专利名称：拟南芥△1－吡咯啉－5－羧酸合成酶基因的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的启动子(下文中称为P5CS)。它可以用于利用基因重组来构建新植物，或用于使培养细胞再生以便生产有用物质。
众所周知，许多植物，包括盐生植物，在受到渗透压胁迫时能积累相适应的脯氨酸。这提示在植物器官中积累的脯氨酸能起到保持植物器官中的水分的作用。
在植物中，脯氨酸是由谷氨酸经P5CS酶和Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶(下文中称为P5CR)的作用产生的。在植物中脯氨酸积累在器官中，在处于干旱或渗透压胁迫等水分逆境时，这种情况意味着植物很难获得水分，P5CS的活性以及P5CS基因的表达水平会增强，然而，P5CR的活性和P5CR基因的表达水平不变并维持在一个低水平。这提示P5CS的表达控制着水分胁迫下植物中脯氨酸产生的一个限速步骤(Yoshiba等，植物杂志7751-760(1995))。另外，P5CS基因的表达不仅受到水分逆境比如干旱或渗透压胁迫的诱导，还受到一个脱落酸(ABA)依赖性途径的诱导。P5CS基因的表达在没有渗透压胁迫的情况下被阻遏(Yoshiba等，植物细胞生理学381095-1102(1997))。
常规的基于植物载体的启动子是一种来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的启动子，或者是来源于根癌农杆菌(这是一种土壤微生物)之Ti质粒的基因的启动子。这些启动子被用做使导入植物的基因有效地进行表达的启动子。
目前已建立了一种可用于将基因导入植物的技术。另外还构建了并应用了一种能使导入植物的基因有效地表达的启动子。上述基于植物载体的启动子是一个例子。
图1A代表性地显示了将启动子101与导入植物的基因结合在一起，从而由该启动子诱导基因的表达。
然而，在导入基因后，这些常规的启动子可使基因表达，而不区分植物的生长阶段或植物部位。对于植物生长来说，没有必要使基因普遍性地表达，而且普遍性的基因表达在很多情况下对植物生长无益而有害。因此，如果能根据所需控制基因表达的话，将对植物生长非常有用。这就是说，如果可能建成特异于某一生长时期的启动子、特异于一种植物组织的启动子或特异于一种环境条件的启动子，就能任意控制结合在该启动子下游的基因的表达，并仅在需要时使其表达。
图1B-
图1E代表性地显示了上述内容。
图1B显示基因102结合了一种应答环境条件的启动子103的情形。
图1C显示基因104结合了特异于一种植物组织的启动子105的情形。
图1D显示基因106结合了针对某一生长时期的启动子107的情形。此外，
图1E显示基因102、104和106顺序结合在一起并导入植物的情形，并且上述特异于每个条件的启动子顺序导入结合的基因的上游。
根据上文，本发明目的在于利用P5CS基因的启动子来设计一种启动子，P5CS基因的启动子能根据环境条件来调控基因表达，当环境条件变坏时启动基因表达，而环境条件恢复成良好时关闭基因表达。根据本发明设想的P5CS基因的启动子，能实现对有用基因的表达的诱导或阻遏这样的调控，其中的有用基因是连接在启动子下游、对环境胁迫有抗性的基因族。因此，根据土壤环境的变化，有可能使要控制的有用植物对环境胁迫有抗性。另外如果P5CS基因的启动子连接上一个能将植物组织染色的基因，就有可能根据环境条件监测变劣情况。这意味着可能获得一种能对环境胁迫作出反应的监测植物。
已知当受到水分胁迫时(这使植物变得难于获得水份)，比如干旱或盐度胁迫，许多植物在细胞中积累脯氨酸(一种氨基酸)。脯氨酸是由两种酶即P5CS “Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶”和P5CR“Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶”合成的。已知在水分胁迫下，P5CS是脯氨酸合成的限速步骤。此外还知道在水分胁迫，比如干旱或渗透压胁迫下以及给予脱落酸(ABA)时，P5CS基因的表达被迅速诱导，在消除这些胁迫和脱落酸(ABA)时，表达被迅速阻遏。
这样，发明人有了如下想法P5CS基因的启动子能根据环境条件诱导基因的表达。即在给予植物环境胁迫或消除这种胁迫的情况下，基因的表达受到P5CS启动子的控制。因此，对包含来自拟南芥的P5CS基因的启动子区域之基因组DNA进行了克隆和序列分析。
取出P5CS基因的启动子区域，结合于β-葡糖醛酸糖苷酶基因，然后将嵌合基因导入植物。已经证实导入了嵌合基因的植物中葡糖醛酸糖苷酶基因的表达在脱水胁迫或渗透压胁迫下经脱落酸(ABA)的生物合成被诱导。
P5CS基因的启动子在水分胁迫下能控制基因的表达得到了证实，这样就完成了本发明。这就是说，本发明提供了一种包含P5CS基因之启动子的DNA。另外本发明提供了一种包含上述DNA的用于植物的载体。
图1A-
图1E分别代表性地显示了用于植物的载体和基因表达之间的关系。
图2显示了序列表中SEQ ID NO1所描述的基因组DNA的前一部分的核苷酸序列，该部分序列根据其功能进行了重新编号。
图3显示了序列表中SEQ ID NO1所描述的基因组DNA的后一部分的核苷酸序列，该部分序列根据其功能进行了重新编号。
图4显示对转基因拟南芥植物中P5CS启动子及其缺失系列对脱水的反应性进行了分析，其中从上游(5’位点)删除了本实施方案的DNA，并将它与下游带有外源基因的载体结合在一起。
图5显示了质粒P5CS-Pro/GUS的基因图谱，该质粒是利用植物载体pBI101上包括的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和序列表中SEQ IDNO1所描述的P5CS启动子构建的(启动子结合在GUS的前面)。
图6A和6B的照片显示带有本发明所述启动子的基因的表达结果。
如上所述，本发明的DNA包含P5CS启动子。虽然对P5CS启动子的来源没有特殊限定，序列表中SEQ ID NO1所显示的本实施方案公开了克隆自拟南芥的P5CS基因及其启动子部分。
序列表中SEQ ID NO1显示了克隆自拟南芥P5CS的启动子区域之基因组DNA的核苷酸序列，及其第一个外显子。
为了便于解释，序列表中SEQ ID NO1所示的基因组DNA的核苷酸序列依照其功能进行了重新编号，如图2和图3所示。由于纸张的显示区狭窄，SEQ ID NO1所示基因组DNA的核苷酸序列的上游部分和下游部分分别示于图2和图3。在图3的核苷酸序列中，箭头指示的碱基对和符号+1表示转录起始位点，从+124 atg开始的碱基对表示编码P5CS蛋白第一个氨基酸的序列。在序列加有下划线的-30处识别出基因转录所需的TATA盒。应答ABA这种植物激素的ABRE顺式作用基元位于序列中加有下划线的-86处。另外，我们认识到存在一个预计转录因子(MYC和MYB)会与之结合的序列以及顺式作用基元CCAAT。在本实施方案中，将位于SEQ ID NO1所示基因组DNA的核苷酸序列中-1064到+70的DNA结合到载体上，以便使位于该DNA下游的外源基因表达。
图4显示对转基因拟南芥植物中P5CS启动子及其缺失系列对脱水的反应性进行了分析，其中从上游(5’位点)删除了本实施方案的DNA并将它与下游带有外源基因的载体结合在一起。图4中，从上游(5’位点)所缺失的某些DNA示于左侧，下游中外源基因的表达示于右侧。左侧显示的数字意味着以图2和图3中的序列表所显示的碱基对+1为基础的碱基对编号。顺式作用基元(CCAAT)、转录因子(MYC和MYB)、应答ABA(ABRE)的顺式作用基元以及TATA盒的位置分别用黑色矩形框、黑色和白色圈、白色矩形框以及垂直短线表示。脱水情况下的基因表达用白色条形图表示，调控下的基因表达用阴影条形图表示。
最上端的情形表示本实施方案所述外源基因的表达。
相邻的情形表示本实施方案所述外源基因的表达，其中从上游(5’位点)-621位处缺失了DNA。
上部第三个情形表示本实施方案所述外源基因的表达，其中从上游(5’位点)-504位处缺失了DNA。
自上面数第四和更后面的情形表示本实施方案所述外源基因的表达，其中从上游(5’位点)图中所示的数字处缺失了DNA。
通过比较第二和第三种情形外源基因的表达，表明可观察到由-625碱基对开始缺失的序列有表达，而由-504碱基对开始缺失的序列未表达。由此可以意识到启动子的活性存在于-625到-504之间的117个碱基对中。
因此，很显然序列表中SEQ ID NO1所描述的DNA中包含有本发明的启动子。
本发明提供了一种包含本发明上述DNA的用于植物细胞的载体。通过将序列表中SEQ ID NO1描述的以上DNA连接到这样一个质粒中可以得到本发明的载体，所述质粒中有一个用于在宿主细胞中自主复制的复制起始位点和一种合适的标记，优选是例如药物抗性。
用已知的植物载体pBI101、pBI121、pBI221(Clonetech公司)作为上述质粒。通过将序列表中SEQ ID NO1所描述的DNA连接至这些已知质粒的克隆位点可以制得本发明的载体。在下列实施方案中，通过将图2和图3所示-1064到+70位碱基对的DNA序列与上述pBI101中的HindⅢ-BamHⅠ酶切位点连接在一起，构建本发明的载体。
在本发明的载体中，一个编码所需蛋白质的结构基因连接于序列表中SEQ ID NO1所描述的DNA的下游序列。在本发明的下列实施方案中，得到了连接有以β-葡糖醛酸糖苷酶为结构基因的载体P5CS-Pro/GUS。
在拟南芥的情况中，本发明的DNA和载体如下排列。但本发明并不限于所述方法。
首先，利用拟南芥的全长P5CS1 cDNA作为杂交DNA探针，用来筛选拟南芥(Columbia生态型)基因组DNA文库(Clontech，Palo Alto，CA，美国)。然后从拟南芥(Columbia)中分离P5CS1基因启动子。
可以进行例如以下实验来检测启动子活性。将序列表中SEQ IDNO1描述的DNA的一部分(该部分可能包含启动子活性)连接于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因的上游。天然情况下植物中不存在GUS，通过定量分析由4MU的反应物产生的强荧光可检测GUS，所述反应物是一种4-甲基伞形酮(4MU)与结合了葡糖醛酸形成的底物4MUG反应的物质(Jefferson等，EMBO杂志，6(13)3901-3907(1989))。开花后立即利用根癌农杆菌通过真空渗入将P5CS基因的启动子和GUS基因形成的重组质粒导入花中(Bechtold)等，CRAcad.Sci.Ser.ⅢSci.Vie.3161194-1199(1993))。使导入了质粒的植物生长，抽穗并收获。将收获的种子播种在发芽培养基上，该培养基中含有用于筛选载体的合适的标记(包括药物抗性)，通过种子是否萌发对植株进行挑选。
例如如下挑选植物个体。在包含本发明所述启动子的DNA与包含GUS基因的pBI101连接在一起的情况下，选择是基于植物对卡那霉素的抗性而进行的。由于pBI101包含一个NTP11基因，当植物中产生该酶时，植物会对卡那霉素有抗性。因此能在有卡那霉素的情况下生长或萌发的植物，很可能有P5CS基因的启动子和GUS基因形成的嵌合基因。这样，在脱水胁迫或高盐胁迫下在如上挑选的整株植物中都会表达GUS基因。
根据本发明所述的P5CS基因的启动子，有可能控制基因的表达，从而使其表达仅在来自外界的环境胁迫，尤其是水分胁迫的情况下被诱导。年幼的植物器官中基因表达旺盛，而这些器官对环境胁迫的抵抗力弱，因此建议通过将启动子和能保护年幼植物器官免受环境胁迫的外源基因连接在一起，可以提供能有效抵抗环境胁迫的植物。
通过下面的一个实施方案来具体描述本发明，但发明并不限于该方案。实施方案在Sambrook等的“分子克隆，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)”中描述的方法的基础上操作。实验首先，利用全长P5CS1 cDNA(植物杂志7751-760(1995)，Yoshiba等)作为探针经噬斑杂交对拟南芥，Columbia生态型(Clontech，PaloAlto，CA，美国)的基因组DNA文库进行筛选。将7个阳性基因组DNA纯化。这些克隆经限制酶EcoRⅠ和HindⅢ消化成小DNA片段。
将这些DNA片段亚克隆至pSK载体中，用DNA测序仪(373A型；Applied Biosystems，CA，美国)通过循环测序法确定其序列。这样得到一个含有P5CS基因3’端第一个外显子的3492bp的片段。序列表中SEQ ID NO1所示基因组DNA的核苷酸序列是P5CS基因的启动子区域(包含第一个外显子)的序列。
接下来，为了检测P5CS基因的启动子的活性，将P5CS基因的启动子区经PCR法扩增，并连接至GUS基因。即，将图2和3所示的从编号-1064到+70的1134个碱基对序列的DNA片段经PCR法扩增，其中具有HindⅢ的限制酶识别位点的引物结合到它的5’端，具有BamHⅠ的限制酶识别位点的引物结合到它的3’端。此后，扩增得到的DNA片段、质粒BI101分别在HindⅢ和BamHⅠ的限制酶位点被酶切。通过将包含P5CS基因的启动子之DNA片段P5CS-P在以上限制位点连接，构建质粒P5CS-Pro/GUS。质粒P5CS-Pro/GUS的基因图谱示于图5。
此外，为了确定本发明所述启动子的活性位点，在转基因拟南芥植物中制备了缺失系列，其中从上游(5’位点)缺失了本实施方案所述DNA，并与下游带有GUS基因的载体结合在一起。利用转基因植物确定GUS活性。
正如上文所述，图4显示了与包含导入的启动子部分(图4右侧)之DNA片段的长度对应的GUS活性(图4左侧)。为了分析GUS基因的活性，在无菌条件下培养转基因拟南芥植物，并于结籽前在不损害根的情况下从培养基中拔出植物。将拔出的转基因植物于脱水条件下置滤纸上，并通过Richard等的方法进行分析。具体来说，是通过测量4MU的荧光强度来进行分析，其中所述4MU是P5CS基因产生的酶降解4MUG的产物。
根据图4显示的结果，暗示了本发明的启动子的活性部分存在于bp编号-621和-504之间的碱基对。实验结果的实施例图6A和6B给出的照片显示的是用本发明所述启动子表达GUS基因时的结果。该实施例显示的是转基因拟南芥植物的有关实验结果，其中该植物中导入了质粒P5CS-Pro/GUS，后者上结合有包括从-1064位到+70位共1134个碱基对序列的DNA片段的启动子。图6A给出的是非脱水条件下植物的相关结果，图6B给出是脱水条件下24小时中植物的相关结果。二者均采用Jefferson等人的方法(EMBO J.6卷，133901-3907(1989))进行检测，其中用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(X-Gluc)将GUS基因表达部分染成蓝色，并加以检测。图6A和6B不是彩色照片，所以它们只表现出黑白两色对比。但是，与图6B中显示的非脱水条件下植物相比，图6B显示的脱水条件下植物为黑色。这就意味着该植物在脱水条件下表达GUS基因。另外值得注意的是这种表达在植物的嫩叶及根部很强。这就是说，由于在植物的年轻器官中表达较强，就意味着如果将一个胁迫抗性基因结合到启动子上，就可有效保护有用植物免受环境胁迫。另外，还能够培养出可在严酷条件下生长的植物。
类似地，高盐处理(将植物浸在250mM NaCl中)或ABA处理(植物被浸在100μM ABA中，该条件近似于脱水)的条件下也能够观察到GUS基因的表达。
另外，如果将一个能够发光的基因结合在本发明所述启动子的下游并导入植物中，即有可能对环境状况(情况变劣时)进行监测。
在本发明领域内众所周知，即使对预知功能的DNA片段进行少数碱基对的替代、缺失或添加，改变的DNA片段仍可与原始DNA片段一样行使上述预知功能。因此，本发明中，如果序列表中SEQ ID NO.1所示DNA片段发生了少数碱基对的替代、缺失或添加，那么改变后的DNA片段仍可发挥与上述启动子相同的作用，因而改变后的DNA也包括在本发明的权利要求中。
根据本发明，提供了可用于植物的新的DNA片段以及新型载体，载体中具有新DNA片段，所述DNA片段中包含一个能根据水分胁迫(环境逆境)来调控基因表达的启动子。导入了本发明提供的新型载体的植物可在缺水的条件下表达基因。整个植株中都能观察到这种基因表达，而且在根冠、侧根以及花等幼嫩器官中有着更强表达。这就意味着有用植物可以免受环境胁迫，并能够在恶劣的环境中生长。
序列表110 HITACHI，LTD120拟南芥吡咯啉羧酸合成酶启动子160 1210 1211 1470212 DNA213 拟南芥220221 启动子300308 AB022784309 1999年1月28日400 1ttttgcccag ttatgattta taaaccctac aatttagtat caaagttttt atttaaaatt 60ctgaatctga cattaatgat atctggctca tttacagagc caatgagatg gatgatgttc 120gaaactggat tggccattat ttaccttttt tttatctgga gaatcctcga ttggcacaaa 180cattatcata ttagccttta gaaattggat tggctaatca cacatttata tatattctta 240ccaaaataaa tcacctctcc cgtaattgaa aaatatctaa atactgtaag tctgaaaaaa 300ttcacaaggg tccgaagaaa gaaggaaata tctaagcatc attaataaac tatctgtaac 360ctgagggaaa atcatttcat gttgaaatat gtggatttgg aagttttata atctatctga 420atttgtgaaa tttgataaca agtaagattt gtttcttaac acaaatctaa aatttgtttt 480ctaattaggt ttgagagaga gagagaaaga aacgctttgt atgatacaca tctaggctat 540gaatgaaggc ccagcggaca aagcggtcta aatttgtctg cggttttagt cccaatcctc 600atttttctgg ggtggacaat aaaccgctgc ggaccaagtt tatttgtatg taaaaacggt 660ccgcagatgg tccgaaacga ttttcttcta tttttttaag tccagaccac tgcggactat 720aattgatgaa tgataaataa aaaacggtct gaaccgttga cggttttgtc cgccccaacc 780gccataacca ttcaaacccc taattatttc atcagataac attatacact aataatcatt 840gcactcaaat atgtcacaca atcatataat aaaataataa caatgattaa aatgaaaaaa 900ttgttgtggc gccgcataaa atagaaatcg tgagagacga cgtcatctaa aaattgcctt 960gctgtccact tttcactttg tcctctcttc tcatctccgt tcacttccac ggcgtttcct 1020cagccgccga ttttatttat ttcccaaaat acccatcacc tatagcgcca caatcctcta 1080catcacaccc taatctcatt accatacacc acccaacgaa cacgcgccac ttcatttgtt 1140agtatctaaa ataccaaacc tacccttagt tccacacgtg gcgtttcctg gtttgataac 1200agagcctgag tctctggtgt cgctggtgtt tataaacccc ttcatatctt ccttggtgat 1260ctccaccttt ccctcacctg atatttattt tcttacctta aatacgacgg tgcttcactg 1320agtccgactc agttaactcg ttcctctctc tgtgtgtggt tttggtagac gacgacgacg 1380ata atg gag gag cta gat cgt tca cgt gct ttt gcc aga gac gtc aaa 1428Met Glu Glu Leu Asp Arg Set Arg Ala Phe Ala Arg Asp Val Lys15 10 15cgt atc gtc gtt aag gtt cgtt gagatacgtt cgcattttca1470Arg Ile Val Val Lys Val
权利要求
1．包含Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的启动子的DNA片段。
2．权利要求1的DNA片段，其中所述DNA来源于拟南芥。
3．权利要求1的DNA片段，其中序列表的SEQ ID NO1中的No.649-No.1470描述了所述DNA。
4．权利要求2的DNA片段，其中序列表的SEQ ID NO1中的No.649-No.1470描述了所述DNA。
5．一种包括权利要求1中描述的DNA片段的植物载体。
6．一种包括权利要求2中描述的DNA片段的植物载体。
7．一种包括权利要求3中描述的DNA片段的植物载体。
8．一种包括权利要求4中描述的DNA片段的植物载体。
9．一种其基因能根据环境状况将植物组织染色的监测植物，该植物导入了权利要求1中描述的DNA片段。
10．一种其基因能根据环境状况将植物组织染色的监测植物，该植物导入了权利要求2中描述的DNA片段。
11．一种其基因能根据环境状况将植物组织染色的监测植物，该植物导入了权利要求3中描述的DNA片段。
12．一种其基因能根据环境状况将植物组织染色的监测植物，该植物导入了权利要求4中描述的DNA片段。
全文摘要
利用全长P5CS1cDNA作为探针经噬斑杂交对拟南芥Columbia生态型的基因组DNA文库进行筛选。纯化阳性克隆。将这些克隆作亚克隆,并通过循环测序法确定其序列。然后将系列缺失的DNA连接上GUS基因并导入拟南芥。利用转基因拟南芥植物,分析确定GUS基因活性,查出P5CS1启动子的活性区。清楚地表明在水分胁迫下,拟南芥的P5CS1启动子能调控基因的表达。
文档编号C12N15/09GK1284562SQ0012414
公开日2001年2月21日 申请日期2000年8月17日 优先权日1999年8月17日
发明者吉羽洋周 申请人:株式会社日立制作所