用于目的蛋白可溶性表达的载体的制作方法

专利名称：用于目的蛋白可溶性表达的载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及可实现目的蛋白可溶性表达的表达载体，特别是包含分别表达一种含二硫键氧化还原蛋白和目的蛋白的双顺反子的表达载体；还涉及用该载体转化的宿主细胞，特别是原核生物细胞，及利用所述载体或宿主细胞生产目的蛋白的方法。
许多肽或蛋白可利用各种表达系统重组产生，如各种细菌、真菌、哺乳动物或昆虫细胞。但当用细菌作为外源基因表达的宿主细胞时，常存在一些问题。例如外源蛋白在细菌细胞中表达时常见到包涵体的形成，因为许多治疗有用的蛋白的稳定天然状态需要二硫键交联等，而在细菌胞浆中不存在这种稳定化影响。这些包涵体常需要进一步处理以使外源蛋白溶解和再折叠，处理条件要根据经验确定，对于不同的情形有不确定性。如果这些处理步骤不成功则从宿主细胞回收的生物活性蛋白量少甚至得不到。而且，这些处理方法常常是技术上困难的，经济上昂贵的，不能用于治疗、诊断或其他研究用重组蛋白的实际生产。
为了克服这一问题，现有技术中已提出将目的蛋白与“伴侣蛋白“连结形成融合蛋白的方法。其中比较成功地达到可溶表达的是利用硫氧还蛋白作为伴侣蛋白进行的融合表达，见LaVallie ER、DiBlasio EA、Kovacic S等，“克服了大肠杆菌胞浆中包涵件形成的一种硫氧还蛋白基因融合表达系统”，BIO/TECHNOLOGY，1993，Vol.11187-193。他们利用载体pTRXFUS以与硫氧还蛋白的融合蛋白形式表达了IL-3、IL-6、IL-11等，发现这些原本在大肠杆菌中以包涵体形式存在的外源蛋白均能以可溶性的形式存在。
但融合蛋白方法的缺点是需要后续的融合蛋白裂解等处理步骤，才能得到真正的目的蛋白。因而长期以来本领域一直需要一种克服这种缺点的目的蛋白可溶性表达的方法和载体。
因而本发明的目的是提供一种可实现目的蛋白本身直接的可溶性表达的方法和载体，并且发现利用一种双顺反子载体可达到这一目的，其中第一个顺反子表达一种含二硫键氧化还原酶(特别是硫氧还蛋白)，第二个顺反子表达目的蛋白。
本发明涉及一种用于在细菌宿主中产生可溶性目的蛋白的表达载体，其以5′至3′方向含有下列元件(i)启动子；(ii)含有编码一种含二硫键氧化还原酶之基因的第一顺反子，该顺反子在含二硫键氧化还原酶N-末端氨基酸的密码子紧上游含有转录起始信号，在含二硫键氧化还原酶C-未端氨基酸的密码子下游含有转录终止信号；(iii)含有编码目的蛋白之基因的第二顺反子，该顺反子在目的蛋白N-末端氨基酸密码子紧上游含有起始信号，在目的蛋白C-末端氨基酸密码子下游含有转录终止信号；其中启动子与第一顺反子可操作地连接，所述载体在含二硫键氧化还原酶N-末端氨基酸密码子的上游含有第一个SD序列，在目的蛋白N-末端氨基酸密码子上游含有第二个SD序列，所述载体是可选择的、在细菌宿主中是可以自主复制的。
本发明还涉及含有上述载体的转化的细菌宿主，特别是大肠杆菌。
本发明还涉及一种制备可溶性蛋白的方法，该方法包括用上述表达载体转化一种细菌宿主细胞，在适于表达的条件下培养上述转化的细菌细胞，然后收集细菌，及从破碎细菌后所得上清液回收目的蛋白。
如上所述，本发明提供了一种供目的蛋白溶性表达的含有双顺反子结构的载体，其中第一个顺反子含有一种含二硫键氧化还原酶的编码基因，第二个顺反子含有目的蛋白的编码基因。
本发明所述的含二硫键氧化还原酶是指能够催化二硫键的形成、调节细胞中氧化还原环境以利于硫醇二硫键交换的具有保守活性位点序列的含有二硫键的氧化还原蛋白。具体例子包括蛋白二硫键异构酶、硫氧还蛋白和glutaredoxin等(Loferer，H.(1995)J.Biol.Chem.27026178-26183)。这些蛋白在功能上有些差异，但都可用于本发明的目的，并且它们普遍分布于真核细胞和原核细胞中。例如蛋白二硫键异构酶见于真核细胞的内质网中和原核细胞的周质空间内。它们可以用自身的二硫键交换折叠肽链中的硫醇。本发明优选使用硫氧还蛋白基因。所述硫氧还蛋白基因可以是分离自大肠杆菌的(Laurent，T.C.等，J.Biol.Chem.239，1964，3436-3445)或分离自其他来源，如酵母(Porque G.P.等，J.Biol，Chem，245，1970，2362-2379)、蓝细菌(GleasonF.K.等于“硫氧还酶、结构和功能”[P.Gadal编]，1983，Editions du CentreNational de la Recherche Scientifique)、大鼠(Guerara J.等，1983，同上)、T4噬菌体(Soderberg，B，O等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1978，5827-5830)。还可以预期使用保留氧化还原活性位点的硫氧还蛋白衍生物或片段，所述活性位点为Cys-X-Y-Cys-Lys，其中X和Y独立地为20种氨基酸中的任一种。对于大肠杆菌硫氧还蛋白，氧化还原活性肽序列为Cys-Gly-Pro-Cys-Lys。还可以设想使用具有催化二硫键形成能力的硫氧还蛋白模拟肽，可以是天然来源的，也可以是合成的。本发明所用的含二硫键氧化还原蛋白基因的克隆、衍生物或片段基因的生成(如酶切、诱变等)、甚至肽或蛋白的化学合成相信在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明优选使用大肠杆菌的硫氧还蛋白基因。
可利用本发明载体或方法进行可溶性的目的蛋白可以是任何具有二硫键交联的蛋白。具体实例可举出胰岛素、溶菌酶、干扰素、肾素、催乳素、纤溶酶原活化物、人α-1胰蛋白酶抑制物、凝血因子vIII、各种细胞因子及其受体如IL-6和IL-6R或它们的片段等等。这些蛋白的缩码基因可以是已知的，可从公众可得的载体中直接获得或者从生物体细胞中克隆而得。
对本发明载体中的启动子没有特别的限制，只要在所选择的细菌宿主中有功能即可。非限制性地可以举出色氨酸操纵子启动子、λpL启动子等。
本发明含双顺反子结构的载体可以按本领域的常规方法构建。关于双顺反子构建的一般描述见Schoner等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.815403-5407和Schoner等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.838506-8510.BioTechniques 20346-350(1996年3月)中描述了利用顺反子表达载体在大肠杆菌中进行蛋白表达的实验。
本发明的载体可以从任何在细菌宿主(尤其是大肠杆菌)中可自主复制的载体构建而得，优选质粒载体。为了便于选择转化子，该载体应含有选择标志如β-半乳糖苷酶基因，各种抗菌素抗性基因，如氨苄青毒素抗性。含有选择性标志和适当启动子的起始载体是已知的，可以经商业渠道购得，或从这些已知的载体容易地构建而成。可用于本发明质粒构建的一个方便的起始载体是pTRXFUS，其构建方法见Bio/Technology vol.11，1993年2月，187-192。该质粒是基于pUC-18构建的，含有ColE复制起始区，作为选择标志的β-半乳糖苷酶基因和位于大肠杆菌硫氧还蛋白(trxA)基因上游的噬菌体λpL启动子。在trxA的3′-末端有一个编码如下接头肽的DNA序列“-GSGSGDDDDK-”。在该载体再下游有一个含限制性位点的多接头DNA序列和大肠杆菌天冬氨酸氨基转移酶转录终止子序列。有利的是，在该质粒中已预先插入了大肠杆菌硫氧还蛋白基因trxA，该质粒的图谱见


图1。
作为实例，本发明构建了质粒pZD2，其构建方法详见实施例和图2中所示。表达载体pZD2中第一个顺反子编码大肠杆菌硫氧还蛋白，而插入的外源基因将构成第二个顺反子。在该表达载体上可被利用的克隆位点有NdeI、NheI、BamRI、SalI和PstI。当利用NdeI位点克隆外源其因时，第二个顺反子将只表达所插入的外源基因；而当利用其余酶切位点克隆外源基因时，第二个顺反子可以实现目的基因与φ10蛋白部分序列(前11个氨基酸)的融合表达。在后一情形中，所表达融合蛋白的φ10蛋白部分可用于蛋白的纯化。另外，表达载体pZD2中保留了原始载体pTRXFUS中的KpnI位点和肠肽激酶切点，因而保留了原始载体可融合表达外源基因的特性。这些特点使该表达载体具有特别的使用灵活性。
在表达载体pZD2的构建过程中还得到了另一表达载体pZD1。与pZD2相比基本相同，只是在第二个顺反子的BamHI位点上增加了编码IR-6Rα的BamHI/XbaI片段(约700bp)。换句话说，pZD1相当于在pZD2表达载体中克隆了外源基因IL-6Rα编码序列。在pZD1转化大肠杆菌GI724后，将转化子培养并用色氨酸诱导，破菌后从上清液中(可溶部分)观察到了硫氧还蛋白(约13kD)和带有φ10蛋白头11个氨基酸的IL-6Rα(约19KD)的表达。即实现了硫氧还蛋白与IL-6Rα的非融合表达。在该表达载体中，第一个顺反子表达大肠杆菌硫氧还蛋白，第二个顺反子表达带有φ10头11个氨基酸的IL-6Rα。当然本领域技术人员可以看出，若将IL-6Rα基因克隆在pZD2的NdeI位点，则第二个顺反子只编码IL-6Rα，可实现不含φ10蛋白的片段的IL-6Rα的可溶性表达。
同样，在pZD2的BamHI位点克隆来自质粒pBV-DL6的IL-6cDNA片段，得到了本发明的另一表达载体pZD-IL-6。同样，该表达载体的第一个顺反子编码大肠杆菌硫氧还蛋白，而第二个顺反子编码N端带有φ10蛋白头11个氨基酸的N端缺失的约17.5kD的IL-6。转化大肠杆菌后，经诱导培养，几乎只在破菌离心的上清液中发现IL-6的表达，即为17.5kD的蛋白。
在上述构建的表达载体中，启动子、第一个顺反子的SD序列、硫氧还蛋白基因的转录起始信号和编码基因均含于原始表达载体pTRXFUS中。
在上述构建的表达载体中，包括第二个顺反子的SD序列、第一个顺反子的转录终止信号和第二个顺反子的起始信号的第一和第二顺反子的连接关系如下
其中A＝第二顺反子的SD序列B＝第一顺反子的终止信号C＝NdeI位点，含第二顺反子的起始信号ATG。
箭头表示肠肽激酶切点。
可以看出，第二顺反子的SD序列位于第二顺反子的起始信号的上游，但不一定在第一顺反子的终止信号的下游，也可以在其上游。还可以设想，SD序列与起始信号可能相重叠。
在上述构建的表达载体中含有用于转化子挑选的选择标志，如氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、卡那霉素抗性基因等。
可按常规方法将本发明的表达载体转化到细菌宿主中，特别是大肠杆菌细胞中，如Kushner法。当转化子在适合细菌生长和蛋白表达的条件下培养一定时间后，编码含二硫键氧化还原蛋白和目的蛋白的基因被分别表达，产生可溶性目的蛋白。优选的培养方法是本领域技术人员熟知的。大肠杆菌一般在含可利用碳源和氮源的营养基中在通气条件下进行，如振荡培养或深层培养。培养基中优选的碳源如包括葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和淀粉等，也可以包括木糖、半乳糖、麦芽糖等。优选的氮源包括如酵母提取物、蛋白胨、棉籽粉、大豆粉、玉米浸液等，也可以在培养其中加入无机或有机氮化合物，如硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、脲和氨基酸等。必要时可以向培养基中加入无机盐，如碳酸氢钾、磷酸钠或钾、氯化钠或钾及镁盐、铜盐等。按常规方法混合培养基后，接种转化子并在20-42℃，优选在35-38℃下培养几小时到几十个小时，例如2-60小时。适当时，在培养过程中加入表达诱导物以诱导表达，如色氨酸等。
所表达的目的蛋白一般以可溶的形式保留在转化子的胞浆中。可按常规方法从培养物中回收目的蛋白。一般通过过滤或离心收集细菌，然后通过真空浓缩或超声处理将细菌细胞破碎。然后例如离心收集上清液。可按常规方法从上清液分离纯化目的蛋白，例如HPLC、冷冻干燥、调节pH、离子交换树脂吸附、吸附剂(如硅胶、氧化铝、纤维素)上的吸附、凝胶过滤及亲和层析等。对于与φ10蛋白融合表达的目的蛋白，可利用偶联有抗φ10蛋白抗体的亲和柱层析分离。
下面以详细的实施例进一步说明本发明，其中引用了下列附图
图1.表达载体pTRXFUS示意2.表达载体pZD1和pZD2及其构建过程trxA为大肠杆菌硫氧还蛋白；SD代表第二顺反子的核糖体结合位点；φ10代表噬体φ10蛋白的前11个氨基酸；Amp表示氨苄青霉素抗性；Ori表示ColEl复制起点；pL表示λ噬菌体左向启动子。
图3.SDS-PAGE分析IL-6Rα片段的表达1，分子量标准物；2，5为超声破碎后的沉淀；3，6为超声破碎后的上清；4，7为全菌体裂解物；8为对照菌裂解物。
图4.SDS-PAGE分析IL-6的表达1，对照菌全菌体裂解物；2，菌体超声破碎后上清；3，为全菌裂解物；4，为蛋白分子量标准物。
实施例1.pZD1的构建(1)含部分双顺反子表达元件的DNA片段的获得以质粒pET-6R(B)(按段聚宝等，Science in China(Series B)Vol.38 No.1(1995)，p1321-1331描述的方法构建)为模板进行PCR扩增获得。PCR所用引物如下上游引物序列为5′-GGGTACCAAGGAGTAACATATGGCTAGCATGACT-3′，含有KpnI酶切位点、第2个顺反子的SD序列、第1个顺反子的终止密码子和第2个顺反子的起始密码子，其3′端与ET-6R(B)的φ10蛋白部分序列互补；下游引物序列为5′-CGGGATCCATTACTCAGCTGGAG-3′，含有BamHI位点，对应于hIL-6R的第958-972bp序列。PCR采用以下参数94度变性40秒，52度退火30秒，72度延伸40秒，最后一个循环72度延长7分钟。PCR产物经电泳鉴定后，用酚/氯仿抽提一次，沉淀干燥，溶于ddH2O中。
(2)(1)中获得的片段用KpnI和EcoRV酶切，得到处理过的双顺反子表达元件；含有翻译终止并可有效再起始的表达元件，同时为了引入φ10蛋白的部分序列供融合表达；(3)载体的处理以载体pTRXFUS(Invitrogen)为起始载体，用Ndel进行酶切，以破坏此NdeI位点。Klenow酶补平后，再用T4DNA连接酶连接。得到修饰的载体pTRXFUS(-)。再用BamHI酶切，补平后再用KpnI酶切。
(4)步骤(3)所得载体与(2)所得片段连接，得到了带有IL-6Rα片段的双顺反子表达载体pZD1，此载体已含有供非融合可溶性表达所需的元件-硫氧还蛋白和双顺反子元件；同时可以用于检测IL-6R的表达。
实施例2.pZD2的构建pZD1经BamHI和XbaI酶切处理，去除IL-6R片段；然后补平，用T4DNA连接酶连接便得到了最终的双顺反子表达载体pZD2。其中第一个顺反子编码大肠杆菌硫氧还蛋白，而插入的外源基因将构成第二个顺反子。表达载体pZD2上可被利用的克隆位点(单酶切位点)有NdeI、NheI、BamHI、SalI和PstI。其中NdeI位点可用于完全非融合表达，而其余酶切位点则供目的基因与φ10蛋白部分序列的融合表达。而且此表达载体中保留了原始载体pTRXFUS中的KpnI位点与肠肽激酶(Enterokinase)切点，因而保留了原始载体可融合表达外源基因的特性。pZD2中这些单克隆位点均为酶切鉴定所证实。
实施例3.pZD-IL6的构建将pZD2用BamHI酶切，补平后再用SalI酶切。然后，从pBV-DL6(按任启生等，中国免疫学杂志，1992，8(3)1中描述的方法构建)上用EcoRI和SalI切下IL-6 cDNA片段，与经过上述处理的pZD2连接。得到pZD-IL-6。转化宿主大肠杆菌K12菌株GI724(ATCC55151)，挑选重组菌落，提取质粒DNA进行酶切鉴定。
实例例4.IL-6R的可溶性表达及检测将含有pZD1(携有IL-6R的片段)的大肠杆菌GI724接种至IMC培养液中(M9培养液加上0.5％葡萄糖，0.2％酪蛋白水解氨基酸和100μg/ml的氨苄青霉素)。30℃摇菌至OD≈0.5时，加入色氨酸(浓度为100ug/ml)，诱导表达4.5小时。取1.5ml诱导表达菌液，离心收菌，加入400ulTE悬浮菌体。超声破碎5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟。取20ul上清，加入等体积的2倍载样缓冲液；沉淀悬浮于50ulTE中，加入等体积的2倍载样缓冲液。在15％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。判断表达产物是否呈可溶性状态。结果表明，与含有pTRXFUS的对照相比，在约19KD处有特异的蛋白条带，而且均存在于菌体破碎后的上清中，说明表达产物IL-6R受体的片段是以可溶性形式存在的，而且实现了与硫氧还蛋白(约13KD)的非融合表达。
实施例5.IL-6的可溶性表达及检测
将含有表达质粒pZD-IL-6的大肠杆菌GI724接种至IMC培养液中(M9培养液加上0.5％葡萄糖，0.2％酪蛋白水解氨基酸和100μg/ml的氨苄青霉素)。30℃摇菌至OD≈0.5时，加入色氨酸(浓度为100ug/ml)，诱导表达4.5小时。取1.5ml诱导表达菌液，离心收菌，加入400ulTE悬浮菌体。超声破碎5分钟，4℃，12000rpm离心10分钟。取20ul上清，加入等体积的2倍载样缓冲液；沉淀悬浮于50ul TE中，加入等体积的2倍载样缓冲液。在15％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。判断表达产物是否呈可溶性状态。结果表明，与未含有pTRXFUS的对照相比，在约17KD处有一特异蛋白条带，与IL-6的预期分子量一致，而且此条带完全存在于菌体破碎后的上清中，说明IL-6是可溶性表达。
权利要求
1.一种用于在细菌宿主中产生可溶性目的蛋白的表达载体，其以5′至3′方向含有下列元件(i)启动子；(ii)含有编码一种含二硫键氧化还原酶之基因的第一顺反子，该顺反子在含二硫键氧化还原酶N-末端氨基酸的密码子紧上游含有转录起始信号，在含二硫键氧化还原酶C-末端氨基酸的密码子下游含有转录终止信号；(iii)含有编码目的蛋白之基因的第二顺反子，该顺反子在目的蛋白N-末端氨基酸密码子紧上游含有起始信号，在目的蛋白C-末端氨基酸密码子下游含有转录终止信号；其中启动子与第一顺反子可操作地连接，所述载体在含二硫氧化还原酶N-末端氨基酸密码子的上游含有第一个SD序列，在目的蛋白N-末端氨基酸密码子上游含有第二个SD序列，所述载体是可选择的、在细菌宿主中是可以自主复制的。
2.根据权利要求1的表达载体，其中所述含二硫键氧化还原酶是蛋白二硫键异构酶、硫氧还蛋白或glutaredoxin。
3.根据权利要求2的表达载休，其中所述含二硫键氧化还原酶是一种硫氧还蛋白。
4.根据权利要求3的表达载体，其中所述硫氧还蛋白是大肠杆菌硫氧还蛋白。
5.根据权利要求1的表达载体，其中目的蛋白是具有二硫键交联的蛋白。
6.根据权利要求5的表达载体，其中目的蛋白选自胰岛素、溶菌酶、干扰素、肾素、催乳素、纤溶酶原活化物、人α-1胰蛋白酶抑制物、凝血因子VIII、各种细胞因子和其受体或它们的片段。
7.根据权利要求1的表达载体，其中启动子为λ噬菌体左向启动子。
8.根据权利要求1的表达载体，其中该载体为一种质粒载体。
9.根据权利要求1的表达载体，其中第二个顺反子的SD序列在第一个顺反子的终止密码子的上游。
10.根据权利要求8的表达载体，其中在第一和第二顺反子的接头处含有以下序列AAGGAGTAACATATG。
11.根据权利要求1-9之一的表达载体，其选自载体pZD1、pZD2和pZD-IL6。
12.用权利要求1-10之一的表达载体转化的宿主细胞。
13.根据权利要求11的宿主细胞，其为一种细菌宿主。
14.根据权利要求12的宿主细胞，其为一种大肠杆菌宿主。
15.一种制备可溶性蛋白的方法，其包括用权利要求1-10之一的表达载体转化一种细菌宿主细胞，在适于表达的条件下培养所得的转化的细菌细胞，然后收集细菌，并从破碎细菌后所得上清液中回收目的蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种可实现目的蛋白可溶性表达的表达载体,其包括分别表达一种含二硫键氧化还原蛋白和目的蛋白的双顺反子结构,用该表达载体转化的宿主细胞及利用所述载体或宿主细胞生产目的蛋白的方法。
文档编号C12N15/61GK1271777SQ0010874
公开日2000年11月1日 申请日期2000年6月2日 优先权日2000年6月2日
发明者段聚宝, 邹民吉, 王嘉玺, 蔡欣 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所