Rim2蛋白的制作方法

专利名称：Rim2蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及Rim2蛋白，它是Rim的一种新的同种型，即该蛋白能与低分子量G蛋白Rab3相互作用，并提出它起着Rab3依赖性突触小泡融合调节剂作用，并且与GDP／GTP交换因子(GEFII；一种cAMP传感物)起特异性相互作用。更具体地说，本发明涉及胞内小泡运输和分泌机制的阐述，涉及可用来诊断与内分泌有关的疾病或神经病并能用来开发预防和治疗这些疾病的制剂的新的Rim2蛋白，编码Rim2的基因以及针对Rim2蛋白的抗体。
Rim2被认为是小泡融合的调控因子。在本发明期间发现该蛋白主要表达在内分泌组织和内分泌细胞系和神经内分泌衍生的细胞系中。认为GTP／Rab3／GEFII／Rim复合物以依赖于cAMP和不依赖于蛋白激酶A(PKA)的方式，参与神经元和内分泌细胞胞吐作用的调节。
具有单位膜闭合结构的细胞器(例如内质网)之间的物质运输通过胞内小泡运输来进行。在内分泌细胞(包括胰β细胞和垂体细胞)中，内质网收到核糖体处合成的肽／蛋白质，这些物质以小泡形式从内质网运输，这些小泡通过高尔基体转化成分泌性小泡并运输至细胞膜，通过与细胞膜融合的步骤被释放出细胞。在神经元中，突触小泡的含神经递质的前体在高尔基体中形成，通过微管沿轴突运输，并储藏在突触中。突触前膜的去极化引起小泡与突触前膜融合，从而释放出神经递质。基于小泡与细胞膜融合的这种分泌作用称为胞吐作用。
相反，当胞外物质如激素(包括细胞生长因子)与细胞膜结合后，形成的复合物内陷入细胞中形成内体。这种摄取环境物质的作用称为胞吞作用。
小泡的形成，例如通过出芽(通常见于胞吐和胞吞中)、对接和融合(在它们的运输和与其它膜系统结合过程中所观察到的现象)，受GTP-结合的低分子量蛋白(称为G蛋白)的调节。30种以上的此类蛋白是已知的。也归类于Rab家族的此组蛋白调节着胞内小泡运输系统。
关于胞内小泡运输系统，目前已经知道，当Rab蛋白以结合鸟嘌呤核苷酸二磷酸(GDP)形式出现时，细胞处于休眠状态，由于具有GEF活性的蛋白作用于Rab蛋白并将其转变成结合GTP的Rab蛋白，GTP与该蛋白结合形成GTP-Rab复合物，进而再结合于膜上对应的靶蛋白，结果引起出芽、对接和融合。
刺激-分泌的偶联在包括神经元和内分泌细胞的许多细胞类型中所见的胞吐中起重要作用[J．E．Rothman，Nature 37255(1994)；T．C．Sudhof，Nature 375645(1995)]尽管胞内Ca2+浓度的升高在胞吐的调节中很重要，但是也知道其它信号起着重要的作用。已知cAMP(环腺苷酸-3′，5′-单磷酸)／PKA(依赖于cAMP的蛋白激酶A)信号传导通道调节许多神经元、神经内分泌细胞和内分泌细胞中的胞吐作用。尤其是，认为cAMP通过增加脑中的神经递质释放来介导长期强化[R．D．Hawkins等人Ann．Rev．Neurosci．16625(1993)；G．Lonart等人，Neuron 211141(1998)]。cAMP还调节导致胰β细胞释放胰岛素以及腮腺腺泡细胞释放淀粉酶的胞吐作用[P．M．Jones和S．J．Persaud，Endocrine．Rev．19429(1998)；E．Renstrom，等人，J．Physiol．502105(1997)；K．Yoshimura，Biochim．Biophys．Acta 1402171(1998)]。
除了在与胞吐过程有关的调控蛋白的依赖于PKA的磷酸化中的作用外，已知cAMP还直接作用于神经元和非神经元细胞中的胞吐机制[G．Lonart等人，Neuron211141(1998)；E．Renstrom等人，J．Physiol．502105(1997)；K．Yoshimura，Biochim．Biophys．Acta 1402171(1998)]。
在用酵母双杂交筛选(即一种用来检测酵母细胞中两个蛋白之间相互作用的方法)搜索直接偶联磺酰脲受体的胞内信号传导分子(胰β细胞ATP-敏感性K+(KATP)通道的一个组分[N．Inagaki等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91，2679(1994)])期间，鉴定到一个cAMP传感蛋白(称为“CAMPS”)，发现该蛋白有两个推定的cAMP结合结构域，一个普雷克底物蛋白(Pleckstrin)同源结构域(PH结构域)，以及一个鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)同源结构域。
在此研究期间，两个研究小组独立地报道了激活Rap1(小G结合蛋白的一个成员)的cAMP结合蛋白[J．de Rooiji等人，Nature 396474(1998)；H．Kawasaki等人，Science 2822275(1998)]，并且偶然揭示CAMPS是cAMP-GEFII的小鼠同系物[H．Kawasaki等人，Science 2822275(1998)]。
尽管胞内小泡运输系统的机制已经逐渐被阐明，但是它们的大部分仍是未知的。为了理解该机制，需要有进一步的进展，以便为涉及神经元和内分泌细胞的各种疾病提供诊断剂或治疗剂。
与以前cAMP-GEFII中仅有一个cAMP结合结构域的提法不同，本发明者的研究提示，根据cAMP-GEFII序列和PKA的调控亚基的序列对比，它存在两个推定的cAMP结合结构域(cAMP-A和cAMP-B)。


图1显示了cAMP结合结构域的序列对比。图中示出了cAMP-GEFII的cAMP结合结构域A和B(分别为cAMP-A和cAMP-B)以及PKA调控亚基Iα的cAMP结合结构域A和B(分别为RIα-A和RIα-B)。不同cAMP-结合结构域中的不变的残基用黑框表示。
如图2所示，谷胱苷肽-S-转移酶(GST)-cAMP-A融合蛋白以约10μM的解离常数(Kd)与[3H]cAMP结合，而[3H]cAMP与GST-cAMP-B融合蛋白的结合在相同条件下却不明显。
图2显示了cAMP与cAMP-A的结合。将GST-cAMP-A(实心圆圈)或GST-PKARIα(空心圆圈)与不同浓度的[3H]cAMP(0至50μM)一起培育。cAMP-A或PKA RIα的数据相对于最大的cAMP结合活性作标准化。cAMP和PKA RIα的Kd数值分别为10．0±2．3μM和23．7±0．6nM。
在cAMP-B结构域中，最初为谷氨酸(Glu)的氨基酸残基423被赖氨酸(Lys)代替。该谷氨酸残基对于cAMP结合是很重要的。考虑到具有等效突变(E-200-K)的PKA调节亚基比野生型的解离更迅速，因此cAMP-B也可能迅速地解离cAMP。因此，cAMP可能能与cAMP-B结构域结合。
由于CAMPUS的靶分子cAMP-GEFII的鉴定起着显示其生理作用的作用，因此本发明者试图利用在MIN6 cDNA文库上的酵母双杂交筛选(YTH)方法来寻找与cAMP-GEFII相互作用的分子(见“用YTH方法鉴定相互作用的分子”)。
本发明者惊奇地发现cAMP-GEFII能与Rim(一种与Rab3特异性相互作用的分子，即Rab3-相互作用型分子；后称“Rim1”)的一种新的同种型(本发明者命名为“Rim2”)相互作用。Rim1蛋白是小G蛋白Rab3的推定的效应物，有人提出它起着突触小泡融合的依赖于Rab3的调节剂作用[Y．Wang等人，Nature 388593(1997)]。
本发明者测序了新的全长Rim2蛋白，它由1590个氨基酸残基组成，发现其与大鼠Rim1有61．6％的相同性。如图3所示，发现锌指、PDZ和两个C2结构域在Rim1和Rim2之间是高度保守的。
根据上述发现，本发明者提供了一种具有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明还提供一种蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列相对于序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代、插入或增加，且该蛋白质具有与GDP／GTP交换因子II相互作用的性质。
本发明还提供编码下列蛋白(1)或(2)的小鼠基因(1)具有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质；(2)具有相对于上述氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代、插入或增加的氨基酸序列、且具有与GDP／GTP交换因子II相互作用性质的蛋白质。
在本说明书中，“一个或多个”氨基酸残基通常为数个(例如3或4个)到10个残基。
本发明还提供具有序列表中SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA，该DNA是对应于具有序列表中SEQ ID NO1所示氨基酸序列的上述蛋白质的cDNA。
本发明还提供具有相对于序列表中SEQ ID NO2所示核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、替代、插入或增加的核苷酸序列、且编码上述任何一种蛋白质的DNA。在这里，“一个或多个”核苷酸通常是数个(例如3或4个)至10个核苷酸。本领域技术人员利用关于遗传密码简并性的熟知的知识很容易制得具有一个或多个核苷酸缺失、替代、插入或增加各种这些核苷酸序列。
本发明还进一步提供具有上述任一DNA或具有序列表中SEQ ID NO2所示核苷酸序列之编码区域的核苷酸序列的DNA。
本发明还提供由上述任一DNA之一部分组成的DNA片段。
本发明还提供一种探针，该探针包含的DNA能与由上述任一核苷酸序列组成的DNA杂交。
本发明还提供一个引物DNA片段，它由上述任一核苷酸序列的部分序列组成。
本发明还提供一个具有上述任一DNA的重组载体。
本发明还提供针对上述任一蛋白质的单克隆或多克隆抗体。
本发明还提供包含上述任一探针或抗体的人用诊断试剂。该诊断试剂可用于以下这些疾病的测试，例如包括垂体、下丘脑、胰β细胞和腮腺等分泌性系统中的分泌失调，或用于脑-神经系统疾病的测试。
本发明还提供针对上述任一疾病的治疗制剂。
图1描述了cAMP结合结构域的序列对比。
图2显示了cAMP与cAMP-A的结合。
图3描述了Rim1和Rim2之间在锌指、PDZ和C2结构域中氨基酸相同性的比较结果。
图4显示了表明cAMP-GEFII与Rim1或Rim2之间相互作用的免疫印迹的结果。
图5显示了在各种大鼠组织和内分泌细胞系以及神经内分泌衍生的细胞系中Northern印迹分析cAMP-GEFII、Rim1和Rim2的结果。
图6是表明Rim1和Rim2在小鼠脑和垂体中的位置的原位杂交结果。
图7显示了酵母双杂交试验的结果。
图8描述了表明Rab3A与Rim1或Rim2体外相互作用的免疫印迹结果。
图9显示了高K+诱导共转染GH和cAMP-GEFII的PC12细胞分泌GH的时程。
图10显示了毛喉素对于转染的PC细胞分泌GH的影响。
图11显示了毛喉素诱导转染了各种突变型cAMP-GEFII的PC12细胞分泌GH。
图12显示了H-89对于毛喉素诱导转染了cAMP-GEFII的PC12细胞分泌GH的影响。
图13示意性地描述了依赖于cAMP的胞吐作用模型。
利用重组DNA技术能提供各种突变体。首先，可以通过不同的化学和／或酶促方法将突变引入DNA克隆片段中，然后对这样获得的突变型DNA进行测序，以选择具有预期优点的特定突变体。该方法能系统性地制备不同的突变体而不管它们的表型如何。制备突变型克隆DNA的常用方法如下。
1．在一个寡核苷酸的帮助下，可在给定的DNA序列中直接进行替代、缺失、插入或增加。该方法能将多个突变引入给定DNA的小区域中。
2．利用较长的寡核苷酸，可以合成所需的基因。
3．利用区域特异性诱变技术，可以将所需的突变引入大(1-3kb)的DNA区域内。
4．DNA的接头分区诱变是适合将一簇点突变引入较小(4-10bp)的DNA区域内的方法。
5．PCR也被用作直接引入突变的方法。制备能表达包括上述方法所得不同突变的所需基因的质粒或载体的方法也是本领域技术人员所熟知的。即，用限制性酶和连接酶的组合将携带所需基因的DNA插入表达载体DNA中，很容易构建携带所需基因的重组质粒。然后将这样获得的重组质粒导入不同细胞中以转染这些细胞，从而产生转化的细胞。可采用的细胞范围包括原核细胞如大肠杆菌，到酵母、昆虫、植物和动物细胞。重组质粒导入宿主细胞可通过氯化钙方法或电穿孔来实现。氯化钙方法提供了有效的转化而无需任何特殊的装置。为了获得较高的效率，建议采用电穿孔。通常在动物细胞系上进行的转染已知有两类，即瞬时和永久型。在瞬时转染中，培育转化的细胞1至4天，以实现转染基因的转录和复制，然后收获细胞分析它们的DNA。或者，在许多研究中，产生稳定的转化子细胞系，其中将转染的基因掺入染色体中。转染方法的例子包括磷酸钙法、电穿孔以及脂质融合方法。用本领域熟知的方法很容易制得针对本发明的Rim2基因所编码的蛋白质(多肽)的多克隆和单克隆抗体、或它们的片段和类似物。获得的抗体可用作实验室制剂以及诊断与Rim2基因有关的疾病的制剂。获得的抗体还可用来制备抗体柱，用于免疫沉淀以及用于Western印迹鉴定抗原。
以毫克规模制得针对本发明Rim2基因编码的蛋白质的单克隆抗体的通用方法如下用抗原蛋白接种小鼠进行免疫。从表现出足够抗体滴度的小鼠中取出脾脏。分离脾细胞，使所选B细胞与B细胞来源的骨髓瘤细胞融合形成分泌该抗体的杂交瘤细胞。用亲和层析、离子交换或凝胶过滤等方法从培养液中纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。本发明的多克隆抗体可用以下的常规方法制得用家兔、马、小鼠或豚鼠作为受免疫动物，按照本领域已知的一个方案接种抗原蛋白来免疫动物，然后从收集的血清中分离出IgG等。为了评价cAMP-GEFII与Rim2之间相互作用的特异性，本发明者评价了FLAG标记的cAMP-GEFII蛋白与固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim2融合蛋白之间的结合(见“Rim2和cAMP-GEFII之间相互作用的研究I”)。
简言之，评价转染了FLAG标记的cAMP-GEFII的COS-1细胞的裂解液、MIN6细胞裂解液或小鼠脑匀浆裂解液与GST-Riml、GST-Rim2或单独GST的结合。分别用抗-FLAG抗体(图4左侧)或抗cAMP-GEFII抗体(图4右侧)通过免疫印迹检测cAMP。这些结果表明，cAMP-GEFII蛋白与GST-Rim2蛋白相互作用。同样，GST-Rim1蛋白也结合小鼠脑匀浆中的cAMP-GEFII(见“Rim1与cAMP-GEFII相互作用的研究”)(图4，右侧)。这些结果确认cAMP-GEFII与Rim1以及Rim2相互作用。
图5显示了在各种大鼠组织以及内分泌细胞系和神经内分泌衍生细胞系中用Northern印迹分析cAMP-GEFII、Rim1和Rim2的结果(见“大鼠组织中的Northern印迹”)。采用各组织和细胞系中10微克总RNA(除胰岛用5微克外)标本。在标准条件下进行杂交和洗涤。在大脑和小脑的Rim2 mRNA印迹分析中所见的微弱的信号是由于与所用的Rim1 cDNA探针交叉杂交的缘故。图5表明Rim2 mRNA主要在内分泌组织以及内分泌细胞系和神经内分泌衍生细胞系中表达，包括垂体、胰岛郎格汉斯细胞、MIN6细胞和PC12细胞。通过反转录酶-PCR，在脑中检测到Rim2mRNA(数据未显示)。相反，通过类似的分析，发现Rim1 mRNA在大脑、小脑和垂体中表达。
Rim1的主要转录物有6．4kb，Rim2的主要转录物有7．2kb和5．4kb。还发现几个较小的转录物，它们可能由于可变剪接而产生的。
cAMP-GEFII mRNA通常在已知发生受到调节的胞吐作用的组织和细胞系中与Rim1或Rim2共同表达。图6描述了表明Rim1和Rim2在小鼠脑和垂体中位置的原位杂交的结果。在该图中(a)cAMP-GEFII；(b)Rim1；(c)Rim2；(d)垂体。比例柱对应于1毫米。缩写Cb=小脑；Cp=尾状核，Cx=皮质，Hi=海马，Ob=嗅球，Po=脑桥，Th=丘脑。
Rim2 mRNA表达仅见于小脑皮质，而Rim1 mRNA则在大脑皮质、海马(尤其是CA3和齿状脑回)、嗅球和小脑皮质中表达(见“小鼠脑中的原位杂交”)。cAMP-GEFII的分布与脑中Rim1 mRNA的分布大部分重叠。经确认，Rim2 mRNA和cAMP-GEFII mRNA在垂体前叶中共同表达。
已提出Rim1是一种Rab3效应物，一种低分子量G蛋白[Y．Wang，等人，Nature，388593(1997)]。利用酵母双杂交试验(见“Rim2和Rab3A之间相互作用的研究”)，本发明者发现Rim2与Rim1一样，和活性Rab3A(Q81L)相互作用(图7)。图7显示了酵母双杂交试验的结果。通过液体β-半乳糖苷酶活性的反式激活，测定了各种组合中的Rim1、Rim2或rabphilin3与野生型Rab3A或组成型活性Rab3A(Q81L)。
另外，固定的GST-Rim2只和Rab3A的GTPγS-结合形式结合(图8)。图8显示Rab3A与Rim1或Rim2之间在体内的相互作用，该结果是通过使Rab3A的GTPγS-或GDPγS-结合形式分别与固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim1(残基1-201)和GST-Rim2(残基1-345)一起培育而获得的。以抗Rab3A抗体通过免疫印迹检测Rab3A。这些结果表明Rim2和Rim1一样，与Rab3A的GTP-激活形式结合。
cAMP-GEFII与Rim2蛋白的相互作用强烈提示，cAMP-GEFII参与调控的胞吐作用。为了测定其功能作用，本发明者测定了cAMP对于用生长激素(GH)和cAMP-GEFII共同转染的PC12细胞中不依赖于Ca2+的分泌的影响(见“转染的PC12细胞分泌GH的研究”)。
由于PC12细胞内源性表达Rim2但不表达cAMP-GEFII，因此外源性引入的cAMP-GEFII可能与内源的Rim2形成一种复合物。
图9显示了用GH和cAMP-GEFII共转染的PC12细胞受高K+诱导分泌GH的时程。
图10显示了毛喉素对于转染的PC细胞分泌GH的影响。在与低K+(4．7毫摩尔)或高K+(60毫摩尔)溶液一起培育前10分钟，加入毛喉素(50微摩尔)。符号的意义如下对于基础性(低K+诱导)分泌cAMP-GEFII-转染子(实心三角)β-半乳糖苷酶-转染子(对照)(空心圆圈)；高K+诱导的分泌cAMP-GEFII-转染子(实心圆圈)；β-半乳糖苷酶-转染子(对照)(空心圆圈)。数值代表释放入培养液的GH量相对于细胞总GH量的百分数。
如图9所示，在共同转染的PC12细胞中，与对照相比，cAMP-GEFII没有改变共同转染的GH依赖于Ca2+(60毫摩尔K+)的分泌，但显著增强了毛喉素(50微摩尔)诱导的依赖于Ca2+的GH分泌(
图10)。毛喉素主要作用于腺苷酸环化酶，起提高细胞中cAMP水平的作用。cAMP-GEFII也增强了8-Br-cAMP(1毫摩尔)诱导的、依赖于Ca2+的GH分泌(cAMP-GEFII-转染子，34．9±1．3％；对照，25．1±1．8％，n=9，p＜0．001)。
图11显示转染了各种突变型cAMP-GEFII的PC12细胞受毛喉素诱导的GH分泌，其中对于每个突变型cAMP-GEFII，在15分钟培育期间毛喉素(50微摩尔)诱导的GH分泌(在高K+存在下)高于基础水平的增量，被表示成相对于野生型cAMP-GEFII(100％)的百分数。在该图中，WT=野生型cAMP-GEFII，T810A=突变型cAMP-GEFII(T810A)；G114E，G422D=双突变CMAP-GEFII(G114E，G422D)。
在突变型cAMP-GEFII(T810A)中，毛喉素诱导的GH分泌不受影响，其中通过其一个氨基酸置换，一个潜在的PKA磷酸化位点被破坏(
图11)。在两个cAMP结合位点被破坏的突变型cAMP-GEFII(G114E，G422D)中，毛喉素诱导的GH分泌减少至野生型中的大约40％。
这些结果表明，cAMP通过结合cAMP-GEFII促进了依赖于Ca2+的GH分泌，而不涉及其被PKA磷酸化。
图12显示了H-89对于毛喉素诱导cAMP-GEFII转染的PC12细胞分泌GH的影响。在毛喉素(50微摩尔)处理前10分钟在培育缓冲液中加入H-89(10微摩尔)。H-89(10微摩尔)的处理减少了cAMP-GEFII转染的和β-半乳糖苷酶转染的PC12细胞中高K+诱导的GH分泌。数据从3-5个独立的实验(A-D)获得。这些数值是平均值±SEM(p＜0．01)。
重要的是，经cAMP-GEFII转染的PC12细胞受PKA抑制剂H-89处理后的毛喉素诱导的不依赖于Ca2+的GH分泌明显高于对照细胞。这表明cAMP-GFEII介导了依赖于cAMP、而不依赖于PKA的胞吐作用。
为了确认cAMP-GEFII的生理相关性，本发明者调查了内源性cAMP-GEFII在分泌中的作用。在胰β细胞的胰岛素分泌中，据称cAMP通过依赖于PKA以及不依赖于PKA的机制刺激胞吐作用[M．Prentki，F．M．Matschinsky，Phsiol．Rev．671185(1987)／P．M．Jones，S．J．Persaund，Endocrine．Rev．19429(1998)]。
在16．7毫摩尔高浓度葡萄糖条件下，经针对cAMP-GEFII的反义寡核苷酸处理过的MIN6细胞受8-Br-cAMP诱导的胰岛素分泌明显减少(为对照寡核苷酸处理过的MIN6细胞的分泌的87．5±2．3％，n=27，p＜0．005)(见“cAMP-GEFII在依赖于cAMP的胞吐作用中的作用研究”)，这提示cAMP-GEFII参与了天然细胞中依赖于cAMP的胞吐作用。
Rab3与胞吐作用的最后步骤有关。结构上相关的蛋白rabphilin3[H．Shirataki等人，Mol．Cell．Biol．13，2061(1993)]和Rim1均与Rab3A结合，提示多个Rab3A效应物可在触发小泡与质膜对接和融合中起作用。
在本发明的过程中，发现cAMP传感物cAMP-GEFII通过与Rab3效应物Rim2的相互作用而介导cAMP诱导的、依赖于Ca2+的胞吐作用。
除了在与分泌过程有关的蛋白质的PKA磷酸化中起作用外，以前的研究已经提出cAMP可能直接作用于胞吐作用[G．Lonart，等人，Neuron 211141(1998)；E．Renstrom，等人，J．Physiol．502105(1997)；K．Yoshimura等人，Biochim．Biophys．Acta1402171(1998)]。在胰β细胞中，也提出了cAMP依赖于PKA和不依赖于PKA来刺激胰岛素的释放[E．Renstrom，等人，J．Physiol．502105(1997)]。认为cAMP可能直接刺激腮腺腺泡细胞释放淀粉酶[G．Lonart，等人，Neuron 211141(1998)]。另外，最近的研究提出cAMP增强脑中的谷氨酸释放部分是通过直接作用于胞吐机制[G．Lonart，等人，Neuron 21，1141(1998)]。
然而，尽管rabphilin3和Rim1在脑中的大多数突触中是普遍表达的[C．Li等人，Neuron 13885(1994)]，但是cAMP增强的谷氨酸释放发生在海马CA3区域而不是CA1区域的突触小体中，该发现与cAMP-GEFII和Rim1主要在CA3中共同表达相符合。
因此认为，除了分泌过程中依赖于PKA的磷酸化外，cAMP还通过直接作用于一些神经元以及神经内分泌细胞和内分泌细胞中cAMP-GEFII(一种cAMP传感物)和Rim(一种Rab3效应物)的复合物以不依赖于PKA的方式促进受调节的胞吐作用，如
图13所示。
这些发现表明本发明的Rim2也在调节神经元和内分泌细胞的胞吐作用中起重要的作用。
下面将通过参照实施例表述的本发明具体程序来更详细地描述本发明。
<CAMPS(cAMP-GEFII)cDNA的测序>
从小鼠胰岛素分泌型细胞系MIN6制得在载体pVP16中的质粒cDNA文库。用编码部分大鼠SUR1(氨基酸残基598-1003)(GenBank登录号L40624，胰β细胞KATP通道的一个亚基)的DNA片段在质粒pBTM116中构建酵母双杂交诱饵载体。
如K．Kotake等人，J．Biol．Chem．27229407(1997)所述的那样，对质粒MIN6cDNA文库进行酵母双杂交筛选。分离编码部分CAMPS-一种cAMP传感物(残基187-730)的捕食克隆(prey clone)。从λMIN6 cDNA文库获得全长小鼠CAMPS cDNA[N．Inagaki等人，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 912679(1994)]。小鼠CAMPS(cAMP-GEFII)的序列已经登录在Genbakn中，登录号为AB021132。
<GST融合蛋白的制备和测试>
按照生产商说明书，用pGEX-4T-1(Amersham-Pharmacia)将cAMP-A(氨基酸残基43-153)、cAMP-B(氨基酸残基357-469)和大鼠PKA调控亚基(RIα)(全长)表达成GST-融合蛋白，并纯化。如R．A．Steiberg，等人，J．Biol．Chem．2622664(1987)所述的那样稍作改动，进行cAMP结合试验。
简言之，将GST-融合蛋白(1微克)在冰上在结合缓冲液(200微升)中培育2小时，该结合缓冲液含有各种浓度的[3H]cAMP，50毫摩尔磷酸钾缓冲液(pH 6．8)、150毫摩尔NaCl，1毫摩尔EDTA，5毫摩尔2-巯基乙醇和0．5毫克／毫升牛血清白蛋白以及有或没有40毫摩尔未标记的cAMP。
<用YTH方法鉴定相互作用的分子>
用全长小鼠cAMP-GEFII cDNA在质粒pBTM116中构建酵母双杂交诱饵载体。从质粒MIN6 cDNA文库中分离编码Rim2部分序列(氨基酸残基53-863)的捕食克隆。从λMIN6 cDNA文库获得Rim2的全长cDNA。
<Rim2与cAMP-GEFII之间相互作用的研究I>
按照“GST融合蛋白的制备和测试”中所述的方法，将Rim2(氨基酸残基538-863)表达成GST融合蛋白并纯化。将全长cAMP-GEFII cDNA亚克隆到质粒pFLAG-CMV-2(Sigma)中。用LipofectAMINE(“Life Technologies)将所得构建物转染到COS-1细胞中。使COS-1细胞的裂解液和固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim2 4℃培育2小时。用蒸馏水洗涤如此获得的复合物，用SDS-PAGE分离，并用抗FLAG M2抗体作免疫印迹(Sigma)。
<Rim2与cAMP-GEFII之间相互作用的研究II>
使MIN6细胞的裂解液与GST-Rim2一起培育，根据“Rim2与cAMP-GEFII之间相互作用的研究I”中所述的方法，用针对小鼠cAMP-GEFII C 端(氨基酸残基1001-1011，Gln-Met-Ser-His-Arg-Leu-Glu-Pro-Arg-Arg-Pro)(SEQ ID NO5)产生的IgG抗体评价cAMP-GEFII和Rim2之间的相互作用。
<Rim1和cAMP-GEFII之间相互作用的研究>
按照“GST融合蛋白的制备和测试”所述的方法，将Rim1部分序列(530-806)表达成GST融合蛋白，然后纯化。使三只小鼠的脑匀浆物与固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim1 4℃培育过夜。如“Rim2与cAMP-GEFII之间相互作用的研究II”中所述的那样检测cAMP-GEFII。
<大鼠组织中的Northern印迹>
用小鼠cAMP-GEFII(核酸606-2237)、大鼠Rim1(1035-1491)和小鼠Rim2(586-1490)cDNA作为探针，对大鼠的各个组织进行Northern印迹。
<小鼠脑中的原位杂交>
如J．Tanaka，M．Murate，C．Z．Wang，S．Seino，T．Iwanaga，Arch．Histol．Cytol．59485(1996)中所述的那样，在小鼠脑中进行原位杂交。
用于小鼠cAMP-GEFII和Rim2的反义寡核苷酸探针(45聚体)分别对应于核酸2746-2790和1376-1420的区域。
对于Rim1的反义寡核苷酸，从小鼠脑部分克隆得到Rim1 cDNA用于此的探针是5′-ttgcgc tcactct tctggcc tccctt gccatt ctgctc tgaaagc-3′(SEQ ID NO3)。
<Rim2和Rab3A之间相互作用的研究>
根据“用YTH方法鉴定相互作用的分子”中所述的方法，将野生型小鼠Rab3A和组成型活性牛Rab3A(Q81L)的全长cDNA克隆到酵母诱饵载体pBTM116中。
将牛rabphilin3(氨基酸残基1-238)、大鼠Rim1(氨基酸残基1-204)和小鼠Rim2(氨基酸残基1-345)的锌指结构域的核苷酸序列克隆到捕食载体pVP16中。按照生产商说明书(Clontech)进行β-半乳糖苷酶活性的液体培养试验。从3个独立的克隆获得各转化子的活性数值，用OD600确定的细胞数予以标准化。
从表达Rab3A的Sf9细胞的膜组分纯化得到脂质修饰的Rab3A。将大鼠Rim1(氨基酸残基1-204)和小鼠Rim2(氨基酸残基1-345)表达成GST融合蛋白并纯化。使Rab3A的GTPγS-或GDPβS-结合形式与固定在谷胱苷肽珠粒上的GST-Rim1或GST-Rim2(各30pmol)于反应缓冲液中一起4℃培育90分钟。用抗Rab3A抗体作免疫印迹检测Rab3A。
<转染的PC12细胞分泌GH的研究>
如K．Korake等人，J．Biol．Chem27229407(1997)中所述的那样进行转染PC12细胞的GH分泌。制备野生型cAMP-GEFII、突变型cAMP-GEFII(T810A)以及双突变cAMP-GEFII(G114E，G422D)的表达质粒载体(pSRα)。用β-半乳糖苷酶(β-gal)作为对照。用GH表达载体(pXGH5Nichols Institute)加上上述每个载体，通过LipofectAMINE转染PC细胞。
在毛喉素(50微摩尔)或8-溴腺苷3′，5′环化单磷酸(8-Br-cAMP)(1毫摩尔)存在或不存在下，用低浓度K+(4．7毫摩尔)或高浓度K+(60毫摩尔)溶液培育PC12细胞。毛喉素或8-Br-cAMP在用低浓度或高浓度K+溶液进行培育前10分钟加入。在一些实验中，在毛喉素刺激前10分钟加入PKA抑制剂H-89(10微摩尔)。
<cAMP-GEFII在依赖于cAMP的胞吐作用中作用的研究>
为了干扰MIN6细胞中cAMP-GEFII的合成，合成了(BIOGNOSTIK)针对小鼠cAMP-GEFII(对应于核酸104-119的区域)的反义硫代磷酸酯替代的寡DNA(16聚体)和对照寡DNA(5′-aacctac gtgact acgt-3′)(SEQ ID NO4)。
在胰岛素分泌实验前，用4微摩尔的反义寡DNA或对照寡DNA处理MIN6细胞24小时。用抗cAMP-GEFII抗体，通过免疫印迹分析经反义寡DNA瞬时转染处理过的MIN6过度表达的cAMP-GEFII，评价反义寡DNA的效率。cAMP-GEFII在反义寡DNA处理过的MIN6细胞中的水平显著降低。在高浓度葡萄糖(16．7毫摩尔)存在下评价这些MIN6细胞对8-Br-cAMP(1毫摩尔)的胰岛素分泌反应。分开进行了5个实验，如T．Gonoi等人，J．Biol．Chem．26916989(1994)所述的那样测定胰岛素。
序列表<110>Seino，Susumu；JCR Pharmaceuticals CoLtd．<120>Rim2蛋白<130>GP35<160>4<210>1<211>1590<212>蛋白质<213>小家鼠<400> 1Met Ser Ala Pro Leu Gly Pro Arg Gly Arg Pro Ala Pro Thr Pro Ala1 5 10 15Ala Ser Gln Pro Pro Pro Gln Pro Glu Met Pro Asp Leu Ser His Leu20 25 30Thr Glu Glu Glu Arg Lys Ile Ile Leu Ala Val Met Asp Arg Gln Lys35 40 45Lys Glu Glu Glu Lys Glu Gln Ser Val Leu Lys Ile Lys Glu Glu His50 55 60Lys Ala Gln Pro Thr Gln Trp Phe Pro Phe Ser Gly Ile Thr Glu Leu65 70 75 80Val Asn Asn Val Leu Gln Pro Gln Gln Lys Gln Pro Asn Glu Lys Glu85 90 95Pro Gln Thr Lys Leu His Gln Gln Phe Glu Met Tyr Lys Glu Gln Val100 105 110Lys Lys Met Gly Glu Glu Ser Gln Gln Gln Gln Glu Gln Lys Gly Asp115 120 125Ala Pro Thr Cys Gly Ile Cys His Lys Thr Lys Phe Ala Asp Gly Cys130 135 140Gly His Asn Cys Ser Tyr Cys Gln Thr Lys Phe Cys Ala Arg Cys Gly145 150 155 160Gly Arg Val Ser Leu Arg Ser Asn Lys Val Met Trp Val Cys Asn Leu165 170 175Cys Arg Lys Gln Gln Glu Ile Leu Thr Lys Ser Gly Ala Trp Phe Tyr180 185 190Asn Ser Gly Ser Ash Thr Leu Gln Gln Pro Asp Gln Lys Val Pro Arg195 200 205Gly Leu Arg Asn Glu Glu Ala Pro Gln Glu Lys Lys Ala Lys Leu His210 215 220Glu Gln Pro Gln Phe Gln Gly Ala Pro Gly Asp Leu Ser Val Pro Ala225 230 235 240Val Glu Lys Gly Arg Ala His Gly Leu Thr Arg Gln Asp Thr Ile Lys245 250 255Asn Gly Ser Gly Val Lys His Gln Ile Ala Ser Asp Met Pro Ser Asp260 265 270Arg Lys Arg Ser Pro Ser Val Ser Arg Asp Gln Asn Arg Arg Tyr Glu275 280 285Gln Ser Glu Glu Arg Glu Asp Tyr Ser Gln Tyr Val Pro Ser Asp Gly290 295 300Thr Met Pro Arg Ser Pro Ser Asp Tyr Ala Asp Arg Arg Ser Gln Arg305 310 315 320Glu Pro Gln Phe Tyr Glu Glu Pro Gly His Leu Asn Tyr Arg Asp Ser325 330 335Asn Arg Arg Gly His Arg His Ser Lys Glu Tyr Ile Val Asp Asp Glu340 345 350Asp Val Glu Ser Arg Asp Glu Tyr Glu Arg Gln Arg Arg Glu Glu Glu355 360 365Tyr Gln Ala Arg Tyr Arg Ser Asp Pro Asn Leu Ala Arg Tyr Pro Val370 375 380Lys Pro Gln Pro Tyr Glu Glu Gln Met Arg Ile His Ala Glu Val Ser385 390 395 400Arg Ala Arg His Glu Arg Arg His Ser Asp Val Ser Leu Ala Asn Ala405 410 415Glu Leu Glu Asp Ser Arg Ile Ser Leu Leu Arg Met Asp Arg Pro Ser420 425 430Arg Gln Arg Ser Val Ser Glu Arg Arg Ala Ala Met Glu Ash Gln Arg435 440 445Ser Tyr Ser Met Glu Arg Thr Arg Glu Ala Gln Gly Gln Ser Ser Tyr450 455 460Pro Gln Arg Thr Ser Asn His Ser Pro Pro Thr Pro Arg Arg Ser Pro465 470 475 480Ile Pro Leu Asp Arg Pro Asp Met Arg Arg Ala Asp Ser Leu Arg Lys485 490 495Gln His His Leu Asp Pro Ser Ser Ala Val Arg Lys Thr Lys Arg Glu500 505 510Lys Met Glu Thr Met Leu Arg Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asp Gln Ser515 520 525Glu Ser Val Arg Pro Pro Pro Pro Arg Pro His Lys Ser Lys Lys Gly530 535 540Gly Lys Met Arg Gln Val Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Leu Ala545 550 555 560Ser Thr Pro Glu Tyr Thr Ser Cys Asp Asp Val Glu Leu Glu Ser Glu565 570 575Ser Val Ser Glu Lys Gly Asp Ser Gin Lys Gly Lys Arg Lys Thr Ser580 585 590Glu Gln Gly Val Leu Ser Asp Ser Asn Thr Arg Ser Glu Arg Gln Lys595 600 605Lys Arg Met Tyr Tyr Gly Gly His Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Trp610 615 620Ser Glu Pro Gln Ile Lys Asp Ser Gly Val Asp Thr Cys Ser Ser Thr625 630 635 640Thr Leu Asn Glu Glu His Ser His Ser Asp Lys His Pro Val Thr Trp645 650 655Gln Pro Ser Lys Asp Gly Asp Arg Leu Ile Gly Arg Ile Leu Leu Asn660 665 670Lys Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Pro Arg Asp Ser Gly Ala Met Leu675 680 685Gly Leu Lys Val Val Gly Gly Lys Met Thr Glu Ser Gly Arg Leu Cys690 695 700Ala Phe Ile Thr Lys Val Lys Lys Gly Ser Leu Ala Asp Thr Val Gly705 710 715 720His Leu Arg Pro Gly Asp Glu Val Leu Glu Trp Asn Gly Arg Leu Leu725 730 735Gln Gly Ala Thr Phe Glu Glu Val Tyr Asn Ile Ile Leu Glu Ser Lys740 745 750Pro Glu Pro Gln Val Glu Leu Val Val Ser Arg Pro Ile Gly Asp Ile755 760 765Pro Arg Ile Pro Asp Ser Thr His Ala Gln Leu Glu Ser Ser Ser Ser770 775 780Ser Phe Glu Ser Gln Lys Met Asp Arg Pro Ser Ile Ser Val Thr Ser785 790 795 800Pro Met Ser Pro Gly Met Leu Arg Asp Val Pro Gln Phe Leu Ser Gly805 810 815Gln Leu Ser Ile Lys Leu Trp Phe Asp Lys Val Gly His Gln Leu Ile820 825 830Val Thr Ile Leu Gly Ala Lys Asp Leu Pro Ser Arg Glu Asp Gly Arg835 840 845Pro Arg Asn Pro Tyr Val Lys Ile Tyr Phe Leu Pro Asp Arg Ser Asp850 855 860Lys Asn Lys Arg Arg Thr Lys Thr Val Lys Lys Thr Leu Glu Pro Lys865 870 875 880Trp Ash Gln Thr Phe Ile Tyr Ser Pro Val His Arg Arg Glu Phe Arg885 890 895Glu Arg Met Leu Glu Ile Thr Leu Trp Asp Gln Ala Arg Val Arg Glu900 905 910Glu Glu Ser Glu Phe Leu Gly Glu Ile Leu Ile Glu Leu Glu Thr Ala915 920 925Leu Leu Asp Asp Glu Pro His Trp Tyr Lys Leu Gln Thr His Asp Val930 935 940Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg Pro Ser Pro Tyr Leu Pro Arg Arg Gln945 950 955 960Leu His Gly Glu Ser Pro Thr Arg Arg Leu Gln Arg Ser Lys Arg Ile965 970 975Ser Asp Ser Glu Val Ser Asp Tyr Asp Cys Glu Asp Gly Val Gly Val980 985 990Val Ser Asp Tyr Arg His Asn Gly Arg Asp Leu Gln Ser Ser Thr Leu995 10001005Ser Val Pro Glu Gln Val Met Ser Ser Asn His Cys Ser Pro Ser Gly101010151020Ser Pro His Arg Val Asp Val Ile Gly Arg Thr Arg Ser Trp Ser Pro1025103010351040Ser Ala Pro Pro Pro Gln Arg Asn Val Glu Gln Gly His Arg Gly Thr104510501055Arg Ala Thr Gly His Tyr Asn Thr Ile Ser Arg Met Asp Arg His Arg106010651070Val Met Asp Asp His Tyr Ser Ser Asp Arg Asp Arg Asp Cys Glu Ala107510801085Ala Asp Arg Gln Pro Tyr His Arg Ser Arg Ser Thr Glu Gln Arg Pro109010951100Leu Leu Glu Arg Thr Thr Thr Arg Ser Arg Ser Ser Glu Arg Pro Asp1105111011151120Thr Asn Leu Met Arg Ser Met Pro Ser Leu Met Thr Gly Arg Ser Ala112511301135Pro Pro Ser Pro Ala Leu Ser Arg Ser His Pro Arg Thr Gly Ser Val114011451150Gln Thr Ser Pro Ser Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Arg Gly Arg Gln115511601165Leu Pro Gln Leu Pro Pro Lys Gly Thr Leu Glu Arg Ser Ala Met Asp117011751180Ile Glu Glu Arg Ash Arg Gln Met Lys Leu Asn Lys Tyr Lys Gln Val1185119011951200Ala Gly Ser Asp Pro Arg Leu Glu Gln Asp Tyr His Ser Lys Tyr Arg120512101215Ser Gly Trp Asp Pro His Arg Gly Ala Asp Thr Val Ser Thr Lys Ser122012251230Ser Asp Ser Asp Val Ser Asp Val Ser Ala Val Ser Arg Thr Ser Ser123512401245Ala Ser Arg Phe Ser Ser Thr Ser Tyr Met Ser Val Gln Ser Glu Arg125012551260Pro Arg Gly Asn Arg Lys Ile Ser Val Phe Thr Ser Lys Met Gln Asn1265127012751280Arg Gln Met Gly Val Ser Gly Lys Ash Leu Thr Lys Ser Thr Ser Ile128512901295Ser Gly Asp Met Cys Ser Leu Glu Lys Asn Asp Gly Ser Gln Ser Asp130013051310Thr Ala Val Gly Ala Leu Gly Thr Ser Gly Lys Lys Arg Arg Ser Ser131513201325Ile Gly Ala Lys Met Val Ala Ile Val Gly Leu Ser Arg Lys Ser Arg133013351340Ser Ala Ser Gln Leu Ser Gln Thr Glu Gly Gly Gly Lys Lys Leu Arg1345135013551360Ser Thr Val Gln Arg Ser Thr Glu Thr Gly Leu Ala Val Glu Met Arg136513701375Asn Trp Met Thr Arg Gln Ala Ser Arg Glu Ser Thr Asp Gly Ser Met138013851390Asn Ser Tyr Ser Ser Glu Gly Asn Leu Ile Phe Pro Gly Val Arg Leu139514001405Ala Ser Asp Ser Gln Phe Ser Asp Phe Leu Asp Gly Leu Gly Pro Ala141014151420Gln Leu Val Gly Arg Gln Thr Leu Ala Thr Pro Ala Met Gly Asp Ile1425143014351440Gln Val Gly Met Met Asp Lys Lys Gly Gln Leu Glu Val Glu Ile Ile144514501455Arg Ala Arg Gly Leu Val Val Lys Pro Gly Ser Lys Thr Leu Pro Ala146014651470Pro Tyr Val Lys Val Tyr Leu Leu Asp Ash Gly Val Cys Ile Ala Lys147517801485Lys Lys Thr Lys Val Ala Arg Lys Thr Leu Glu Pro Leu Tyr Gln Gln149014951500Leu Leu Ser Phe Glu Glu Ser Pro Gln Gly Arg Val Leu Gln Ile Ile1505151015151520Val Trp Gly Asp Tyr Gly Arg Met Asp His Lys Ser Phe Met Gly Val152515301535Ala Gln Ile Leu Leu Asp Glu Leu Glu Leu Ser Asn Met Val Ile Gly154015451550Trp Phe Lys Leu Phe Pro Pro Ser Ser Leu Val Asp Pro Thr Ser Ala155515601565Pro Leu Thr Arg Arg Ala Ser Gln Ser Ser Leu Glu Ser Ser Thr Gly157015751580Pro Ser Tyr Ser Arg Ser15851590<210>2<211>4980<212>DNA<213>小家鼠<400>2gcttccctag ggtggttcgg ctccgccaaa c atg tcg gct ccg ctc ggg ccc 52Met Ser Ala Pro Leu Gly Pro1 5cgg ggc cgc ccg gct ccc acc ccg gcg gcc tct caa cct cct ccg cag 100Arg Gly Arg Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Gln Pro Pro Pro Gln10 15 20ccc gag atg ccg gac ctc agc cac ctc acg gaa gag gag agg aaa atc 148Pro Glu Met Pro Asp Leu Ser His Leu Thr Glu Glu Glu Arg Lys Ile25 30 35atc ctg gct gtc atg gat cgt cag aag aaa gaa gag gag aag gag cag 196Ile Leu Ala Val Met Asp Arg Gln Lys Lys Glu Glu Glu Lys Glu Gln40 45 50 55tcc gtg ctc aag atc aaa gaa gaa cac aaa gca caa ccg aca cag tgg 244Ser Val Leu Lys Ile Lys Glu Glu His Lys Ala Gln Pro Thr Gln Trp60 65 70ttt ccc ttt agt ggg atc act gaa ctg gta aat aac gtt ctg cag ccc 292Phe Pro Phe Ser Gly Ile Thr Glu Leu Val Asn Asn Val Leu Gln Pro75 80 85cag caa aaa caa ccc aat gag aag gag ccc cag aca aag ctg cac caa 340Gln Gln Lys Gln Pro Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr Lys Leu His Gln90 95 100caa ttt gaa atg tat aag gag caa gtc aag aag atg gga gag gaa tcg 388Gln Phe Glu Met Tyr Lys Glu Gln Val Lys Lys Met Gly Glu Glu Ser105 110 115cag cag cag caa gag cag aag ggt gat gcc ccg acc tgt ggc atc tgc 436Gln Gln Gln Gln Glu Gln Lys Gly Asp Ala Pro Thr Cys Gly Ile Cys120 125 130 135cac aag aca aaa ttt gca gat gga tgc ggc cat aat tgt tcc tat tgc 484His Lys Thr Lys Phe Ala Asp Gly Cys Gly His Asn Cys Ser Tyr Cys140 145 150caa acc aag ttc tgt gct cga tgt gga ggt cga gtg tct tta cgc tca 532Gln Thr Lys Phe Cys Ala Arg Cys Gly Gly Arg Val Ser Leu Arg Ser155 160 165aac aag gtt atg tgg gtg tgt aat ttg tgc cga aaa caa caa gaa atc 580Asn Lys Val Met Trp Val Cys Asn Leu Cys Arg Lys Gln Gln Glu Ile170 175 180ctc act aaa tca gga gca tgg ttt tat aat agt ggg tct aac aca ctg 628Leu Thr Lys Ser Gly Ala Trp Phe Tyr Asn Ser Gly Ser Asn Thr Leu185 190 195cag caa cct gat caa aag gtt cct cga ggg ctt cga aat gag gaa gcc 676Gln Gln Pro Asp Gln Lys Val Pro Arg Gly Leu Arg Asn Glu Glu Ala200 205 210 215cct cag gag aag aaa gca aaa cta cac gag cag ccc cag ttc caa gga 724Pro Gln Glu Lys Lys Ala Lys Leu His Glu Gln Pro Gln Phe Gln Gly220 225 230gcc cca ggt gac tta tca gta cct gca gtt gag aaa ggc cga gct cat 772Ala Pro Gly Asp Leu Ser Val Pro Ala Val Glu Lys Gly Arg Ala His235 240 245ggg ctc aca aga cag gat act att aaa aat gga tca gga gtg aag cac 820Gly Leu Thr Arg Gln Asp Thr Ile Lys Asn Gly Ser Gly Val Lys His250 255 260cag att gcc agt gac atg cct tca gac aga aaa cga agt cca tca gtg 868Gln Ile Ala Ser Asp Met Pro Ser Asp Arg Lys Arg Ser Pro Ser Val265 270 275tcc agg gat caa aat cga aga tac gag caa agt gaa gaa aga gag gac 916Ser Arg Asp Gln Asn Arg Arg Tyr Glu Gln Ser Glu Glu Arg Glu Asp280 285 290 295tac tca cag tat gtt cct tca gat ggt aca atg cca aga tct cct tcg 964Tyr Ser Gln Tyr Val Pro Ser Asp Gly Thr Met Pro Arg Ser Pro Ser300 305 310gat tat gct gat aga cga tct cag cgt gag cct caa ttt tat gaa gaa 1012Asp Tyr Ala Asp Arg Arg Ser Gln Arg Glu Pro Gln Phe Tyr Glu Glu315 320 325cct ggt cat tta aat tac agg gat tct aac agg aga ggc cat aga cat 1060Pro Gly His Leu Asn Tyr Arg Asp Ser Asn Arg Arg Gly His Arg His330 335 340tcc aaa gag tat att gtg gat gat gaa gat gtg gag agc aga gat gaa 1108Ser Lys Glu Tyr Ile Val Asp Asp Glu Asp Val Glu Ser Arg Asp Glu345 350 355tat gaa aga caa agg aga gag gag gaa tac cag gca cgc tac aga agt 1156Tyr Glu Arg Gln Arg Arg Glu Glu Glu Tyr Gln Ala Arg Tyr Arg Ser360 365 370 375gat cca aat ctg gcc cgg tat ccc gta aag cca caa ccc tac gaa gaa 1204Asp Pro Asn Leu Ala Arg Tyr Pro Val Lys Pro Gln Pro Tyr Glu Glu380 385 390caa atg cgc atc cac gct gag gtg tcc agg gca cga cat gag aga agg 1252Gln Met Arg Ile His Ala Glu Val Ser Arg Ala Arg His Glu Arg Arg395 400 405cac agt gat gtt tct ttg gca aac gct gaa cta gaa gat tcc agg att 1300His Ser Asp Val Ser Leu Ala Asn Ala Glu Leu Glu Asp Ser Arg Ile410 415 420tct ctg cta agg atg gat aga cca tca agg caa aga tct gta tct gaa 1348Ser Leu Leu Arg Met Asp Arg Pro Ser Arg Gln Arg Ser Val Ser Glu425 430 435cgt aga gct gca atg gaa aac caa cga tcg tat tca atg gaa aga act 1396Arg Arg Ala Ala Met Glu Asn Gln Arg Ser Tyr Ser Met Glu Arg Thr440 445 450 455cga gag gct cag gga caa agt tct tat cca caa agg acc tca aat cat 1444Arg Glu Ala Gln Gly Gln Ser Ser Tyr Pro Gln Arg Thr Ser Asn His460 465 470agt cct ccc acc cct cgg cgg agc cct ata ccg ctt gat aga cca gac 1492Ser Pro Pro Thr Pro Arg Arg Ser Pro Ile Pro Leu Asp Arg Pro Asp475 480 485atg agg cgc gct gac tcc cta cgg aaa cag cac cac tta gat ccc agc 1540Met Arg Arg Ala Asp Ser Leu Arg Lys Gln His His Leu Asp Pro Ser490 495 500tct gct gtg agg aaa acg aag cga gaa aaa atg gaa acc atg tta agg 1588Ser Ala Val Arg Lys Thr Lys Arg Glu Lys Met Glu Thr Met Leu Arg505 510 515aat gat tct ttg agt tca gac cag tcc gag tca gtg agg ccg ccc cca 1636Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asp Gln Ser Glu Ser Val Arg Pro Pro Pro520 525 530535cca agg cct cat aaa tcc aag aaa gga ggt aaa atg cgc cag gtt tca 1684Pro Arg Pro His Lys Ser Lys Lys Gly Gly Lys Met Arg Gln Val Ser540 545 550ctg agc agc tcg gag gag gag ctg gca tcc aca cct gag tat aca agc 1732Leu Ser Ser Ser Glu Glu Glu Leu Ala Ser Thr Pro Glu Tyr Thr Ser555 560 565tgt gat gat gtg gag ctg gaa agc gag agt gtg agt gag aaa ggg gac 1780Cys Asp Asp Val Glu Leu Glu Ser Glu Ser Val Ser Glu Lys Gly Asp570 575 580agt caa aag gga aaa aga aaa act agt gag cag gga gtt ttg tcg gat 1828Ser Gln Lys Gly Lys Arg Lys Thr Ser Glu Gln Gly Val Leu Ser Asp585 590 595tct aac acc agg tct gag aga caa aag aaa agg atg tac tat ggt ggc 1876Ser Asn Thr Arg Ser Glu Arg Gln Lys Lys Arg Met Tyr Tyr Gly Gly600 605 610 615cac tct ttg gaa gag gat ttg gaa tgg tct gag cct cag att aag gac 1924His Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Trp Ser Glu Pro Gln Ile Lys Asp620 625 630tct ggg gta gat acc tgt agt agc aca acc ctt aac gag gag cat agc 1972Ser Gly Val Asp Thr Cys Ser Ser Thr Thr Leu Asn Glu Glu His Ser635 640 645cat agt gat aag cac cct gtg acc tgg cag cca tcc aaa gat gga gat 2020His Ser Asp Lys His Pro Val Thr Trp Gln Pro Ser Lys Asp Gly Asp650 655 660cgc cta att ggt cgt att tta tta aat aag cgt tta aaa gat ggg agt 2068Arg Leu Ile Gly Arg Ile Leu Leu Asn Lys Arg Leu Lys Asp Gly Ser665 670 675gta cct cga gac tca gga gca atg ctg ggc tta aag gtt gta gga gga 2116Val Pro Arg Asp Ser Gly Ala Met Leu Gly Leu Lys Val ValGly Gly680 685 690 695aag atg act gaa tca ggt cga ctt tgt gca ttt att acc aaa gta aaa 2164Lys Met Thr Glu Ser Gly Arg Leu Cys Ala Phe Ile Thr Lys Val Lys700 705 710aaa gga agt tta gct gat act gta gga cat ctt aga cca ggt gat gaa 2212Lys Gly Ser Leu Ala Asp Thr Val Gly His Leu Arg Pro Gly Asp Glu715 720 725gtc ttg gaa tgg aat ggg agg cta ttg caa gga gcc aca ttt gag gaa 2260Val Leu Glu Trp Asn Gly Arg Leu Leu Gln Gly Ala Thr Phe Glu Glu730 735 740gtt tac aac att att cta gaa tcc aaa cct gaa cca caa gtt gag ctt 2308Val Tyr Ash Ile Ile Leu Glu Ser Lys Pro Glu Pro Gln Val Glu Leu745 750 755gtt gtt tca agg cca att gga gat att cct aga ata cct gat agc acg 2356Val Val Ser Arg Pro Ile Gly Asp Ile Pro Arg Ile Pro Asp Ser Thr760 765 770 775cat gca caa ctg gaa tcc agt tct agc tca ttt gaa tct caa aaa atg 2404His Ala Gln Leu Glu Ser Ser Ser Ser Ser Phe Glu Ser Gln Lys Met780 785 790gac cgt cct tct ata tcc gtt acc tca ccc atg agt cct ggc atg ctg 2452Asp Arg Pro Ser Ile Ser Val Thr Ser Pro Met Ser Pro Gly Met Leu795 800 805agg gat gtc ccg cag ttc tta tct gga cag ctt tca ata aaa cta tgg 2500Arg Asp Val Pro Gln Phe Leu Ser Gly Gln Leu Ser Ile Lys Leu Trp810 815 820ttt gac aag gtt ggt cac cag ttg ata gtt aca att ttg gga gca aag 2548Phe Asp Lys Val Gly His Gln Leu Ile ValThr Ile Leu Gly Ala Lys825 830835gat ctc cct tcc agg gaa gat ggg agg cca agg aat cct tat gtt aag 2596Asp Leu Pro Ser Arg Glu Asp Gly Arg Pro Arg Asn Pro Tyr Val Lys840 845 850 855att tac ttc ctt cca gat aga agt gat aaa aat aag aga aga aca aaa 2644Ile Tyr Phe Leu Pro Asp Arg Ser Asp Lys Asn Lys Arg Arg Thr Lys860 865 870aca gtc aag aaa act ttg gaa ccc aaa tgg aac cag act ttc att tat 2692Thr Val Lys Lys Thr Leu Glu Pro Lys Trp Asn Gln Thr Phe Ile Tyr875 880 885tct cct gtc cac cga aga gaa ttc cgt gaa cga atg ctg gaa att acc 2740Ser Pro Val His Arg Arg Glu Phe Arg Glu Arg Met Leu Glu Ile Thr890 895 900ctt tgg gat caa gct aga gtt cga gaa gaa gag agc gaa ttc tta gga 2788Leu Trp Asp Gln Ala Arg Val Arg Glu Glu Glu Ser Glu Phe Leu Gly905 910 915gag att tta att gaa ttg gaa aca gct ttg cta gat gat gag ccg cac 2836Glu Ile Leu Ile Glu Leu Glu Thr Ala Leu Leu Asp Asp Glu Pro His920 925 930 935tgg tat aag ctg cag acc cat gat gtc tcc tca ttg cca ctc cct cgc 2884Trp Tyr Lys Leu Gln Thr His Asp Val Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg940 945 950cct tcc cca tat ctg ccc cgg agg cag ctc cat gga gag agc cca acg 2932Pro Ser Pro Tyr Leu Pro Arg Arg Gln Leu His Gly Glu Ser Pro Thr955 960 965cgc agg ctg caa agg tcg aag aga ata agt gac agt gaa gtg tct gac 2980Arg Arg Leu Gln Arg Ser Lys Arg Ile Ser Asp Ser Glu ValSer Asp970 975 980tac gac tgc gag gat ggc gtg gga gta gtg tca gat tat cga cac aat 3028Tyr Asp Cys Glu Asp Gly Val Gly Val Val Ser Asp Tyr Arg His Asn985 990 995ggc cgc gat ctt caa agc tcc acg ttg tcg gtg cca gaa caa gtc atg 3076Gly Arg Asp Leu Gln Ser Ser Thr Leu Ser Val Pro Glu Gln Val Met1000100510101015tca tca aat cat tgc tca cca tca ggg tct cct cat cga gta gat gtt 3124Ser Ser Asn His Cys Ser Pro Ser Gly Ser Pro His Arg Val Asp Val102010251030ata gga agg aca agg tca tgg tcg cct agt gcc cct cct cct caa agg 3172Ile Gly Arg Thr Arg Ser Trp Ser Pro Ser Ala Pro Pro Pro Gln Arg103510401045aat gtg gaa cag ggg cac cga ggg aca cgt gct act ggc cat tac aac 3220Asn Val Glu Gln Gly His Arg Gly Thr Arg Ala Thr Gly His Tyr Asn105010551060aca att agc cga atg gat aga cac cgt gtc atg gat gac cac tac tct 3268Thr Ile Ser Arg Met Asp Arg His Arg Val Met Asp Asp His Tyr Ser106510701075tca gat aga gac agg gat tgt gaa gca gca gat aga cag cca tat cac 3316Ser Asp Arg Asp Arg Asp Cys Glu Ala Ala Asp Arg Gln Pro Tyr His1080108510901095aga tcc aga tca aca gaa caa cgg cct ctc cta gag cgg acc acc acc 3364Arg Ser Arg Ser Thr Glu Gln Arg Pro Leu Leu Glu Arg Thr Thr Thr110011051110cgc tcc aga tcc tct gaa cgt cct gat aca aac ctc atg agg tcg atg 3412Arg Ser Arg Ser Ser Glu Arg Pro Asp Thr Asn Leu Met Arg Ser Met111511201125cct tca tta atg act gga aga tct gcc cct cct tca cct gcc tta tcg 3460Pro Ser Leu Met Thr Gly Arg Ser Ala Pro Pro Ser Pro Ala Leu Ser113011351140agg tct cac cct cgt acc ggg tct gtc cag aca agc cca tca agt act 3508Arg Ser His Pro Arg Thr Gly Ser Val Gln Thr Ser Pro Ser Ser Thr114511501155ccg gga aca gga cga agg ggc cga cag ctt cca cag ctt cca cca aag 3556Pro Gly Thr Gly Arg Arg Gly Arg Gln Leu Pro Gln Leu Pro Pro Lys1160116511701175gga aca ttg gag aga agt gct atg gat ata gag gag aga aat cgc caa 3604Gly Thr Leu Glu Arg Ser Ala Met Asp Ile Glu Glu Arg Asn Arg Gln118011851190atg aaa ctt aac aaa tac aaa cag gta gcc gga tca gac ccc aga ctg 3652Met Lys Leu Asn Lys Tyr Lys Gln Val Ala Gly Ser Asp Pro Arg Leu119512001205gag caa gat tac cat tcg aag tat cgc tca gga tgg gat cca cat aga 3700Glu Gln Asp Tyr His Ser Lys Tyr Arg Ser Gly Trp Asp Pro His Arg121012151220ggg gca gat act gtt tcc act aaa tcc tcg gac agt gat gta agt gat 3748Gly Ala Asp Thr Val Ser Thr Lys Ser Ser Asp Ser Asp Val Ser Asp122512301235gta tct gcg gtt tca agg act agt agt gct tct cgt ttc agc agc aca 3796Val Ser Ala Val Ser Arg Thr Ser Ser Ala Ser Arg Phe Ser Ser Thr1240124512501255agc tac atg tcc gtc caa tca gag cgg ccg aga gga aac agg aaa atc 3844Ser Tyr Met Ser Val Gln Ser Glu Arg Pro Arg Gly Asn Arg Lys Ile126012651270agt gtc ttt aca tcc aaa atg caa aac aga cag atg ggc gtg tcg ggg 3892Ser Val Phe Thr Ser Lys Met Gln Asn Arg Gln Met Gly Val Ser Gly127512801285aag aac ttg acc aaa agc acc agc atc agt gga gac atg tgc tca ctg 3940Lys Asn Leu Thr Lys Ser Thr Ser Ile Ser Gly Asp Met Cys Ser Leu129012951300gag aag aat gac ggc agc cag tcc gac act gca gtg ggc gcc ctg ggt 3988Glu Lys Asn Asp Gly Ser Gln Ser Asp Thr Ala Val Gly Ala Leu Gly130513101315acc agt ggc aag aag cgg cga tct agc att ggg gcc aaa atg gta gct 4036Thr Ser Gly Lys Lys Arg Arg Ser Ser Ile Gly Ala Lys Met Val Ala1320132513301335att gtt ggt ctc tca cgg aaa agt cgc agt gcc tct caa ctc agc caa 4084Ile Val Gly Leu Ser Arg Lys Ser Arg Ser Ala Ser Gln Leu Ser Gln134013451350acc gaa gga gga ggt aaa aag cra cgg agc act gtt cag aga agc acg 4132Thr Glu Gly Gly Gly Lys Lys Leu Arg Ser Thr Val Gln Arg Ser Thr135513601365gag acc ggg cta gca gtg gag atg agg aac tgg atg acc cgc cag gcc 4180Glu Thr Gly Leu Ala Val Glu Met Arg Asn Trp Met Thr Arg Gin Ala137013751380agc cgg gaa tcc aca gat ggc agc atg aac agc tat agc tcg gaa gga 4228Ser Arg Glu Ser Thr Asp Gly Ser Met Asn Ser Tyr Ser Ser Glu Gly138513901395aat ctg atc ttc cct ggg gtc cgc ctg gcc tct gac agc cag ttc agt 4276Asn Leu Ile Phe Pro Gly Val Arg Leu Ala Ser Asp Ser Gln Phe Ser1400140514101415gat ttc ctg gat ggc ctg ggc cct gct cag cta gtg gga cgc cag acc 4324Asp Phe Leu Asp Gly Leu Gly Pro Ala Gln Leu Val Gly Arg Gln Thr142014251430ctg gct act cct gca atg ggt gac att cag gtg gga atg atg gat aaa 4372Leu Ala Thr Pro Ala Met Gly Asp Ile Gln Val Gly Met Met Asp Lys143514401445aag gga cag ctg gag gta gaa atc atc cgg gcg cgc ggc ctt gtg gta 4420Lys Gly Gln Leu Glu Val Glu Ile Ile Arg Ala Arg Gly Leu Val Val145014551460aaa cca ggt tcc aag aca ctg cca gca ccg tat gtc aag gtg tat ctg 4468Lys Pro Gly Ser Lys Thr Leu Pro Ala Pro Tyr Val Lys Val Tyr Leu146514701475tta gac aac gga gtc tgc ata gcc aaa aag aaa acc aag gtg gcg aga 4516Leu Asp Asn Gly Val Cys Ile Ala Lys Lys Lys Thr Lys Val Ala Arg1780148514901495aag acc ctg gag ccc ctg tac cag cag ctc ttg tcc ttc gag gag agc 4564Lys Thr Leu Glu Pro Leu Tyr Gin Gln Leu Leu Ser Phe Glu Glu Ser150015051510ccc cag ggg agg gtg tta cag atc att gtc tgg gga gat tat ggt cgt 4612Pro Gln Gly Arg Val Leu Gln Ile Ile Val Trp Gly Asp Tyr Gly Arg15151520 1525atg gat cac aaa tcc ttt atg gga gtg gcc cag ata ctc tta gat gaa 4660Met Asp His Lys Ser Phe Met Gly Val Ala Gln Ile Leu Leu Asp Glu153015351540ctg gaa cta tcc aac atg gtg att gga tgg ttc aaa ctc ttc cct cct 4708Leu Glu Leu Ser Ash Met Val Ile Gly Trp Phe Lys Leu Phe Pro Pro154515501555tcc tcc cta gta gat cca acc tcg gca cct ctg aca aga aga gct tcc 4756Ser Ser Leu Val Asp Pro Thr Ser Ala Pro Leu Thr Arg Arg Ala Ser1560156515701575caa tcg tct ctg gaa agt tct acc gga cct tct tac tct cgt tca 4801Gln Ser Ser Leu Glu Ser Ser Thr Gly Pro Ser Tyr Ser Arg Ser158015851590tagcaactat aaaactgttg tcacaacaac cagcgataca aaaaccagaa gaaaacgcac 4861aggtggaagc ccctggtaac actgcatgct tgatgttgtg tctacagagc ccacgtctag 4921ggataccaag cagtcctgtg ttctcagagg aagtcgtaca cattgtgccc tagcaaagg4980<210>3<211>45<212>DNA<213>小家鼠<400> 3ttgcgctcac tcttctggcc tcccttgcca ttctgctctg aaagc45<210>4<211>16<212>DNA<213>小家鼠<400> 4acctacgtga ctacgt16<210> 5<211> 16<212>蛋白质<213&>小家鼠<400> 5Gln Met Ser His Arg Leu Glu Pro Arg Arg Pro1 510
权利要求
1．一种蛋白质，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2．一种蛋白质，它具有的氨基酸序列相对于序列表中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代、插入或增加，并且该蛋白质具有与GDP／GTP交换因子II相互作用的性质。
3．一种编码权利要求1或2所述的蛋白质的小鼠基因。
4．一种DNA，它具有序列表中SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，该DNA是对应于权利要求1所述的蛋白质的cDNA。
5．一种DNA，它具有的核苷酸序列相对于序列表中SEQ ID NO2所示的核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、替代、插入或增加，并编码权利要求1或2所述的蛋白质。
6．一种DNA，它含有权利要求4所述的DNA之编码区的核苷酸序列。
7．一种DNA，它含有权利要求5所述的DNA之编码区的核苷酸序列。
8．一种DNA片段，它由权利要求4所述的DNA的一部分组成。
9．一种探针，它包含与权利要求4所述的DNA杂交的DNA。
10．一种引物DNA片段，它由权利要求4至7之一项所述的序列的一部分序列组成。
11．一种重组载体，它含有权利要求4所述的DNA。
12．一种重组载体，它含有权利要求5所述的DNA。
13．一种单克隆或多克隆抗体，它针对于权利要求1或2所述的蛋白质。
14．一种用于诊断分泌失调或脑一神经系统疾病的制剂，它包含权利要求9所述的探针。
15．一种用于诊断分泌失调或脑一神经系统疾病的制剂，它包含权利要求13所述的抗体。
全文摘要
本发明提供了用于开发涉及运输系统的神经元、或内分泌细胞有关疾病的治疗制剂的一种蛋白质。该蛋白质具有的氨基酸序列相对于序列表中SEQ ID NO∶1所述的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代、插入或增加,该蛋白质具有与GDP/GTP交换因子Ⅱ相互作用的性质。
文档编号C12Q1/68GK1291617SQ0012419
公开日2001年4月18日 申请日期2000年8月14日 优先权日1999年10月8日
发明者清野进, 柴崎忠雄, 尾崎信晓 申请人:日本化学研究株式会社, 清野进