专利名称：用于均相荧光pcr检测的孪生引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因的扩增与检测。
聚合酶链式反应(PCR)已广泛应用于基于核酸的各个研究领域，在临床诊断方面的应用也日益增加，均相荧光PCR是近几年发展起来的新型检测技术。目前均相荧光PCR检测技术已有多种方式，根据是否具备识别特异扩增片段的能力可以分为非探针型和探针型两类。非探针型有荧光嵌入剂法和Sunrise Primer(又称Amplifluor)，探针型包括5′-核酸外切酶技术(TaqMan探针)、分子信标(molecular beacon)技术、应用于Lightcycler的双探针技术、蝎子引物(Scorpions primer)以及AmpliSensor等。前一类型设计简单，但由于无法识别非特异扩增产物，在实际应用中受到很大限制。后一种类型，由于增加了探针识别步骤，提高了测定的可靠性，但实验设计复杂，价格高昂。这两类技术缺点的根源在于它们都缺乏有效预防非特异扩增的机制。
目前预防非特异扩增技术主要有固体石蜡法和热启动法(hot-start)。固体石蜡法是预先将DNA聚合酶用固体石蜡与其它反应成分隔开，这样，即使在低温阶段存在非特异结合，由于没有聚合酶的参与也就无法形成延伸产物。随着温度升高，低熔点的结合全部解离，此时聚合酶才通过融化的石蜡与反应成分接触，而发生扩增反应。该法消除了反应开始前至升温这一阶段引起的非特异扩增。显然，由于石蜡只能发挥一次性作用，对以后循环中退火阶段可能发生的非特异扩增无能为力。由于固体石蜡膜法操作烦琐，易引入污染，目前应用已很少。另一种常用的方法是热启动技术，通过对聚合酶进行处理，如聚合酶抗体技术，聚合酶人工修饰等，使聚合酶在低温阶段不具活性，高温时活性才得以发挥，如PE公司著名的AmpliTaq Gold等。经过处理的聚合酶可以预先与反应组分混合，其作用机制与固体石蜡法相似，同样只能在反应开始前至升温这一阶段发挥一次性作用。热启动技术目前应用较广，已有多家公司推出了不同的修饰酶，但普遍价格高昂。以上这些技术均无法在扩增的全程发挥作用，因而不能彻底消除非特异扩增。
本发明的目的旨在提供一种可预防非特异扩增的、用于均相荧光PCR检测的双链式引物——孪生引物。
孪生引物为正引物与负引物杂交而成的双链结构，正引物为用于PCR扩增的上、下游引物，负引物为与正引物互补的并经修饰的序列。孪生引物包括标记型和非标记型两种。
标记型孪生引物为在正引物的5′端标记荧光染料，负引物的3′标记荧光淬灭剂，这一修饰使负引物不具备延伸能力，在这种结构的孪生引物中，荧光染料和荧光淬灭剂同处一端发生荧光淬灭，形成非荧光的孪生引物。标记型孪生引物的制备方法是首先在正引物的5′端标记上荧光染料，负引物的3′端标记上荧光淬灭剂，将标记后的正、负引物以1∶(1.0～2.0)比例混合，在1.0～2.0mM Mg2+体系中，于20～95℃下杂交而成双链式引物。
非标记型孪生引物为正引物无标记，负引物的3′端磷酸化或加双脱氧核苷酸，使其通过修饰而失去延伸能力。非标记型孪生引物的制备为首先将负引物的3′端磷酸化或加双脱氧核苷酸，然后将正、负引物以1∶(1.0～2.0)的比例混合后，在1.0～2.0mM Mg2+体系中，于20～95℃下杂交而成双链式引物。
标记型孪生引物用于均相荧光PCR检测的原理如下在由标记孪生引物组成的PCR反应混合体系中(见
图1)，以孪生引物1和孪生引物2分别作为上、下游引物，均在正引物的5′端标记上荧光染料(用0表示)，负引物的3′端标记上淬灭剂(用
表示)。在反应开始前的低温阶段，由于不存在游离的具备延伸能力的正引物，不会发生正引物之间的结合或正引物在模板上的非特异结合，也不会生成引物二聚体或非特异扩增产物；游离的过剩负引物即使能够发生非特异结合，因不具备延伸能力，也无法形成扩增产物。也就是说，采用孪生引物的PCR扩增体系，在进入变性阶段前有效预防了非特异扩增的发生。进入热变性阶段，孪生引物和模板均发生变性，正引物从孪生引物中被释放出来，荧光性质得以恢复。温度降低至退火温度时，部分正引物与模板结合，部分正引物则为过剩的负引物退火而重新成为无荧光的孪生引物，同时，负引物也结合至模板，但不引发延伸反应。这些过程杜绝了正引物发生非特异结合的机会，也就是说，在循环的退火阶段或者说整个循环阶段(因其它阶段不发生退火)孪生引物同样发挥了预防非特异扩增的作用。该阶段反应体系的荧光源于释放出的正引物的退火和延伸。当温度升高(如72℃)进入延伸阶段时，退火的正引物将引导DNA的合成，生成具荧光的扩增产物；此时，孪生引物会因温度高于其熔点而发生解链，那些与模板结合的负引物也会解离下来，而不影响延伸的进行。在以后的每一轮温度循环中，正引物都会随着扩增产物的积累而消耗，PCR结束后，整个反映体系的荧光强度也将得以积累。从以上扩增过程可以看出，孪生引物PCR不仅能在反应开始前而且能在整个扩增循环过程中，发挥预防非特异扩增的作用。还可以看出，标记型孪生引物PCR可以采用终点测定法获得定性或半定量结果，也可以通过实时检测每一循环退火阶段的荧光强度，实现定量检测。
标记孪生引物用于均相荧光PCR检测，将预防非特异扩增和实现均相荧光检测通过标记的孪生引物同时完成。和同样采用荧光淬灭原理的其它均相PCR检测技术，如Sunriseprimer、分子信标、蝎子引物和TaqMan探针相比，理论上，标记孪生引物具有更高的分析灵敏度。因为前三者荧光信号来自于发夹型引物或探针的开闭之差，或者说是荧光物质及其淬灭剂之间从零距离变化到一有限长距离之后荧光的增加程度；TaqMan探针技术的荧光信号则是来自于探针解离前后之差，或者说是荧光物质及其淬灭剂之间从一有限长距离变化到一无限长距离之后荧光的增加程度。标记型孪生引物PCR的荧光信号来自于孪生引物中正引物的释放，它是荧光物质及其淬灭剂之间是从零距离变化到无限长距离之后荧光的增加程度。显然后者的距离变化最大，因而在采用相同的荧光物质和淬灭剂的情况下，后者的荧光信号也最大。
从制备的角度比较，标记型孪生引物最为简单。首先，孪生引物可根据引物序列即能直接完成设计；其次，孪生引物的标记是寡核苷酸的单端修饰，可以通过固相合成直接制备，纯化一步完成，因此产率也高。其它的探针或引物，皆为双修饰(双端修饰或内部插入修饰)，且须按照彼此的规则进行特殊处理，由于这些规则均属经验性质，常常需要数次尝试才能成功，而个别情况，如蝎子引物则需专门合成商完成。双修饰纯化繁琐，产率低，因此价格普遍高昂。对于探针型而言，存在的另一问题是，由于需要设计出可以检测特异的扩增产物的探针，对于那些引物包含序列或未知或为高度可变区域的情况，探针设计的难度将大大增加。
标记型孪生引物PCR均相荧光检测技术本身具有很大的灵活性，根据上述原理，具备一定经验的人可以设计出多种模式。比如，在PCR反应中，可以一侧采用标记孪生引物，另一侧采用正引物或非标记孪生引物。孪生引物要求负引物不具备延伸能力，根据这一要求，除了采用双脱氧核苷酸和磷酸化途径外，具备一定经验的人可以设计出多种方式，比如负引物采用不具备延伸能力肽核酸等，这些新途径还可能赋予双链引物以新的优点，如对反应体系中镁离子不敏感，抗降解能力等。为了进一步提高测定灵敏度，标记型孪生引物中的荧光物质和淬灭剂的标记数量可以不限于一端，可以进一步在链中间插入多个修饰的碱基，在不干扰扩增的情况下，使灵敏度得以大幅度提高。
标记型孪生引物PCR均相荧光检测技术可与现有技术具有兼容，也就是说，原有的多数均相荧光PCR检测技术可以采用标记孪生引物，并可能增加一些新的功能。比如对于非探针型的Sunrise primer(又称Amplifluor)，在一侧引物为Sunrise primer时，另一引物就可以采用标记孪生引物，这样做的好处是，可以避免引物间二聚体的形成引起的非特异扩增。对于探针型的分子信标，使用带有相同荧光基团和淬灭剂(这里指具有相同效果的荧光基团和淬灭剂，而不一定是完全一样的物质，以下同)的标记双链引物，就可能进一步提高测定的灵敏度，因为，分子信标具备识别特异扩增的能力，但不具备预防非特异扩增功能。采用标记双链引物后，一方面避免了非特异扩增引起的消耗，有助于提高特异扩增产率，另一方面，标记双链引物扩增本身也贡献了荧光信号。同样地，对于其它探针型如TaqMan和Amplisensor而言，只要标记型双链引物使用相同的荧光基团和淬灭剂，也可达到类似效果。对于蝎子引物，可以一侧采用标记双链引物，对于用于Lightcycler的双探针，由于后者采用能量转移原理而非荧光淬灭途径，标记双链引物不能直接使用，但是，可以理解的是，如果两者之一在荧光染料选择上加以变换，就可达到兼容的目的。
标记型孪生引物还可用于内标设计，在PCR反应中，加入内标是防止假阴性和实现定理检测的有效途径。内标的传统概念是使用与靶序列完全相同的引物，其序列又与靶序列相近，以使二者扩增效率尽量接近，但为了检测时能区分它们，二者又需保持一定差异。这一点成为设计内标的主要矛盾。孪生引物PCR为设计内标提供了新思路。孪生引物内标PCR的设计思想为，内标序列的长度与模板一致，内标序列的引物间部分采用模板引物间相同序列，两个内标引物或者其中的一个与模板引物序列不同，但其熔点和退火效率与模板引物一致。内标引物与模板引物采用不同的荧光标记以便于荧光测定。与传统设计采用引物包含序列不同，采用标记孪生引物设计的内标引物包含序列完全相同，但两者的扩增引物序列不同，但靶序列的引物和内标的引物在退火温度，效率等方面应尽可能一致。用于检测时区分它们的方法则是利用不同的标记荧光染料。由于，内标和靶序列扩增的序列扩增部分完全相同，决定于二者效率的影响因素就只有引物序列，很显然，在延伸阶段，引物序列对扩增的影响很小，因此，这一设计本身经大大缩小了靶序列和内标扩增之间的差别，而不同的荧光染料在检测时又很容易地将它们区分开来。另一方面，在靶序列引物基础上设计出退火效率相同的引物也相对简单。内标的生成可以通过诸多技术，如PCR突变技术等实现。对于有一定经验的人来说，可以采用多种灵活的途径实现这一点。
标记型孪生引物也可用于多重荧光PCR，在这样的反应体系中，每个反应采用互不相同的荧光标记染料。在反应后，通过检测不同染料的荧光反应，即可达到同时检测各个反应的目的。与一般多重PCR相比，孪生引物多重荧光PCR有两个明显优势一是可以实现均相荧光同时检测，二是双链引物有助于防止引物多重PCR中的多个引物之间的非特异结合。
非标记型孪生引物用于均相荧光PCR检测采用的一种典型的荧光指示系统就是荧光嵌入剂。荧光嵌入剂是一类能嵌入双链DNA而发出特征荧光的荧光染料。目前在均相荧光PCR检测中，最常用的是SYBR Green I。SYBR Green I可以直接用于常规PCR反应中，是实现均相荧光测定的最简便途径，但是，由于荧光嵌入剂不具备识别非特异扩增能力，在均相荧光PCR检测中的应用受到很大限制。采用非标记双链引物后，这种情况得以根本改变，双链引物具备在PCR全程发挥预防非特异扩增的作用，如果嵌入剂仅指示扩增的DNA，就可以实现特异的均相荧光测定。
在由非标记孪生引物和荧光嵌入剂组成的PCR反应混合体系(见图2)中，以孪生引物3和孪生引物4为上、下游引物，其负引物的3′端均经修饰而成封闭端(用X表示)。在反应开始前的低温阶段，由于不存在游离的具备延伸能力的正引物，不会发生正引物之间的结合或正引物在模板上的非特异结合，也不会生成引物二聚体或非特异扩增产物；游离的过剩负引物即使能够产生非特异结合，因其不具备延伸能力，也无法形成扩增产物。也就是说，采用孪生引物的PCR扩增体系，在进入变性阶段前有效预防了非特异扩增的发生。荧光嵌入剂和双链DNA的存在，使处于这一阶段的反应液是具荧光的。在进入热变性阶段的过程中，到达一定温度后，孪生引物和模板均发生变性，正引物从孪生引物中被释放出来。由于此时无双链DNA与荧光嵌入剂结合，此时反应体系的荧光是最低的。温度降低至退火温度后，部分正引物与模板退火，部分正引物被大量过剩的负引物退火又生成孪生引物，同时，负引物也结合至模板，但不会引发延伸反应。这些过程杜绝了正引物发生非特异结合的机会，也就是说，在循环的退火阶段或者说整个循环阶段(因其它阶段不发生退火)孪生引物同样发挥了预防非特异扩增的作用。此阶段反应体系的荧光源于嵌入剂与退火形成的所有双链DNA的结合。当温度升高(如72℃)进入延伸阶段时，退火的正引物引导DNA的合成，嵌入剂将会与双链DNA结合发出荧光，而且，随着DNA链的延长，会有更多嵌入剂结合，故体系的荧光在延伸的后期更强。处于延伸阶段的孪生引物会因温度高于其熔点而发生解链，那些与模板结合的负引物也同样解离下来。也就是说，此时体系的荧光的唯一来源就是正引物退火并延伸的双链DNA。它代表了特异扩增产物的生成。在以后的温度循环中，正引物将因生成扩增产物而被消耗(负引物无消耗)。在延伸阶段测定的荧光强度，将能如实反映扩增产物的生成。选择在此阶段测定每一循环的荧光强度就实现了实时测定，可以看出，孪生引物PCR不仅能在反映开始前而且能在整个反应过程中，都发挥着预防非特异扩增的作用，保证了测定结果的特异性。
在实际测定中，非标记孪生引物PCR测定方式与常规荧光嵌入剂实时测定方式相同，即首先测定反应热启动阶段的荧光强度(此时荧光强度最低)作为本底，以后测定每一循环延伸阶段后期的荧光强度，二者的差值作为该循环的荧光强度。需要指出的是，非标记孪生引物PCR不适合采用终点测定法进行定性或半定量测定。原因是，孪生引物反应前后的大量存在使反应体系均呈荧光，扩增后反应体系的荧光强度变化由——孪生引物消耗导致的荧光强度降低和扩增产物积累引起的荧光强度增加——两个相互消长的因素决定，其净结果难以反映出原始模板量的差别。
非标记型孪生引物均相荧光PCR，在设计上较标记型更为简单。
非标记孪生引物提供预防非特异扩增能力，在选择荧光指示系统上则不受约束。采用荧光嵌入剂只是一种最为简便的途径。实际上，现有的多数均相荧光PCR检测技术都可以直接采用非标记孪生引物。比如对于非探针型的Sunrise primer，在一侧引物为Sunrise primer时，另一引物就可以采用非标记孪生引物，这样做的好处是，可以避免引物间二聚体的形成导致非特异扩增。对于探针型的分子信标，使用非标记孪生引物，一方面可进一步提高测定的灵敏度——因为分子信标具备识别特异扩增的能力，但不具备预防非特异扩增功能，双链引物避免了非特异扩增引起的消耗，有助于提高特异扩增产率。另一方面，孪生引物PCR具备的特异扩增能力加上探针的特异指示能力，使这一组合成为理论上最为可靠的检测系统。对于其它探针型如TaqMan、Amplisensor和Lightcycler的双探针，采用非标记孪生引物，也都可以取得类似效果。对于蝎子引物，可以一侧采用蝎子引物，另一侧采用非标记孪生引物。与标记孪生引物不同，非标记型可以直接采用这些荧光指示系统，而无须考虑荧光基团和淬灭剂的选配。非标记孪生引物与各种荧光指示系统的结合，也使得测定方式更加灵活。实际上，采用非标记的孪生引物，并不改变这些荧光测定系统的原由测定方式。如与探针型的分子信标结合，既可进行终点测定，又可在循环的退火阶段进行实时测定，因为分子信标本身就具备这些测定方式。与Sunrise primer、TaqMan、Lightcycler的双探针、蝎子引物以及Amplisensor等的组合，也是类似情况。
在某些PCR反应中，非标记孪生引物也可以采用一侧使用孪生引物而另一侧使用正引物的方式。非标记孪生引物也要求负引物不具备延伸能力。负引物可以采用多种设计模式，除了采用双脱氧核苷酸和磷酸化途径外，具备一定经验的人可以设计出多种方式，比如采用不具备延伸能力的肽核酸等，这些新途径还可能赋予双链引物以新的优点，如对反应体系中镁离子不敏感，抗降解能力等。
图1为标记型孪生引物的PCR原理示意图。
图2为非标记型孪生引物的PCR原理示意图。
图3为标记型孪生引物与传统引物PCR琼脂糖凝胶电泳对照图。
图4为标记型孪生引物PCR荧光检测结果。
图5为单侧标记型孪生引物PCR用于人端粒酶的荧光检测结果。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1标记型孪生引物PCR用于人β-珠蛋白的检测。
人β-珠蛋白的PCR扩增是一个标准的PCR程序，我们用它来说明标记型孪生引物用于均相荧光PCR的原理。
标记孪生引物的制备正引物是在传统引物的5′引入荧光修饰，本例采用FAM。具体设计为5′-FAM-GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3′和5′-FAM-CAA CTT CAT CCACGT TCA CC-3′；两负引物的序列可以直接采用其正引物的互补序列，也可在其5′缩短若干碱基提高正引物的解离效率。其3′端则标记淬灭剂DABCYL。本例中，负引物的5′缩短一个碱基，即5′-TAC CTG TCC TTG GCT CCT C-Dabcyl-3′和5′-GTG AAC GTG GATGAA GTT G-Dabcyl-3′。
将正引物与负引物以1∶1.5比例混合，杂交液含1.5mM Mg2+。杂交条件94℃ 5min，55℃ 2min。冷却，冷冻保存作为PCR反应的引物。
正常人外周血由实验室志愿者提供。用淋巴细胞液分离法分离血液白细胞和用常规酚氯仿抽提，乙醇沉淀法提取白细胞DNA。
PCR反应PCR反应总体积为25μL，内含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.0UTaq酶，200μM dNTP，2.0mM MgCl2，0.4μM正引物的孪生引物，5μL模板，50μL石蜡油，经95℃，5min预变性，再95℃，30s，55℃，35s，72℃，1min，40个循环后，72℃延伸5min。PCR扩增后直接进行荧光值测定。结果见图3、4。从图3中可明显看出标记型孪生引物PCR可有效地预防非特异扩增(b表示空白)。图4中，F表示荧光强度，s为样品，从图中看出，模板的浓度与荧光强度成正比。
实施例2单侧标记型孪生引物PCR用于人端粒酶的检测。
端粒酶是一种广谱的肿瘤标志物，目前端粒酶的测定方法繁琐，本例说明采用单侧标记孪生引物可以实现快速的均相荧光PCR检测，TS引物为5′-AAT CCG TCG AGC AGAGTT-3′。
孪生引物的制备正引物在端粒酶的TX引物基础上，在5′端标记FAM，即5′-FAM-CCC TTACCC TTA CCC TTA CCC TAA，负引物在选择其负补序列，其中5′端缩短一个碱基，3′端则用淬灭剂标记，即5′-TAG GGT AAG GGT AAG GGT GGT AAG GG-Dabcyl-3′。将正负引物以1∶1.5比例混合，杂交液含2.0mM Mg2+。杂交条件为94℃ 5min，55℃2min。冷却，冷冻保存作为PCR反应的引物。
端粒酶从人胃癌细胞MGc80-3中提取。
端粒酶的延伸体系25μL，内含20mM Tris-HCl，pH8.3，200μM dNTP，0.4μM TS引物，5μg CHAPS细胞提取物，50μL石蜡油。经22℃，10min反应后，再95℃，15min热变性，加入0.4μM下游孪生引物(含2U Taq酶)进行PCR扩增。PCR反应条件为经94℃预变性60s，再94℃ 30s，50℃ 30s，72℃1.5min，30个循环后72℃延伸5min。对PCR产物直接进行荧光测量。结果见图5。
实施例3非标记型孪生引物PCR用于乙型肝炎病毒(HBV)的检测。
采用非标记型孪生引物进行均相荧光PCR检测，需要采用相应的荧光指示系统，本例利用荧光嵌入剂，说明非标记孪生引物的设计和检测方法。
非标记孪生引物的制备选择扩增HBV的引物序列引物15′-CTT TAT AAG GATCAA TGT CCA TGC-3′和引物25′-GAA ATA TTC CTA GTT ACA GGT ACG-3′。引物1的负引物为5′-GCA TGG ACA TTG ATC CTT ATA AAG-3′-PHOR，引物2的负引物为5′-CGT ACC TGT AAC TAG GAA TAT TTC-3′-PHOR，其中，PHOR为磷酸基，用于封闭负引物的延伸。将正负引物以1∶1.5比例混合，杂交液含1.5mM Mg2+，杂交条件为94℃5min，55℃2min。冷却，冷冻保存作为PCR反应的引物。
取临床血清标本，按常规水煮法提取DNA。
PCR反应PCR反应总体积为25μL，内含10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.0UTaq酶，200μM dNTP，1.5mM MgCl2，0.4μM正引物的孪生引物、1∶10,000的SYBRGreen I(Molecular Probes Inc)和5μL模板，滴加50μL石蜡油，经95℃，5min预变性，再95℃，30s，55℃，35s，72℃，1min，35个循环后，72℃延伸5min。通过测定延伸阶段的荧光强度进行实时测定。
权利要求
1.用于均相荧光PCR检测的孪生引物，其特征在于孪生引物为正引物与负引物杂交而成的双链结构，正引物为用于PCR扩增的上、下游引物，负引物为与正引物互补的并经修饰的序列。
2.如权利要求1所述的用于均相荧光PCR检测的孪生引物，其特征在于孪生引物为标记型孪生引物，其正引物的5′端标记荧光染料，负引物的3′端标记荧光淬灭剂。
3.如权利要求1和2所述的用于均相荧光PCR检测的孪生引物，其特征在于其制备为首先在正引物的5′端标记上荧光染料，负引物的3′端标记上荧光淬灭剂，将标记后的正、负引物以1∶(1.0～2.0)的比例混合，在1.0～2.0mM Mg2+体系中，于20～95℃下杂交而成双链式引物。
4.如权利要求1所述的用于均相荧光PCR检测的孪生引物，其特征在于孪生引物为非标记型孪生引物，其正引物无标记，负引物的3′端磷酸化或加双脱氧核苷酸。
5.如权利要求1和4所述的用于均相荧光PCR检测的孪生引物，其特征在于其制备为首先在负引物的3′端磷酸化或加双脱氧核苷酸，然后将正、负引物以1∶(1.0～2.0)的比例混合后，在1.0～2.0mM Mg2+体系中，于20～95℃下杂交而成双链式引物。
全文摘要
提供一种可预防非特异扩增的,用于均相荧光PCR检测的双链式引物——孪生引物。孪生引物由正引物与负引物杂交而成,正引物为用于扩增的上、下游引物,负引物为与正引物互补的并经修饰的序列,包括标记型和非标记型两种。通过在正引物的5′端进行标记或不作任何标记,而在负引物的3′端通过修饰而使其失去延伸能力。双链结构的孪生引物在PCR过程中可有效地预防非特异扩增,且其制备简单,可灵活地应用于各种PCR检测技术中。
文档编号C12Q1/68GK1278009SQ0010841
公开日2000年12月27日 申请日期2000年4月30日 优先权日2000年4月30日
发明者李庆阁, 郭秋平, 栾国彦, 梁基选 申请人:厦门大学