虫草属标本及酵母菌
表3．本发明所使用的虫草属菌株及其他参考菌株
表4．本发明所使用的引子
表5.冬虫夏草的18S核糖体RNA基因序列登录编号 ○登录中表6．虫草属标本的18S核糖体RNA基因序列登录编号
表7．虫草属菌株的18S核糖体RNA基因序列登录编号
○登录中表8．用于计算图6的系统演化关系图的标本及其序列登录编号
表9用于计算图7的系统演化关系图的标本及其序列登录编号
表10．用于计算图8的系统演化关系图的标本及其序列登录编号
○登录中
权利要求
1．一种鉴别冬虫夏草的基因序列，是指以引子组NS3/NS6进行冬虫夏草的18S核糖体RNA基因的PCR扩增所得如下的基因序列冬虫夏草(Cordyceps sinensis)在NS3/NS4间的DNA序列1 tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc tccaatagcgtatattaaag ttgttgtggt61 taaaaagctc gtagttgaac cttgggcctg gctggccggtccgcctcacc gcgtgtactg121 gtccggccgg gcctttccct ctgtggaacc ccatgcccttcactgggcgt ggcggggaaa181 caggactttt actttgaaaa aattagagtg ctccaggcaggcctatgctc gaatacatta241 gcatggaata atgaaatagg acgcgcggtt ctattttgttggtttctagg accgccgtaa301 tgattaatag ggacagtcgg gggcatcagt attcaatggtcagaggtgaa attcttggat361 ccattgaaga ctaactactg cgaaagcatt tgtcaaggatgttttcatta atcaggaacg421 aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac cgtcgtagtcttaaccataa actatgccga481 ctagggatcg gacgatgtta ttttttgact cgttcggcaccttacgagaa atcaaagtgc541 ttgggctcca gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactt；冬虫夏草(Cordyceps sinensis)在NS5/NS6间的DNA序列1 aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgcacgcgcgctac actgacggag61 ccagcgagtc ctcccttggc cggaaggccc gggtaatcttgttaaacttc gtcgtgctgg121 ggatagagca ttgcaattat tgctcttcaa cgaggaatccctagtaagcg caagtcatca181 gcttgcgttg actacgtccc tgccctttgt acacaccgcccgtcgctact accgattgaa241 tggctcagtg aggcgtccgg actggcccag gggggtgggaaaccgccccc cagggccggg301 aagctctcca aactcggtca tttagaggaa gtaaaagtcgtaacaaggtc tccgtaggtg361 aacctgcgga。
2．一种利用权利要求1所述的基因序列鉴别冬虫夏草的方法，是将待鉴定物的DNA萃取物分别以引子组NS3/NS4、NS5/NS6进行PCR反应扩增其18S核糖体RNA基因，扩增后的PCR产物再以自动定序仪进行核酸序列的排序，所得的基因序列和权利要求1所述的鉴别冬虫夏草的基因序列相比较，藉由两者的序列排列异同即可确定待鉴定物是否为冬虫夏草。
全文摘要
本发明是关于一种鉴别冬虫夏草的方法,其是将取自冬虫夏草在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列做为参照资料;而待鉴定物的DNA萃取物也进行以引子组NS3/NS6的PCR扩增其18S核糖体RNA基因,扩增后的PCR产物再以自动定序仪进行核酸序列的排序,所得的基因序列与前述冬虫夏草的基因序列相比较;藉由两者的基因序列的排列异同,即可确定待鉴定物是否为一冬虫夏草;而前述冬虫夏草在引子组NS3/NS6间的18S核糖体RNA基因序列也成为鉴别纯正冬虫夏草的重要指标。
文档编号C12Q1/68GK1298024SQ0010908
公开日2001年6月6日 申请日期2000年6月6日 优先权日1999年11月30日
发明者许瑞祥, 陈志升 申请人:罗森, 王世任, 许瑞祥