编码新的氨肽酶的dna分子和生产该氨肽酶的方法

专利名称：编码新的氨肽酶的dna分子和生产该氨肽酶的方法
技术领域：
本发明涉及编码新的、源于大豆的氨肽酶的DNA分子，含有该DNA分子的重组表达载体，被该重组表达载体转化了的转化体，和采用该转化体生产氨肽酶的方法采用酸诸如盐酸和硫酸或从微生物、例如曲霉属，中分离得到的现存蛋白酶，大豆蛋白质通常被水解成氨基酸。
然而，当采用酸性蛋白酶解来获得适于作为天然调味品的大豆蛋白的蛋白酶解产物时，反应必须在100℃下进行一天或两天。如此高温下的反应进行如此长的时间，将引起高能耗的问题。尽管蛋白的酸性水解很容易进行，但却另外存在着过分解(降解)和由中和反应引起的高盐含量的问题。
为了解决这些问题，建议在温和的反应条件下，采用现存蛋白酶分解大豆蛋白。特别是，由于是温和反应条件下的生物学反应的分解过程，希望采用蛋白水解酶(蛋白酶)将大豆蛋白水解成氨基酸成为替代酸性水解的化学反应的可取方法。
然而，当蛋白处于天然状态，豆科植物中的贮存蛋白通常对现存蛋白酶具有很高的耐性。由于现有蛋白酶诸如木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶通常是肽链内切酶，尽管它们能将蛋白分解为肽，但仅使用这些蛋白酶将蛋白完全分解成氨基酸是困难的。另外，由于味苦，由此获得的产品实际上不能用作调味品。
人们已经考虑到，也能将肽分解成氨基酸的肽链内切酶和肽链端解酶诸如氨肽酶和羧肽酶的结合对解决上述问题是有效的。
另一方面，据报导，亮氨酸氨肽酶和酸性羧肽酶在采用曲霉属分解大豆蛋白中，例如在酱油的酿造[Tadanobu Nakadai，“Shoken”Vol.11，No.2(1985)]中，对于增加游离氨基酸的含量是重要的。然而，如这篇报告中所提出的，酱油仍然含有序列中含有酸性氨基酸的二肽和三肽，因此指出它们分解的困难性。二肽和三肽也包括N-末端具有谷氨酸或天门冬氨酸的肽。
肽分解的困难性表现在肽酶相对这些肽的底物特异性很低。除了在酱油酿造中，采用从曲霉属中分离的肽酶分解肽时遇到的困难问题外，从市场上买到的肽酶制剂也有问题，这就是微生物酶，诸如得自于曲霉属的酶，对于含有酸性氨基酸的二肽和三肽的分解活性也很低。
在这些情况下，发明人试图通过采用大豆子叶解决上述问题。即，大豆籽中的贮存蛋白在种籽发芽过程中非常短的时间内被水解成氨基酸。从这一现象出发，假设能轻易水解贮存蛋白中难于水解的肽的肽酶存在于发芽大豆中。发明人发现了在发芽大豆子叶中的这种肽酶(氨肽酶GX和亮氨酸氨肽酶，能够有效水解含有酸性氨基酸的肽)，并且在有效地水解大豆蛋白方面获得了成功[日本未审公开专利申请(下文称作“JP-Kokai”)No.9-294583]。
然而，由于这些子叶中的大豆氨肽酶GX的含量非常低，所以从发芽大豆子叶的提取物中获得大量的大豆氨肽酶GX是困难的。
在解决上述问题的方法之一中，氨肽酶基因通过基因重组技术得到了高表达，该重组技术通过采用系统而不是大豆，获得了大量的氨肽酶。实施这一方法的关键是要得到编码氨肽酶的cDNA和分析DNA序列，来得到氨肽酶的氨基酸全序列的信息。
将编码氨肽酶的DNA重组到一个合适的表达载体上，从而获得能够大量生产目的产物的转化体也是必不可少的。
本发明是在这些情况下完成的。本发明的目的是提供一种采用基因重组技术进行有效的基因表达和大量生产氨肽酶的技术，其可用来取代上述从天然获得的发芽大豆子叶中分离氨肽酶的原始方法。
在为了解决上述问题而进行的大量研究后，通过以稻谷植物EST作为具有与氨肽酶GX高度同源的内氨基酸序列的探针，筛选制备于发芽大豆的芽的mRNA的cDNA文库，发明人成功地获得了编码氨肽酶GX的cDNA。
在进一步研究后，发明人成功地获得了能够由如此获得的cDNA形成氨肽酶的转化体，然后获得具有氨肽酶活性的蛋白。
即，本发明提供如下(1)一个编码源于发芽大豆子叶且具有序列表中的SEQ ID No1氨基酸序列的、新的氨肽酶的DNA分子。
(2)含有所述DNA分子的重组DNA分子。
(3)被所述重组DNA分子转化了的转化体。
(4)生产具有氨肽酶活性的蛋白的方法，该方法包括培养转化体来生产具有氨肽酶活性的蛋白，并回收。
为了解决上述问题，进行了大量的研究，通过以稻谷植物EST作为具有与氨肽酶GX高度同源的内氨基酸序列的探针，筛选制备于发芽大豆芽的mRNA的cDNA文库，发明人成功地获得了编码氨肽酶GX的cDNA。


图1.表示构建质粒pUCTRPGXN1-8的策略。
图2.表示构建GX表达质粒pUCTRPGX1-8的策略。
图3.表示构建质粒pUCTRPGXN2-1的策略。
图4.表示构建GX表达质粒pUCTRPGX2-1的策略。
本发明提供如下(1)一个编码源于发芽大豆子叶且具有序列表中的SEQ ID No1的氨基酸序列的、新的氨肽酶的DNA分子。
(2)(1)中的DNA分子的变异体，其编码具有SEQ ID No1的氨基酸序列的蛋白的变异体，其中SEQ ID No1的氨基酸序列中插入、增加、删除或取代了一个或多个氨基酸残基。
(3)(1)中的DNA分子，其具有序列表中的SEQ ID No2中第22个碱基到第1428个碱基的DNA序列。
(4)含有(1)到(3)中任意一个的DNA分子的重组DNA分子。
(5)被重组DNA分子转化了的转化体。
(6)生产具有氨肽酶活性的蛋白的方法，包括培养转化体来生产具有氨肽酶活性的蛋白，并回收。
本发明将作出更加详细的说明。下文中，氨肽酶GX将被称作“GX”。
<1>本发明的DNA分子本发明的cDNA能够通过，例如一种普通的方法获得，该方法中在已经测出的GX的氨基酸序列的基础上合成寡聚-DNA，通过采用从发芽大豆的子叶或其另外部分中提取的mRNA作为RT-PCR方法的模板来制备基因片段，以基因片段为探针，从制备于以发芽大豆的子叶或另外部分的mRNA作为模板的cDNA文库中，通过杂交来克隆GX的cDNA。
在另外一种可行的方法中，从合适的DNA数据库诸如DDBJ、EMBL或GenBank中检索到与将GX的已测的氨基酸序列进行编码的DNA序列高度同源的一个DNA序列，以从发芽大豆的子叶或另外部分中提取的mRNA为模板来制备cDNA文库，以相应序列的DNA片段作为探针来筛选cDNA文库以便获得GX的cDNA。
用于提取GX的mRNA的发芽大豆的种类不限。即种植地区和大豆的品种不受限制。市场上买到的那些用作榨豆油的原料的大豆等也可以使用。而且，发芽的方法、培养条件、阶段(发芽的或未发芽的)和它们发芽的持续时间也不受限制。然而，优选地使用经水浸泡后生长7到10天所获得的发芽大豆。
cDNA探针也可在测得的氨基酸序列的基础上，通过采用从发芽大豆子叶的子叶或另外部分中提取的mRNA，以RT-PCR方法或类似方法来制备；或在所述氨基酸序列的基础上，通过化学合成来制备。与所述氨基酸序列高度同源的DNA序列即可用作探针，而不需考虑DNA序列的来源和基因产品的功能。即，DNA序列不需限定到已知氨肽酶的DNA序列；具有未知功能的基因产品也可使用。并且EST(表达序列的标记)也可使用。下面给出的的实施例中，源于稻谷植物根部的EST被作为探针。cDNA文库可通过一般的方法制备。
因此，可以获得编码源于发芽大豆子叶且具有序列表中SEQ ID No1氨基酸序列的新氨肽酶的DNA分子。本发明的DNA分子可以是编码序列表中具有SEQ ID No1氨基酸序列的蛋白的DNA分子，该SEQ ID No1氨基酸序列中被插入、增加、删除或取代了一个或多个氨基酸残基，由该DNA分子编码的蛋白具有氨肽酶活性。
通过进一步研究，发明人成功地获得了能够由如此获得的cDNA形成氨肽酶的转化体，然后获得了具有氨肽酶活性的蛋白。
<2>本发明的重组DNA分子由此获得的cDNA被组合到表达载体上，从而获得重组DNA分子。所使用的载体没有特别的限制。载体可以是在宿主细胞中能够自我复制的载体或能够被以多于一个拷贝的方式插入到染色体上的载体。该载体必须具有一个可被插入上述DNA，即GX基因的插入位点和进一步具有一个允许插入的DNA在宿主细胞中表达的区域。
插入到载体的GX基因不仅仅被限定在cDNA而且也包括为编码由cDNA推导出的GX的氨基酸序列所设计的DNA片段。退火后，通过连接采用自动DNA合成仪合成的寡核苷酸，可容易地合成由这样一种氨基酸序列推导出的基因。
在另外一种方法中，GX以与一种与异种蛋白结合的融合蛋白的形式被表达并生产。例如，GX可在大肠杆菌(E.coli)中以通过pGEX系统(AmershamPharmacia Biotech.Co.的一种产品)或类似系统与谷胱甘肽-S-转移酶相结合的融合蛋白形式被生产。
至于表达GX基因的启动子，通常使用用于表达异源蛋白的强启动子。GX基因的下游可引入终止子。启动子的例子包括，例如trp、tac、lac、trc、λPL和T7，终止子包括，例如tpA、lpp和T4。
为了使翻译更加有效，SD序列的种类和数目，和碱基组成、序列和SD序列与起始密码间的区域长度优选地被优化成适于GX基因的表达。
表达GX所需的启动子与翻译起始位点间的区域可通过已知的PCR方法或化学合成方法来制备。序列的例子如SEQ ID No3所示。
本发明的重组DNA分子可通过将上述含有GX基因的DNA片段插入到决定于要使用的表达系统所选择的已知表达载体中。本文中的表达载体优选地是多拷贝载体。
用于制备本发明的重组DNA分子的已知载体是pUC18、pHSG299等。本发明的重组DNA分子的实例是pUCTRPGX1-8，其通过将本发明的DNA重组分子组合到pUC18上而获得。
<3>本发明的转化体将描述通过引入上述重组DNA分子而获得的各种转化体。
可被转化为转化体的细胞为细菌，诸如大肠杆菌等的细胞。大肠杆菌菌株的实例包括JM109菌株(recA，endA1，gyrA96，，thi，hsdR17，supE44，relA1，和Δ(lac-proAB)/F’[traD36，proAB+，lacIq和LacZΔM15])。
可转化为转化体的其它细胞是枯草杆菌、酵母、曲霉菌属的细胞等。利用它们的蛋白-分泌的特点，能够将GX生产到培养基当中。除上述微生物外，也可使用诸如蚕细胞的培养细胞。
将上述获得的重组载体引入宿主细胞来获得转化体。可通过各种传统方法将重组载体引入到宿主细胞中，例如有效的细胞法、原生质体法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、微注射法和脂质体融合法。
<4>生产本发明的氨肽酶的方法在培养基混合物中培养如此获得的转化体来生产GX。通过已知的方法分离GX，如果需要，进行纯化来获得所要的酶。
当使用大肠杆菌作为宿主时，获得的GX基因产品有可能是没有活性的缔合产品，即蛋白包含体，然后通过适当的方法激活这种包含体。经再活化后，活性蛋白可通过已知的方法进行分离和纯化来获得所要的酶。
培养转化体的培养基是已知的。例如，对于培养大肠杆菌，使用的营养培养基如LB培养基或最低培养基如M9培养基需添加碳源、氮源、维生素源等。转化体的培养温度通常是16到42℃，优选地是25到37℃，培养时间是5到168小时，优选地是8到72小时。培养条件随宿主而变化。震荡培养和静止培养都可以。如果需要，培养基可以搅拌或通气。当使用诱导启动子来表达GX，培养基中可加入启动诱导物。
通过已知方法诸如盐析方法、等电沉淀方法或溶剂沉淀的方法；利用了分子量差异的方法诸如透析、超滤或凝胶过滤；利用了特定的亲合力的方法诸如离子交换色谱法；利用了疏水性差异的方法诸如疏水性色谱法或反向色谱法；亲和色谱法；SDS聚丙烯酰胺电泳；或等电聚焦方法，可以从转化体的提取物中分离和纯化出GX。GX可通过这些方法的结合进行纯化。
根据本发明，可获得一个编码氨肽酶GX的氨基酸序列的cDNA，该氨肽酶GX适于从含有富含酸性氨基酸的蛋白质和肽的起始原料中生产高度水解的产物。使用该cDNA，通过大肠杆菌等可大量生产重组氨肽酶。通过使用该cDNA，也可通过使用除大肠杆菌以外的宿主生产氨肽酶GX。另外，富含谷氨酸和天门冬氨酸并且具有出色的调味特性的水解产物可通过结合使用如此生产的GX与市场上买到的蛋白酶如FlavourzymeTM(由Novo Nardisk A/S生产)和蛋白酶MTM(由Amano Pharmaceutical Co.，Ltd.生产)，从大豆蛋白中获得。
蛋白酶D3和亮氨酸氨肽酶DLAP。
实施例下面的实施例旨在说明本发明，并不将本发明的范围限定到这些实施例的范围。
实施例1GX cDNA的克隆在这个实施例中，本发明描述了几个方面<1>测定GX的内部氨基酸序列，<2>找到与GX的DNA序列高度同源的DNA序列，<3>分析大豆中的GX的表达位点和<4>以稻谷植物EST R2219.2A作为探针，筛选发芽大豆芽的cDNA文厍。
<1>测定GX的内部氨基酸序列从发芽大豆子叶中获得的GX蛋白被降解，羧甲基化并采用赖氨酰肽链内切酶(EC.3.4.21.50 Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)处理。如此获得的肽片段采用μRPC C2/C18 SC2.1/10柱(Pharmacia Aktiebolag的产品)进行分离。通过使用蛋白序列仪分析每一片段的氨基酸序列，成功地测定了总共10部分片段的氨基酸序列。
<2>找到与GX高度同源的DNA序列上述测定的氨基酸序列进行DDBJ(日本的DNA数据库)的同源性检索来寻找源于稻谷植物的根且与序列表中的SEQ ID NO4的第8肽片段具有高度同源性的EST R22192A。如此获得的稻谷植物的R22192A很有可能就是编码稻谷植物的GX同源体。然后，以稻谷植物的R22192A作为探针尝试克隆大豆GX。克隆前，进行了研究来寻找能够高表达的大豆器官。
<3>分析大豆中的GX的表达位点作为探针使用的稻谷植物的R22192A cDNA片段是通过下述RT-PCR方法获得的。
R2219.2A cDNA片段通过以稻谷根的多聚(A)RNA为模板的RT-PCR方法来扩增。R2219.2A扩增的引物是作为有意义引物的R2219 2AU(序列表中的SEQ ID NO5)和作为反义引物的R2219 2AD(序列表中的SEQ ID NO6)。扩增区域被发现含有对应于第8肽片段的区域。
在RT-PCR反应中，使用了Takara RNA PCR试剂盒。PCR的反应条件是94℃，5分钟，然后55℃，1分钟和72℃，1分钟进行1个循环；94℃，1分钟，然后55℃，1分钟和72℃，1分钟进行25个循环。
然后，采用上述稻谷植物的R22192A cDNA，进行Northem杂交来确定大豆RNA是否具有与稻谷植物R22192A的DNA同源的序列。
通过采用上述获得的R22192A cDNA进行了从大豆各个器官中提取完整RNA的Northern blotting(Northern点杂交)。所用的大豆器官是发芽后三天和七天的子叶，发芽后七天的芽，未成熟的子叶、豆荚和叶。
在55℃或60℃杂交后，接着采用0.5×SSC，0.1％的SDS、在与杂交温度相同的温度下进行强洗脱，发芽7天后的芽产生清晰的信号。计算出其大小为大约1.5kbp。
基于这一结果得出的结论是，大豆芽具有和稻谷植物R22192A有一些同源性的mRNA，并且它就是非常想得到的GX mRNA。上述试验表明GX cDNA最好通过以稻谷植物R22192A cDNA作为探针、在60℃的杂交条件下，筛选制备于发芽后7天的大豆芽的mRNA的cDNA文库来获得。
<4>以稻谷植物EST作为探针，筛选源于发芽大豆芽的cDNA文库制备于发芽后7天的大豆芽的多聚A RNA的cDNA文库7.2×104pfu通过常规方法，在上述条件下进行筛选来获得7个杂交克隆。测定每个克隆的DNA序列来确定含有SEQ ID NO2的全长GX DNA序列的克隆，其编码含有SEQ IDNO1的487个氨基酸残基并含有SEQ ID NO4的GX内氨基酸序列的多肽。
由于这一DNA序列编码上述测定的GX内氨基酸序列的所有10个区域，所以该DNA序列被认为是目的GX cDNA的DNA序列。然后，采用这一cDNA，通过大肠杆菌生产GX蛋白。
实施例2通过大肠杆菌生产GX将实施例1中获得的GX cDNA组合到能在大肠杆菌表达的表达载体中，对含有该表达质粒的转化体进行培养。检测细胞中的GX的活性。除了获得的GX cDNA的序列外，表达质粒也可制备成这样的质粒，其中考虑到密码子用于大肠杆菌，密码子被改变了从Ala(N端的第二个残基)到Leu(第五个残基)的四个残基，即Ala，Ala，Lys和Leu。它们的表达水平彼此进行了比较。
在这个实施例中，本发明将说明以下几个方面<1>表达质粒的构建，<2>使用该表达质粒来制备大肠杆菌转化体并进行培养，<3>测定GX的活性。
<1>表达质粒的构建；(1)具有未经修饰的GX cDNA序列的表达质粒的构建其转录能在不含色氨酸的培养基中被轻易诱导的trp启动子被用作转录GX基因的启动子。trp启动子被用于能高效表达Pagrus大型转谷氨酰胺酶(TG)基因的质粒pTTG-22(JP-Kokai No.6-225775)。Pagrus大型TG基因的上游序列被设计成适于异源蛋白能在大肠杆菌中高效表达。
高效表达源于微生物的转谷氨酰胺酶(MTG)基因的质粒pUCTRPMTG(+)D2(EP-A-0889133)具有含有Pagrus大型TG的表达质粒的trp启动子的上游序列(SEQ ID NO3)。通过进一步组合到多拷贝质粒pUC19中，MTG能获得高效表达。
通过PCR方法，DNA片段被连接到GX cDNA上游区域的trp启动子上。首先，如
图1所示，通过PCR方法扩增含有MTG表达质粒pUCTRPMTG(+)D2的trp启动子的区域(SEQ ID NO3)和GX cDNA的部分区域。扩增trp启动子的引物是TRP-N2(SEQ ID NO7)和TRP-C2(SEQ ID NO8)；扩增GX的引物是GX-N1(SEQ ID NO9)和GX-C(SEQ ID NO10)；TRP-N2和GX-N1是有意义的引物；TRP-C2和GX-C是反义引物。GX-N1被设计成添加了用于连接GX与trp启动子的11个碱基的DNA序列，其中trp启动子含有片段，即含有GX的上游起始密码。这一序列与TRP-C2中的序列互补。
通过采用质粒pUCTRPMTG(+)D2和引物TRP-N2和TRP-C2；和含有全长GX cDNA的质粒pR2219i和引物GX-N1和GX-C进行PCR反应。PCR反应的条件是94℃、2分钟进行一个循环；和94℃、30秒钟，然后50℃、5秒钟和72℃、30秒钟进行25个循环。PCR产物用酚/氯仿进行处理并用乙醇进行沉淀。每一沉淀物溶解在100μL的dH2O中。
从每一PCR产物中取出等分试样(1μL)并进行混合。在94℃下加热变性10分钟后，采用引物TRP-N2和GX-C进行PCR反应，循环次数为25。每一循环的条件包括94℃、30秒钟，然后55℃、5秒钟和72℃、1分钟。
第二次PCR反应产物通过酚/氯仿进行萃取。用乙醇沉淀后，该产物被EcoRI和KpnI消化，然后被亚克隆到pUC18上来获得pUCTRPGXN1-g(
图1)。序列被确定。
然后，使用KpnI和XbaI切除含在pR2219i中的GX基因的C端区域并将其亚克隆到上述的pUCTRPGXN1-8上来获得由trp启动子启动的GX表达质粒pUCTRPGX1-8(图2)。
(2)具有修饰密码子的GX表达质粒的构建除了使用GX-N2(SEQ ID NO；11)作为通过PCR反应扩增GX cDNA的N端片段的有意义的引物外，质粒以同于上述方法(1)的方法进行构建。在GX-N2中，对应于N端第2个到第5个残基的密码子，即对应于Ala，Ala，Lys和Leu的密码子被从GCG GCG AAG CTA变为GCT GCT AAA CTG。
通过采用质粒pUCTRPMTG(+)D2和引物TRP-N2和TRP-C2；或质粒pR2219i和引物GX-N2和GX-C进行PCR反应。PCR反应的条件是94℃、2分钟进行了一个循环；94℃、30秒钟，然后50℃、5秒钟和72℃、30秒钟进行了25个循环。PCR产物用酚/氯仿进行处理并用乙醇进行沉淀。每一沉淀物溶解在100μL的dH2O中。
从每一PCR产物中取出等分试样(1μL)并进行混合。在94℃加热变性10分钟后，采用引物TRP-N2和GX-C进行PCR反应，循环次数为25。每一循环的条件包括94℃、30秒钟，然后55℃、5秒钟和72℃、1分钟。
第二次PCR反应产物通过酚/氯仿进行萃取。用乙醇沉淀后，该产物被EcoRI和KpnI消化，然后被亚克隆到pUC18上来获得pUCTRPGXN2-1(图3)。序列被确定。
然后，使用KpnI和XbaI切除含在pR2219i中的GX基因的C端区域并将其亚克隆到上述的pUCTRPGXN2-1上来获得由trp启动子启动的GX表达质粒pUCTRPGX2-1(图4)。
<2>使用表达质粒pUCTRPGX2-1制备并培养大肠杆菌转化体通过感受态细胞的方法将pUCTRPGX1-8，pUCTRPGX2-1和pUC19导入大肠杆菌JM109，并在含有150μg/mL氨苄青霉素的琼脂培养基中筛选转化体。被pUCTRPGX2-1转化的大肠杆菌被命名为“AJ13564”并保藏在工业科学技术aqnd Huma-技术机构的生物科学国立研究所(National Institue ofBioscience aqnd Huma-Technology Agency of Institute Science and Technology)中，保藏号为FERM P-17131，根据布达佩斯条约，于2000年2月14日在同一研究所中转为国际保藏，保藏号为FERMBP-7027。将每一转化体接种到含有150μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基中并在37℃下培养5小时。如此获得的1mL预培养液被转移到50mL、含有150μg/mL氨苄青霉素的M9-酪蛋白氨基酸培养基中来进行主培养。主培养在37℃下进行18小时。
完成培养后，通过离心收集的细胞被悬浮在细胞均质缓冲液(50mMTris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA)当中并采用Branson型超声仪-250的芯片(microchips)，在具有输出控制7、忙闲度50％和大约10分钟的条件下进行超声处理。如此获得的液体在12000rpm的条件下离心10分钟。上清液被作为细胞的可溶部分，沉淀被作为不溶部分。SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳后，具有与GX相同分子量的蛋白的表达被确定为是在pUCTRPGX1-8/JM109-可溶部分中，和在pUCTRPGX2-1/JM109-可溶部分和-不溶部分中。其中密码被修饰的pUCTRPGX2-1/JM109-可溶部分被发现具有特别高的表达量。这一事实清楚地表明通过改变密码子而获得的效果。即使在未添加3-β-吲哚丙烯酸的生产培养基中也能获得相当高的表达。
<3>GX活性的测定GX活性是在由于二肽Glu-Glu的水解而增加了游离谷氨酸含量的基础上测定的。将一种酶溶液添加到一种含有50mM的HEPES(PH8.0)和5mM的Glu-Glu的活性测定溶液中。在37℃下反应5到10分钟后，乙酸被加到反应混合物中并且最终浓度达到2％，然后终止反应。游离谷氨酸的量通过谷氨酸分析试剂盒(Seikagaku Kogyo的产品)进行测定。在1分钟内产生1μmol的谷氨酸的活性被定为1个单位。
pUCTRPGX1-8/JM109，pUCTRPGX2-1/JM109和pUC19/JM109可溶部分的GX活性，即，含有细胞碎片的上清液的GX活性，被确定来计算比活性。获得的比活性是pUCTRPGX1-8/JM109的为0.91U/mg，pUCTRPGX2-1/JM109的为2.88U/mg，和pUC19/JM109的为0.04U/mg。因此证实了积累在细胞中的GX蛋白具有活性。还证实了通过修饰密码子，可以积累大约三倍量的GX蛋白。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>编码新氨肽酶的DNA，和生产该氨肽酶的方法<130>0P00010<150>JP 11-68255<151>1999-03-15<160>11<210>1<211>487<212>PRT<213>甘氨酸最大含量(Glycine max)<400>1Met Ala Ala Lys Leu Asp Thr His Ala Val Ala Ser Asp Leu Ile Asp1 5 10 15Phe Leu Asn Ala Ser Pro Thr Ala Phe His Ala Val Asp Glu Ala Lys20 25 30Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Tyr His Gln Leu Ser Glu Arg Glu Val35 40 45Trp Glu Leu Gln Pro Gly Asn Lys Tyr Phe Phe Thr Arg Asn His Ser
50 55 60Thr Ile Val Ala Phe Ala Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ala Gly Asn Gly65 70 75 80Phe Tyr Ile Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Cys Leu Lys Leu Lys85 90 95Pro Val Thr Lys Val Val Lys Ale Gly Ile Leu Glu Val Gly Val Gln100 105 110Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Trp His Thr Trp Phe Asp Arg Asp Leu Thr115 120 125Val Ala Gly Arg Val Ile Val Arg Glu Glu Asn Ala Gly Ser Val Ser130 135 140Tyr Ser His Arg Leu Val Arg Ile Glu Glu Pro Ile Met Arg Ile Pro145 150 155 160Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Lys Thr Val Asn Asp Gly Phe Lys Phe165 170 175Asn Asn Glu Asn His Leu Ile Pro Ile Leu Ala Thr Ser Leu Lys Gly180 185 190Glu Leu Asn Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly Pro Val Glu Ser Gly Asn195 200 205Gln Thr Asp Gly Lys Lys Ala Asn Asp Lys Thr Gly Thr Ser Asn Thr210 215 220Lys His His Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Ala Ser Lys Leu Gly Cys225 230 235 240Glu Pro Asp Asp Ile Cys Asp Phe Glu Leu Gln Ala Cys Asp Thr Gln245 250 255Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ala Ala Lys Glu Phe Ile Phe Ser Gly Arg
260 265 270Leu Asp Asn Leu Cys Met Ser Phe Cys Ser Leu Lys Ala Leu Ile Asp275 280 285Ala Thr Ser Ser Asp Ser Ser Leu Glu Glu Glu Ser Gly Val Arg Met290 295 300Val Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Val Gly Ser Asn Ser Ala Gln Gly305 310 315 320Ala Gly Ser Pro Val Met Leu Asn Ala Val Thr Arg Val Thr Asn Ser325 330 335Phe Ser Ser Asn Pro Asn Leu Leu Glu Lys Ala Ala Gln Leu Ser Tyr340 345 350Leu Val Ser Ala Asp Met Ala His Ala Leu His Pro Asn Tyr Met Asp355 360 365Lys His Glu Ala Asn His Gln Pro Lys Leu His Gly Gly Leu Val Ile370 375 380Lys Thr Asn Ala Sar Gln Arg Tyr Ala Thr Asn Val Val Thr Ser Phe385 390 395 400Ile Phe Arg Glu Ile Ala Ser Lys His Lys Leu Pro Val Gln Asp Phe405 410 415Val Val Arg Asn Asp Met Ser Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Ile Leu420 425 430Ala Ser Gly Val Gly Ile Arg Thr Val Asp Val Gly Ala Pro Gln Leu435 440 445Ser Met His Ser Ile Arg Glu Ile Cys Ala Val Asp Asp Val Lys Tyr450 455 460Ser Tyr Glu His Phe Lys Ala Phe Tyr Gln Glu Phe Ser His Vel Asp465 470 475480Gly Lys Met Val Val Asp Ile485<210>2<211>1657<212>DNA<213>甘氨酸最大含量(Glycine max)<220><221>CDS<222>22..1482<400>2aaaattaaaa tctgaaaaac a atg gcg gcg aag cta gac acc cac gcc gtg 51Met Ala Ala Lys Leu Asp Thr His Ala Val1 5 10gct tcc gat ctg atc gac ttc ctc aac gct tct cca acg gct ttc cac 99Ala Ser Asp Leu Ile Asp Phe Leu Asn Ala Ser Pro Thr Ala Phe His15 20 25gcc gtc gac gag gca aag agg cgt ttg cgt agc gcg ggg tac cac caa 147Ala Val Asp Glu Ala Lys Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Tyr His Gln30 35 40ctc tct gag agg gaa gtg tgg gaa ctg caa ccg ggc aac aag tac ttc 195Leu Ser Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Gln Pro Gly Asn Lys Tyr Phe45 50 55ttc acc aga aat cac tcc acc atc gtc gcc ttc gcc atc ggc aaa aag 243Phe Thr Arg Asn His Ser Thr Ile Val Ala Phe Ala Ile Gly Lys Lys60 65 70tac gtt gct gga aat gga ttc tac ata att ggg gct cac acg gat agt 291Tyr Val Ala Gly Asn Gly Phe Tyr Ile Ile Gly Ala His Thr Asp Ser75 80 85 90cct tgt ctc aaa ctc aag cct gtc acc aag gtt gtt aag gct ggg att 339Pro Cys Leu Lys Leu Lys Pro Val Thr Lys Val Val Lys Ala Gly Ile95 100 105ttg gag gtt ggt gtc caa acc tat gga ggt ggt ctg tgg cac aca tgg 387Leu Glu Val Gly Val Gln Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Trp His Thr Trp110 115 120ttt gat cga gac ttg act gtg gcg ggg agg gtc atc gtg cgg gaa gag 435Phe Asp Arg Asp Leu Thr Val Ala Gly Arg Val Ile Val Arg Glu Glu125 130 135aat gct ggt tct gtt tcg tac tca cat cgc ctt gtt aga att gag gaa 483Asn Ala Gly Ser Val Ser Tyr Ser His Arg Leu Val Arg Ile Glu Glu140 145 150cot ata atg cga ata ccg act ttg gca att cac ttg gac aag act gtt 531Pro Ile Met Arg Ile Pro Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Lys Thr Val155 160 165 170aat gat gga ttc aaa ttt aac aac gag aat cac ctt att ccc atc ttg 579Asn Asp Gly Phe Lys Phe Asn Asn Glu Asn His Leu Ile Pro Ile Leu175 180 185gca aca tcg ctg aag ggt gag ctc aat aaa gtg tcc tct gaa aat ggt 627Ala Thr Ser Leu Lys Gly Glu Leu Asn Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly
190 195 200cct gtt gaa agt gga aat cag acc gat gga aag aaa gca aat gat aaa 675Pro Val Glu Ser Gly Asn Gln Thr Asp Gly Lys Lys Ala Asn Asp Lys205 210 215aca ggc acc agc aat acg aag cat cac ctt ctt ctt cta cag ttg ctt 723Thr Gly Thr Ser Asn Thr Lys His His Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu220 225 230gca agc aag ctt ggg tgt gaa cca gat gac ata tgt gat ttt gaa ttg 771Ala Ser Lys Leu Gly Cys Glu Pro Asp Asp Ile Cys Asp Phe Glu Leu235 240 245 250caa gct tgc gat aca caa cca agt act att gct gga gct gca aag gaa 819Gln Ala Cys Asp Thr Gln Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ala Ala Lys Glu255 260 265ttc att ttt tca gga cgg ctt gat aat ctc tgc atg tca ttt tgc tcg 867Phe Ile Phe Ser Gly Arg Leu Asp Asn Leu Cys Met Ser Phe Cys Ser270 275 280ctg aag gca tta ata gat gct aca tct tct gac agc agt ctt gag gaa 915Leu Lys Ala Leu Ile Asp Ala Thr Ser Ser Asp Ser Ser Leu Glu Glu285 290 295gag tca ggt gtt aga atg gtg gct tta ttt gac cat gag gaa gtt gga 963Glu Ser Gly Val Arg Met Val Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Val Gly300 305 310tct aac tct gcc caa gga gct ggc tct cct gtt atg cta aat gct gtg1011Ser Asn Ser Ala Gln Gly Ala Gly Ser Pro Val Met Leu Asn Ala Val315 320 325 330act agg gtt acc aat tcc ttc agc tcc aat ccc aac ctt ctg gag aaa1059Thr Arg Val Thr Asn Ser Phe Ser Ser Asn Pro Asn Leu Leu Glu Lys335 340 345gca gca caa tta agc tac ctt gta tct gcc gac atg gca cat gca cta1107Ala Ala Gln Leu Ser Tyr Leu Val Ser Ala Asp Met Ala His Ala Leu350 355 360cac cca aat tac atg gac aag cat gaa gca aac cat cag ccc aaa cta1155His Pro Asn Tyr Met Asp Lys His Glu Ala Asn His Gln Pro Lys Leu365 370 375cat gga gga ctt gtc att aaa acc aat gca agc caa cgc tat gca acc1203His Gly Gly Leu Val Ile Lys Thr Asn Ala Ser Gln Arg Tyr Ala Thr380 385 390aat gtt gtc aca tcc ttc ata ttc agg gag ata gca tca aaa cat aaa1251Asn Val Val Thr Ser Phe Ile Phe Arg Glu Ile Ala Ser Lys His Lys395 400 405 410ctt ccc gtt cag gac ttt gtg gtg cgc aat gac atg tea tgt ggt tca1299Leu Pro Val Gln Asp Phe Val Val Arg Asn Asp Met Ser Cys Gly Ser415 420 425acc att ggt cct att ctt gct agt ggc gta ggt att cgc act gtt gat1347Thr Ile Gly Pro Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Arg Thr Val Asp430 435 440gta ggt gca ccg cag ttg tca etg cat agc ata cga gaa att tgt gct1395Val Gly Ala Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile Arg Glu Ile Cys Ala445 450 455gtt gat gat gtg aag tat tca tat gag cac ttc aaa gca ttt tac caa1443Val Asp Asp Val Lys Tyr Ser Tyr Glu His Phe Lys Ala Phe Tyr Gln460 465 470gaa ttc tct cat gtt gat ggt aag atg gtc gtg gat ata tag gaatatctc 1494Glu Phe Ser His Val Asp Gly Lys Met Val Val Asp Ile475 480 485taatcacgaa atcctcatta atcctttgct ctagaagctg ttgctgaaat ggtcgtgttt 1554cgtaatttag taccattata atgccgacgt tattatgatg aaattttcaa taaaattaga 1614ctccctgaat gaaatattag caactaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1657<210>3<211>357<212>DNA<213>人工序列<220><221>启动子<222>0..357<400>3cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccgc ttcattaatg cagctggcac 60gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 120actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg atcgtatgtt gtgtggaatt 180gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca 240tgcctgcagg tcgccctttc gtcttcaaga attcccctgt tgacaattaa tcatcgaact 300agttaactag tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgat tagtaaggag gtttaaa 357<210>4<211>20<212>PRT<213>甘氨酸最大含量(Glycine max)<400>4Ser Ala Gly Tyr His Gln Leu Ser Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Gln Pro Gly1 5 10 15Asn Lys20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5ctacacctga ctcatcgatc cacta25<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6caggcttgag cttcagggat ggact25<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>7cgcccaatac gcaaaccgcc 20<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>8tttaaacctc cttactaatc gataccc 27<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>9ggaggtttaa aatggcggcg aagctagaca cc32<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>10gttgcagttc ccacaattcc c21<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>11ggaggtttaa aatggctgct aaactggaca cc 3权利要求
1.一种编码源于发芽大豆子叶且具有SEQ ID NO1氨基酸序列的氨肽酶的DNA分子。
2.一种编码源于发芽大豆子叶且具有SEQ ID NO1氨基酸序列的氨肽酶的变异体的DNA分子，其中SEQ ID NO1氨基酸序列中插入、增加、删除或取代了一个或多个氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其具有SEQ ID NO2的第22到第1482个核苷酸序列。
4.一种在严格条件下能与具有SEQ ID NO2序列的DNA分子杂交并编码具有氨肽酶活性的蛋白的DNA分子。
5.如权利要求1所述的DNA分子，其中密码子的应用被优化到适用于大肠杆菌。
6.如权利要求5所述的DNA分子，其中Ala2-Ala3-Lys4-Leu5的密码子是GCTGCTAAACTG。
7.含有权利要求1的DNA分子的重组DNA分子。
8.含有权利要求2的DNA分子的重组DNA分子。
9.含有权利要求4的DNA分子的重组DNA分子。
10.如权利要求7所述的重组DNA分子，其为高效表达载体。
11.如权利要求7所述的重组DNA分子，其中trp启动子被功能性地连接到权利要求1所述的DNA分子上。
12.如权利要求7所述的重组DNA分子，其为高拷贝载体。
13.被权利要求1所述的DNA分子转化了的宿主。
14.如权利要求13所述的转化宿主，其为原核生物。
15.如权利要求13所述的转化宿主，其为真核生物。
16.如权利要求14所述的转化宿主，其为大肠杆菌。
17.被权利要求5所述的DNA分子转化了的大肠杆菌细胞。
18.如权利要求17所述的大肠杆菌细胞，其保藏号为FERM BP-7027。
19.生产具有氨肽酶活性的蛋白的方法，其包括步骤(i)培养权利要求13所述的转化宿主，(ii)表达具有氨肽酶活性的蛋白，和(iii)回收蛋白。
全文摘要
公开了编码源于发芽大豆的新的氨肽酶的cDNA,含有该DNA的重组表达载体,通过采用该表达载体进行转化所获得的转化体,和通过培养转化产物生产氨肽酶的方法。
文档编号C12N15/57GK1270224SQ00108358
公开日2000年10月18日 申请日期2000年3月15日 优先权日1999年3月15日
发明者二宫大记, 三轮哲也, 浅野皆夫, 中村奈巳, 丹尾式希 申请人:味之素株式会社