专利名称：一种稻中脯氨酸转运蛋白的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种稻中脯氨酸转运蛋白的基因。
已知当经受盐逆境时，一些植物(包括盐生植物)在体内积累脯氨酸。据认为，积累的脯氨酸作为适宜的渗压剂，调节细胞内的渗透压并在植物体内保持水分。植物中，脯氨酸经过两种酶催化的两个反应由谷氨酸合成，这两种酶分别是Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)合成酶(P5CS)和Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)。
当这类植物经历水分逆境时(即水分吸收困难的情况)，诸如盐逆境或缺水时，P5CS活性水平以及P5CS基因表达增加。在这种情况下，P5CR的活性水平以及P5CR基因的表达保持几乎恒定，且为较低水平。这表明P5CS是在水逆境下脯氨酸合成的限速因子(Yoshiba等，植物杂志(Plant J.)，7751-760，1995)。
Kishor等通过向烟草中导入乌头叶菜豆(mothbean)的P5CS基因，从而引起该基因的过量表达，成功地增加了其对盐的耐受，这表明涉及P5CS基因的基因操作在制备盐耐受型作物方面是有效的(Kishor等，植物生理(Plant Physiol.)，1081387-1394，1995)。
在水逆境下，不仅是脯氨酸合成，而且脯氨酸的转运也参与了脯氨酸的积累。就脯氨酸的转运而言，已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)和番茄中分别克隆了两个和三个脯氨酸转运蛋白基因。这些转运蛋白与其它氨基酸转运蛋白不同，仅选择性地转运脯氨酸。
经过氨基酸比较，显示两种来自拟南芥的脯氨酸转运蛋白基因彼此十分相似。但是，它们在基因表达模式上彼此不同。其中一种为拟南芥脯氨酸转运蛋白1(AtProT1)基因，其在整个组织中以恒定的低水平表达，另一种为拟南芥脯氨酸转运蛋白2(AtProT2)基因，其在正常生长条件下极少表达，但在盐逆境下被迅速且强烈地诱导其的表达。因此，认为后一基因是专为缺水逆境准备的转运蛋白基因，用于转运作为渗压剂的脯氨酸(Rentsch等，植物细胞(The Plant Cell)，81437-1446(1996))。
在从番茄中克隆的三种脯氨酸转运蛋白基因中，就其功能而言，脯氨酸转运蛋白1(LeProT1)基因已被十分详细的分析，已知其在花粉成熟过程中强烈表达，且LeProT1将脯氨酸转运至花粉并在其中造成积累。这是LeProT1一个特征，即它不仅转运脯氨酸，还转运甘氨酸、甜菜碱等由水逆境诱导的适宜的渗压剂。目前，尚未有关于脯氨酸转运蛋白2(LeProT2)和脯氨酸转运蛋白3(LeProT3)的功能的报道。但是，由于编码这些转运蛋白的基因属于与LeProT1所属基因家族相同的基因家族，因此认为这些转运蛋白类似于AtProt2，参与氨基酸向花粉的转运和/或应答逆境压力的转运(Schwacke等，植物细胞，11377-391，1999)。
对于在水逆境下脯氨酸的积累而言，脯氨酸的合成以及合成之脯氨酸的转运均很重要。植物为了适应快速的环境变化，如干旱和/或盐逆境，其会尽快有效地促进脯氨酸的合成，且将脯氨酸转运至需要的组织。用于这类目的时，如果可操纵P5CS基因以实现其的过量表达和脯氨酸合成活性的增加，并且进一步操纵一种或多种脯氨酸转运蛋白基因以实现其过量表达，用来将合成的脯氨酸转运至需要的组织，就可以培育稻和其它的有益作物，其显示协同作用，且进一步具有高盐耐受以及干旱抗性。据估计，由于自然环境的破坏，未来由于干旱和半干旱造成的盐碱土壤之比例将会日益增加。因此，培育上述这类耐受型或抗性作物对解决全球食物问题将会起重要的作用。
就植物中的脯氨酸转运蛋白基因而言，目前只有从拟南芥和番茄中分离的相应的cDNA。尚未从单子叶植物中分离到这样的基因。在这种情况下，本发明提供了一种单子叶植物--稻中的脯氨酸转运蛋白基因。由于分离了在本领域中尚不为人知的单子叶植物脯氨酸转运蛋白基因，因此本发明可称为实现了新的技术进步。
专注于这种稻脯氨酸转运蛋白，通过基因操作本发明成功的解决了控制这种转运蛋白的新技术问题，也就是说，本发明人首次提出了本领域目前尚未认识到的技术问题，并从多个角度解决了此问题。为此，他们进行了大量的研究，试图从稻幼苗组织中分离相关基因。结果，他们从通过mRNA反转录制备的cDNA文库中，成功地分离了编码全长稻脯氨酸转运蛋白基因的cDNA。
图1．比较性显示了由来自稻脯氨酸转运蛋白以及两个拟南芥脯氨酸转运蛋白的氨基酸序列推定的亲/疏水性(hydropathy)曲线。其中，
图1A显示了本发明的转运蛋白曲线模式，而
图1B和
图1C显示了两种拟南芥脯氨酸转运蛋白AtProT1和AtProT2的曲线模式。
图2显示了稻脯氨酸转运蛋白基因表达分析的结果。其中，图2A显示了在植物生长过程中稻中数种器官内基因的表达水平。其中，S表示叶片+叶鞘和柄；R为根；LB为叶片；LS为叶鞘和柄；P为幼穗。图2B和图2C显示在不同盐逆境条件下基因的表达水平。
本发明涉及一种稻转运蛋白基因(cDNA)，其基因序列示于序列表中，为SEQ ID NO.1。发现此基因由1863个碱基对组成，具有一个开放阅读框，且在3’末端具有用于聚腺苷酸化的序列AATAAA。本发明还包括一种含有稻脯氨酸转运蛋白基因(cDNA)的噬菌体，以及衍生自该基因的质粒。
在本发明的实施中，首先从稻幼苗中提取mRNA，利用提取的mRNA制备cDNA。将此cDNA连接于一种质粒或噬菌体的载体，然后将其导入用来制备重组DNA的宿主微生物。从带有向其中导入此重组DNA的诸多转化微生物中，通过常规筛选选择期望的转化子，例如，使用来自拟南芥的AtProT1和/或AtProT2基因作为探针。从所得的转化子中分离期望的质粒，如果需要，通过用适当的一种或多种限制性酶切割并亚克隆至质粒载体。将此克隆的DNA用于制备转化子，然后栽种该转化子，籍此可从培养物中大量回收稻脯氨酸转运蛋白。
根据本发明制备的稻脯氨酸转运蛋白可连接于一种强启动子的下游端，或者连接于能在叶或根中特异性表达的启动子下游端，并连接入质粒。所得的重组质粒可通过常规方法例如通过电穿孔技术或土壤杆菌(Agrobacterium)属的种的转染，导入稻细胞或其它一些有用的植物中，用于从如此转化的细胞中再生植物体。用此方法，过量产生稻脯氨酸转运蛋白的稻或其它有益植物将脯氨酸转运至植物体或特定的一种或多种组织，如叶、根等，并在那里积累。当该基因被连接至一种待连接入质粒的启动子下游端(其中所述启动子在逆境条件下可特异性驱动表达)，再将所得的重组质粒以常规方法导入稻或其它一些有益植物，例如通过电穿孔技术或土壤杆菌属的种的转染，由这样的细胞再生的稻或其它有用植物在逆境条件下可特异性地过量产生稻脯氨酸转运蛋白，这样能转移和积累脯氨酸。
下面的实施例更详细地阐述了本发明。但是，该实施例不以任何方式限制本发明的范围。在下面的实施例中，除非特别指明，各个步骤主要根据Sambrook等，分子克隆，Cold Spring Harbor Lab.，1989中的描述进行。
首先，从稻栽培品种“Akibare”的幼苗构建cDNA文库。因此，通过硫氰酸胍/CsCl方法从10克萌发后两周的幼苗中提取总RNA。使用Oligo(dT)Latex(Takara，Kusatsu，日本)从总RNA中分离mRNA。所得的mRNA约为总RNA的1.2％。使用市售的cDNA合成试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，美国)从mRNA进行cDNA的合成。将合成的cDNA插入一种λ噬菌体载体λZAPII(Stratagene，La Jolla，CA，美国)中，随后用所得重组子感染大肠杆菌，产生cDNA文库。
然后，使用以前的分离的AtProT1和AtProT2基因cDNA作为探针，通过噬菌斑杂交方法获得六个阳性克隆。将这些克隆亚克隆入Bluescript，并通过限制性酶切处理检查全部克隆的长度，还通过循环测序方法部分测定5’和3’末端的序列。通过这种方法，获得可能含有脯氨酸转运蛋白基因cDNA的全长的克隆。由这个克隆，利用DNA缺失试剂盒获得了大约有300bp差异的许多克隆。从这些克隆中提取质粒DNA，通过循环测序法进行全长cDNA序列测定。
经过同源性分析，由如此测序的cDNA显示其与先前分离并在拟南芥所有组织中表达的AtProT1在氨基酸水平上具有高度同源性，即68.8％同源；与在盐逆境下特异性表达的AtProT2基因在氨基酸水平上具有高度同源性，即67.8％同源。此外，通过绘制亲/疏水性图，将脯氨酸转运蛋白与两种拟南芥脯氨酸转运蛋白AtProT1和AtProT2蛋白质进行比较，由此可预测脯氨酸转运蛋白细胞膜中的跨膜结构域。这种比较的结果示于
图1。
图1中，亲/疏水性图预测了每一脯氨酸转运蛋白的跨膜结构域，横坐标显示氨基酸残基数目，纵坐标显示疏水性。
图1A显示了本发明的转运蛋白亲/疏水性图模式，而
图1B和
图1C分别显示了两种拟南芥脯氨酸转运蛋白AtProT1和AtProT2的亲/疏水性图模式。如
图1中所示，他们彼此间的图形模式十分相似，因此以上述方法测序的cDNA被鉴定为稻中的脯氨酸转运蛋白基因。
此外，使用该cDNA作为探针，通过Northern分析法检查基因表达的水平。图2A显示了在数个生长时期稻的几个器官中稻脯氨酸转运蛋白基因表达的这种检查结果，其中所述数个生长时期为一周龄、一月龄和抽穗之前。在一周龄的稻中，检查了叶片、叶鞘和茎。在抽穗之前，检查了叶、鞘、根和幼穗。由结果所示，本发明的基因在所有检查的组织中表达，特别是在具有充分发育的维管系统的叶鞘、茎和成熟叶片中大量表达。图2B和图2C显示在盐逆境条件下的稻脯氨酸转运蛋白基因表达分析的结果。图2B显示，在根部浸没在蒸馏水中的情况下基因表达的水平为时间的函数。图2C显示，在根部浸没在250mM的NaCl溶液中的情况下基因表达的水平为时间的函数，与0时刻相比，表达水平未增加，类似于在用蒸馏水处理的情况。因此揭示，本发明基因的表达不由高盐处理所诱导。基于这些结果，认为本发明的基因在功能上等同于在拟南芥所有组织中均表达的AtProT1基因。
由如上所述，揭示了本发明的基因编码一种脯氨酸转运蛋白。核苷酸序列以及相应的氨基酸序列示于序列表中的SEQ ID NO.1。所述稻脯氨酸转运蛋白基因的结构由本发明人首次测定。
因此，通过在植物中增强本发明的基因，可引起脯氨酸的快速转运和累积，籍此向植物提供盐耐受性或干旱抗性。此外，通过用本发明的基因以及向其中导入稻Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(本发明人先前在日本未审专利申请H10-57069中提出的)，同时导入能在严酷环境条件下(诸如高盐条件)促进基因表达的启动子，用来培育稻或其它有用的植物作物，就可能预期在甚至含有累积盐份的盐碱土壤或在干旱土壤中栽培转化的稻或其它植物，由此相应地增加食物生产。还可预期可通过这种方法应付在发展中国家中人口的增长。
注意到稻中脯氨酸转运蛋白的重要性，本发明人指出了一种通过基因操作控制该转运蛋白的新的技术问题，并成功的解决了这个技术问题。如果在脯氨酸合成中是限速因子的编码P5CS的基因可以被操作，以实现其过量表达和脯氨酸合成活性的增加，并且进一步操纵一种或多种脯氨酸转运蛋白基因以实现其过量表达，用来将合成的脯氨酸转运至需要的组织，就可以培育稻和其它的有益作物，它们显示协同作用，且进一步具有高盐耐受以及干旱抗性。据估计，由于自然环境的破坏，未来由于干旱和半干旱造成的盐碱土壤之比例将会日益增加。因此，培育上述这类耐受型作物对解决全球食物问题将会起重要的作用。
序列表&#60110&#62HitachiLTD.&#60120&#62稻脯氨酸转运蛋白基因&#60160&#621&#60210&#621&#60211&#621863&#60212&#62DNA&#60213&#62稻(OryzasativaL.)&#60220&#62&#60221&#62cds&#60222&#62144..1562&#60300&#62&#60308&#62AB022783&#60309&#621999年1月28日&#60400&#621gccgcccgct tgccggagct ctctatctat ctctctatct ctatctctat ccctccagat 60tccctcctcc atcgaatctc tgatatttgg agggagcgac tcgacgcagc atcgcatcgt 120aaggaaggtc ccctccactg tcg 143atg gat cag cac cag ctc gac gag gag aac cag aga gcc gcg ctc ttc cac 194Met Asp Gln His Gln Leu Asp Glu Glu Asn Gln Arg Ala Ala Leu Phe His1 5 1015tcc tct gcc cca tct tcc tct ttg gga gct gac ggg gag gag gag agg gag 245Ser Ser Ala Pro Ser Ser Ser Leu Gly Ala Asp Gly Glu Glu Glu Arg Glu202530act gtg ccg ctg ctg tcc tgc aag atg gcc gac gat aaa tct gac act gtc 296Thr Val Pro Leu Leu Ser Cys Lys Met Ala Asp Asp Lys Ser Asp Thr Val3540 45 50cag gtc tcc gag gat acg gcg cac cag att agc att gat ccc tgg tat caa 347Gln Val Ser Glu Asp Thr Ala His Gln Ile Ser Ile Asp Pro Trp Tyr Gln55 60 65gtt gga ttc att ctg aca acc ggg gtg aat agt gca tat gtt ctg gga tat 398Val Gly Phe Ile Leu Thr Thr Gly Val Asn Ser Ala Tyr Val Leu Gly Tyr70 75 80 85tct gca tca atc atg gtc cct tta ggc tgg att ggt ggg aca tgt ggc ttg 449Ser Ala Ser Ile Met Val Pro Leu Gly Trp Ile Gly Gly Thr Cys Gly Leu90 95 100att cta gct gct gca ata tcc atg tat gca aat gct ctt ctt gct cac ctt 500Ile Leu Ala Ala Ala Ile Ser Met Tyr Ala Asn Ala Leu Leu Ala His Leu105110 115cat gaa gtt ggt ggc aaa cgc cat atc aga tac aga gat ctt gct ggg cac 551His Glu Val Gly Gly Lys Arg His Ile Arg Tyr Arg Asp Leu Ala Gly His120 125 130 135ata tat ggt aga aaa atg tat tcg ctt aca tgg gct ctg caa tat gtt aat 602Ile Tyr Gly Arg Lys Met Tyr Ser Leu Thr Trp Ala Leu Gln Tyr Val Asn140 145 150cta ttc atg atc aac act ggc ctt atc att tta gct ggt caa gcc ctg aag 653Leu Phe Met Ile Asn Thr Gly Leu Ile Ile Leu Ala Gly Gln Ala Leu Lys155160 165 170gca ata tat gta tta ttt agg gac gat gga gtt cta aag cta ccc tac tgc 704Ala Ile Tyr Val Leu Phe Arg Asp Asp Gly Val Leu Lys Leu Pro Tyr Cys175 180185ata gca tta tct ggg ttt gtc tgt gct ctt ttt gcc ttt gga atc cct tat 755Ile Ala Leu Ser Gly Phe Val Cys Ala Leu Phe Ala Phe Gly Ile Pro Tyr190 195200ctg tct gct ctc agg att tgg ttg gga tta tca aca gtt ttc agt ctc atc 806Leu Ser Ala Leu Arg Ile Trp Leu Gly Leu Ser Thr Val Phe Ser Leu Ile205 210 215 220tat ata atg ata gca ttt gtc atg tcg ctt aga gat ggg att acc aca cct 857Tyr Ile Met Ile Ala Phe Val Met Ser Leu Arg Asp Gly Ile Thr Thr Pro225 230235gca aag gat tat act att cct gga tca cat tca gat aga atc ttc act acg 908Ala Lys Asp Tyr Thr Ile Pro Gly Ser His Ser Asp Arg Ile Phe Thr Thr
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1．一种稻脯氨酸转运蛋白基因，其包括体现在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，且编码体现在SEQ ID NO.1中的氨基酸序列。
2．一种由载体片段与稻脯氨酸转运蛋白基因连接获得的噬菌体和/或质粒，其中稻脯氨酸转运蛋白基因包括体现在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，且编码体现在SEQ ID NO.1中的氨基酸序列。
3．一种用于鉴定或分离稻脯氨酸转运蛋白基因的探针，所述探针包括一种与稻脯氨酸转运蛋白基因具有高度同源性的基因片段，所述稻脯氨酸转运蛋白基因包括体现在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，且编码体现在SEQ ID NO.1中的氨基酸序列。
4．一种用于构建稻脯氨酸转运蛋白基因的DNA，其中稻脯氨酸转运蛋白基因包括体现在SEQ ID NO.1中的核苷酸序列，且编码体现在SEQID NO.1中的氨基酸序列。
全文摘要
使用拟南芥脯氨酸转运蛋白基因cDNA作为探针,筛选从稻幼苗制备的cDNA文库。由此得到的阳性克隆经过亚克隆并通过限制性酶切处理检查其长度,并测定5’和3’末端的核苷酸序列,从而获得含有稻脯氨酸转运蛋白基因cDNA的克隆。测定此cDNA序列,并基于同源性检索结果,鉴定了与来源于拟南芥的一种基因显示氨基酸水平上的高度同源性(68.8%)的稻脯氨酸转运蛋白基因,它们在跨膜结构域(疏水性图分析)和表达模式(Northern分析)上十分相似。
文档编号C12N15/29GK1284561SQ00124140
公开日2001年2月21日 申请日期2000年8月17日 优先权日1999年8月17日
发明者五十岚由美子, 吉羽洋周 申请人:株式会社日立制作所