专利名称：因子Ⅸ/因子lxa－抗体和抗体衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及因子IX/因子Ixa-抗体和抗体衍生物。
血块(血栓)是由一系列称作凝血级联的酶原激活作用形成的。在这一酶级联过程中，每种所述酶原(称作因子)的活化形式催化下一酶原的激活作用。血块是血液组分在血管表面的沉积物，主要由凝集的血小板和交联的纤维蛋白组成。纤维蛋白的形成是通过纤维蛋白原有限的蛋白水解形成血栓而完成的。血栓是凝血级联的最终产物。(K.G.Mann，血液，1990，76卷，1-16页)由活化的因子IX(FIXa)和活化的因子VIII(FVIIIa)形成的复合物对因子X的激活作用是凝血作用的关键步骤。这一复合物中的组分缺乏或它们的功能失调与被称作血友病的凝血疾病相关(J.E.Sadler &E.W.Davie血友病A，血友病B和威勒布兰特病，在G.Stamatoyannopoulos等(编)血液疾病的分子基础W.B.SaundersCo.，费城，1987，576-602页)。血友病A是指因子VIII活性(功能性的)缺失，而血友病B以因子IX活性缺失为特征。目前通过施用因子VIII浓缩物的置换疗法对血友病A进行治疗。但约20％到30％的血友病A病人产生因子VIII的抑制因子(即针对因子VIII的抗体)，因此施用因子VIII制剂的效果受到抑制。治疗产生因子VIII抑制剂的病人十分困难而且具有危险性，目前针对这种病人只有有限的治疗手段。
对于因子VIII抑制剂水平较低的病人，可以通过施用高剂量的因子VIII来中和针对因子VIII抗体，但这是非常昂贵的。当所施用的因子VIII的量高于中和所述的抑制剂抗体所需的量时才产生止血作用。在许多情况下，可以先进行脱敏作用，然后再次进行标准的因子VIII治疗。这种高剂量的因子VIII治疗需要大量的因子VIII，即耗时又有严重的过敏性副作用。供选择地，这种治疗也可以用猪的因子VIII分子进行。
一种更高投入的方法是利用凝集素通过体外免疫吸附去除因子VIII抑制剂，所述的凝集素与免疫球蛋白(蛋白A，蛋白G)或固定的因子VIII相结合。因为在这种治疗过程中病人必须与单采血成分的机器相连，所以这种治疗也给病人造成沉重的负担。用这种方式也不可能治疗急性出血。
目前，可取的治疗手段是施用活化的凝血酶原浓缩复合物(APCC)例如FEIBA和AUTOPLEX，其适用于治疗急性出血的病人，甚至是病人存在高因子VIII抑制剂滴度的情况下(DE 3127318)。
在凝血的血管内系统中，最后的步骤是活化因子X。这一反应是通过将因子VIIIa结合到因子IXa以形成由因子IXa、VIIIa和X和磷脂组成的“tenase”-复合物来激活的。没有结合FVIIIa，FIXa则不表现或仅表现出微弱的对FX的酶活性。
在最近的几年中，鉴定了一些可能的因子VIIIa与因子IXa结合位点，并且表明结合于这些区域的抗体或多肽抑制FIXa的活性(Fay等，生物化学杂志，1994，269卷，20522-20527页，Lenting等，生物化学杂志，1996，271卷，1935-1940页，Jorquera等，循环，1992，86卷，摘要2725)。以抑制血栓形成为目的通过使用单克隆抗体可以实现对凝集因子，如因子IX，的抑制(WO97/26010)。相反的效应，即由因子IXa介导的因子X激活作用的升高如Liles D.K.等所述(血液，1997，90卷，增刊1，2054)，其是通过VIII肽(氨基酸698-712)与因子IX结合。然而这种效果仅在缺乏因子VIIIa时出现，而当因子VIIIa存在时，因子IXa/因子VIIIa-介导的因子X的裂解被这种肽所抑制。发明简述鉴于在治疗血友病人时可能出现的危险和副作用，需要一种有效地治疗FVIII抑制病人的疗法。因此，本发明的一个目的是提供一种治疗凝血疾病的制剂，其对因子VIII抑制病人特别有益。
依照本发明，这一目的是通过使用针对因子IX/因子IXa的抗体或抗体衍生物来实现的，其具有因子VIIIa-辅因子活性或因子IXa-激活活性并导致因子IXa促凝血活性提高。令人惊讶的是，本发明的因子IX/因子IXa-激活抗体和抗体衍生物的作用不受所存在的抑制物，如针对因子VIII/因子VIIIa的负面影响，相反，在这种情况下因子IXa的促凝血活性还有所提高。
本发明进一步的有益之处在于施用如本发明所述的制剂，在因子VIII或因子VIIIa不存在时，甚至在FVIII抑制病人中也可以迅速凝血。令人惊讶的是，这些试剂在因子VIIIa存在下也有效。
如本发明所述的抗体和抗体衍生物具有FVIII-辅因子样活性，在温育2h后进行的FVIII分析(例如，COATEST分析或免疫层析检测)中表现出背景(背静值)和测定值之间的比率至少是3。对这一比率的计算可以是，例如依照下述方案完成温育两小时后，抗体测定值(OD405)-试剂的空白值≥3小鼠-IgG测定值(OD405)-试剂空白值依照本发明的抗体优选具有体外半寿期为至少5天，更优选为至少10天，更优选至少20天。
依照本发明的另一方面提供包含针对因子XI/因子IXa的抗体和抗体衍生物和药物学上可接受的载体物质的制剂。而且，本发明的制剂还可以包括因子IX和/或因子IXa。
本发明的另一方面是应用所述的抗体和抗体衍生物提高因子IXa的酰胺裂解活性。
图1筛选杂交瘤培养物上清液FVIII-样活性的结果。对由融合实验#193，#195，#196所得的预选克隆进行产色分析检测。
图2在主平板的杂交瘤培养物上清液中筛选IgG介导的因子VIII样活性的结果。
图3克隆193/C0的亚克隆，即第一轮克隆的结果。
图4起始克隆193/C0的杂交瘤培养物的产色的FVIII样活性和因子IX-ELISA反应性之间的比较。
图5对一些主克隆和亚克隆的产色活性测定结果。
图6A与人FVIII，TBS缓冲液，细胞培养基相比，抗FIX/FIXa抗体193/AD3和196/AF2的FVIII样活性。由升高的光密度可以判断出在迟滞期后，两抗体均引起产色底物裂解。
图6B因子VIII，196/AF1，198/AC1/1和小鼠IgG的产色活性比较。
图7A比较在添加或不添加因子Xa特异抑制剂的情况下，因子VIII和196/AF2的因子Xa产生动力学。
图7B比较在添加或不添加Xa特异抑制物Pefabloc Xa的情况下，因子VIII，小鼠-IgG和抗因子IX/IXa-抗体198/AM1和196/AF2的因子Xa产生动力学。
图8A在磷脂，FIXa/FX和钙离子存在和不存在的情况下，纯化的抗因子IX/IXa-抗体198/AC1/1的因子VIII-样活性依赖性测定。
图8B在磷脂，Ca2+，FIXa/FX存在下，抗-FIXa-抗体196/AF1对Fxa产生的依赖性测定结果。
图8C由非特异性的小鼠IgG抗体产生Fxa的结果。
图9用图示表示在使用不同浓度的抗因子IX/IXa-抗体193/AD3进行APTT分析中，因子VIII-缺陷血浆的凝集时间。
图10A在因子IXa存在下，抗体193/AD3导致因子VIII缺陷血浆凝集时间缩短。
图10B在因子IXa-和因子VIII-抑制剂存在下，由抗体193/AD3引起的剂量依赖的凝固时间缩短。
图11在人FIXαβ存在或不存在下，抗体198/A1，198/B1和198/AP1的产色活性。
图12扩增小鼠抗体可变的重链基因所用的引物序列。
图13扩增小鼠抗体可变的轻链(kappa)基因所用的引物序列。
图14杂交瘤细胞系193/AD3(SEQ.ID.NOs.81和82)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
图15杂交瘤细胞系193/K2(SEQ.ID.NOs.83和84)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
图16杂交瘤细胞系198/AB2(SEQ.ID.NOs.85和86)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
图17杂交瘤细胞系198/A1(SEQ.ID.NOs.87和88)的scFv的DNA和衍生的蛋白序列。
图18在2.9nM人FIXa存在下，肽A1/3产色的FVIII-样活性。肽A1/3的杂乱变型肽A1/5不引起任何Fxa产生。
图19肽A1/3的产色FVIII-样活性对人FIXa存在的依赖性。在缺乏人FIXa时，肽A1/3不引起任何Fxa产生。缓冲液对照，普通咪唑缓冲液称为IZ。
图20显示精氨酸残基的偏光力不在肽A1/3-rd和A1/3-Rd-srmb的产色活性中起重要作用。
图21表示向反应混合物中添加2.4μM肽B1/7导致可测定出的Fxa产生。
图22表示添加FX-特异性抑制剂导致反应的显著缩减。
图23表示载体pBax-IgG1。
图24表示在抗体198/B1(图24A)和IgM抗体198/AF1(图24B)存在下，FIXa的酰胺裂解活性的提高。
图25表示23nM人FIXa存在下，抗体198/A1 Fab片段产色的FVIII-样活性。完整抗体198/A1和7.5pM FVIII用作阳性对照。缓冲液对照(IZ)用作阴性对照。
图26表示198AB2 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白(表达载体pDAP2-198AB2#100的ORF)的核酸和氨基酸序列，(SEQ.ID.NOs.89和90)。
抗体198/AB2(198/AB2是与198/B1完全相同的亚克隆)的VL和VH结构域基因来自在实施例10中描述的相应杂交瘤细胞。VH-基因的PCR产物经SfiI-AscI消化，VL基因的PCR产物由AscI和NotI消化。VH和VL基因通过AscI位点连接并插入经SfiI-NotI消化的载体pDAP2中(Kerschbaumer R.J.等，免疫学技术2，145-150，1996；GeneBank登记号U35316)。PelB前导序列胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)果胶酸酯裂解酶B的前导序列，His-标记，用于金属离子层析的组氨酸标记。
图27表示在2.3nM人FIXa存在下，两抗体198/B1(亚克隆AB2)scFv片段-碱性磷酸酶融合蛋白(198AB2#1和198AB2#100)产色的FVIII-样活性。7.5pM FVIII用作阳性对照。
图28 pZip198AB2#102(SEQ.ID.NOs.91和92)的氨基酸和核苷酸序列。
图29mAB#8860 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白(载体pDAP2-8860scFv#11，(SEQ.ID.NOs.93和94)和核苷酸序列和氨基酸序列。抗体#8860的VL和VH结构域基因来自在实施例10中描述的相应杂交瘤细胞。VH-基因的PCR产物经SfiI-AscI消化，VL基因的PCR产物由AscI和NotI消化。VH和VL基因通过AscI位点连接并插入经SfiI-NotI消化的载体pDAP2中(Kerschbaumer R.J.等，免疫学技术2，145-150，1996；GeneBank登记号U35316)。
图30是mAB#8860 scFv-亮氨酸拉链融合蛋白(小抗体；载体p8860-Zip#1.2，(SEQ.ID.NOs.95和96)的核苷酸序列和氨基酸序列。scFv片段基因来自mAB#8860，并从载体pDAP2-8860scFv#11转换到经SfiI-NotI消化的质粒pZipl上(Kerschbaumer R.J.等，分析生物化学249，219-227，1997；GeneBank登记号U94951)。
图31示出在2.3nM人FIXa存在下，198/B1(亚克隆AB2)小抗体198AB-Zip#102的产色的FVIII-样活性。4.8pM FVIII用作阳性对照，无关的小抗体(8860-Zip#1.2)和plain反应缓冲液(IZ)用作阴性对照。
图32是质粒pMycHis6的示意图。
图33是质粒pMycHis6与载体pCOCK(SEQ.ID.NOs.97和98)不同的部分的核苷酸和氨基酸序列。载体pMycHis6是通过用NotI和EcoRI切割载体pCOCK(Engelhardt等，1994，生物技术，1744-46)并插入下述寡核苷酸序列mychis6-co5′ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3′(SEQ ID.No.79)和mycchis-ic5′aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctcttct gagatgagtttttgttctgc(SEQ.ID.No.80)构建的。
图34的198AB2 scFv(与c-myc-标记和His6-标记连接)表达载体pMycHis6198AB2#102的ORF的核苷酸序列和氨基酸序列。载体pMycHis6是通过用NotI-EcoRI切割载体pCOCK(Engelhardt O.等，生物技术17，4446，1994)并插入下列退火的寡核苷酸(5′-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3′(SEQ.ID.No.103)和5′-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC3′(SEQ.ID.NO.104))而构建的。所得的载体命名为pMycHis6，经SfiI-NotI切割，scFv198AB2基因由载体pDAP2198AB2#100转换到这一载体中。
图35是与c-myc-标记和His6-标记相连接的mAB#8860 scFv(载体p8860-M/H#4c，SEQ.ID.NOs.101和102)的核苷酸序列和氨基酸序列。质粒pMycHis6是经SfiI和NotI切割，再将pDAP2-8860scFv#11(参见图29)中编码scFv8860#11蛋白的DNA序列插入其中，从而获得质粒p8860-M/H#4c。
图36是在2.3nM人FIXa存在下，198/B1(亚克隆AB2)scFv片段(MycHis-198AB2#102)产色的FVIII-样活性。4.8pM FVIII用作阳性对照，无关的scFv(8860-M/H#4c)和普通反应缓冲液(IZ)用作阴性对照。
抗体和抗体衍生物本发明还包括编码本发明的抗体和抗体衍生物的核酸，表达载体，杂交瘤细胞系和相关的生产方法。抗体是具有特异氨基酸序列的免疫球蛋白分子，其仅与诱导其合成的抗原(或各自的免疫原)相结合，或者与上述抗原相似的抗原(或免疫原)相结合。每一免疫球蛋白分子由两种类型的多肽链组成。每个分子由大的，相同的重链(H链)和两条也相同的轻链(L链)组成。多肽由二硫桥和非共价键相连。在体内，所述的重链和轻链由不同的核糖体合成，在细胞内装配，再作为完整的球蛋白分子分泌(Roitt I.等，免疫学，第二版1989)。
本发明的抗体和抗体衍生物及由其衍生的有机化合物包括人和动物单克隆抗体或其片段，单链抗体和其片段，小抗体，双特异性抗体，双抗体(diabodies)，三抗体(triabodies)，或其二聚体，寡聚体或多聚体。还包括肽模拟物(peptidomimetics)或由本发明的抗体所衍生的肽，例如它们包括一个或多个CDR区，优选CDR3区。
还包括基于结构活性连接的人单克隆抗体和肽序列，它们是通过人工模式化程序生产的(Greer J.等，医药化学杂志，1994，37卷，1035-1054页)。
所用的术语，因子IX/IXa激活的抗体和抗体衍生物还可以包括由宿主细胞中改变了的免疫球蛋白编码区表达的蛋白，例如“专门修饰的抗体”如合成抗体，嵌合抗体，人源化抗体，或其混合物或抗体片段，其部分或全部缺失所谓的恒定区，例如Fv，Fab，Fab′或F(ab)′2等。在这些专门修饰的抗体中，例如部分轻链和/或重链可以被替代。这样的分子可以例如包含由人源化的重链和未经修饰的轻链(或嵌合轻链)组成的抗体，反之亦然。所用术语Fv，Fc，Fd，Fab，Fab′或F(ab)2依本领域所公知的描述(Harlow E.和Lane D.，在″抗体，实验操作手册″，冷泉港实验室，1988)。
本发明还包括来自直接针对因子IX/因子IXa并可引起因子IXa促凝血活性提高的单克隆抗体(mAb)的Fab片段或F(ab)2片段的应用。优选地，异源构架区和恒定区选自人免疫球蛋白类型和同种型，例如IgG(亚型1到4)，IgM，IgA和IgE。在免疫反应过程中，可能发生免疫球蛋白种类的改变，例如由IgM到IgG的转变；其中恒定区发生了交换，例如由μ转变为γ。类型的转变也可以由本领域所公知的遗传工程的方法通过定向的方式引起(“定向类型转变重组”)(Esser C.和Radbruch A.，免疫学年评，1990，8卷，717-735页)。但是，本发明的抗体和抗体衍生物并不需要包括独有的人免疫球蛋白序列。
在一特定的实施方案中，人源化的抗体包括小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDRs)，其插入到所选择的人抗体序列构架区内。但是也可以用人CDR区。优选地，将人重链和轻链中的可变区域通过一个或多个CDR的交换进行专门的改变。也可以用全部六个CDRs或少于六个CDRs的不同组合。
本发明的人源化抗体优选具有人抗体或其片段的结构，并且包括治疗用途所需特性的组合，例如对于治疗病人凝血疾病，优选因子VIII抑制剂病人。
嵌合抗体不同于人源化抗体是由于其包括完整的可变区，该可变区含非人源的重链和轻链构架区，并与人免疫球蛋白两条链的恒定区相结合。例如可以生产由鼠和人序列组成的嵌合抗体。依照本发明，所述的抗体和抗体衍生物可以是单链抗体或小抗体(例如，与富含脯氨酸和寡聚结构域，例如Pluckthun A.和Pack P相结合的scFv片段，免疫学技术，1997，3卷，83-105页)或单链Fv(sFv)其在一个单一的多肽链中整合全部的抗体结合区。例如，单链抗体可由下述方式构成，即将V-基因与作为接头序列构建的寡核苷酸相连，然后将第一个V区的C末端与第二个V区的N末端相连接，例如以VH-接头-VL或VL-结头-VH的方式，其中VH和VL都代表N末端结构域(Huston JS等，Int.免疫学综述，1993，10卷，195-217页；Raag R.和Whitlow M.，FASEB J.，1995，9卷，73-80页)。可以用作接头序列的蛋白，例如长度达150，优选长度达80更优选长度达40。考虑到氨基酸的柔性，特别优选包含甘氨酸和丝氨酸的接头序列，考虑到可溶性优选包含谷氨酸和赖氨酸的接头序列。氨基酸的选择一方面依照免疫原性和稳定性的标准，同时也根据这些单链抗体是否适合于生理或工业上应用(例如免疫亲和层析)。所述单链抗体也可以聚合物的形式存在，如三聚体，寡聚体或多聚体。所述的接头序列也可以缺失，所述的VH和VL链直接相连。
双特异性抗体是大分子，异源双功能交联体，在一个分子内有两种不同的结合特异性。这类抗体包括，例如，双特异性(bs)IgGs，bs IgM IgAs，bsIgA-二聚体，bs(Fab′)2，bs(scFv)2，双抗体，和bs bis Fab Fc(Cao Y.和Suresh M.R.，生物偶联化学(Bioconjugate Chem.)，1998，9卷，635-644页)。
通过肽模拟物(peptidomimetics)了解低分子量蛋白组分，其模拟天然肽组分的结构或在邻近的肽序列中诱导特异结构形成的模板的结构(Kemp DS，生物技术导向，1990，249-255页)。所述的肽模拟物可以，例如来自CDR3结构域。对一个给定的肽序列进行系统的突变分析，即通过丙氨酸或谷氨酸扫描突变分析，鉴定对凝血活性至关重要的肽残基。另一种可能提高特定肽序列活性的方法是应用肽文库并结合高产率的筛选。
所用的术语抗体和抗体衍生物也包括通过分析有关结构-活性相关性的数据所获得的试剂。这些化合物也可以用作肽模拟物(Grassy G.等，自然生物技术(Nature Biotechnol)，1998，16卷，748-752页；Greer J.等，医药化学杂志，1994，37卷，1035-1054页)。
本发明中表达抗体或抗体衍生物的杂交瘤细胞的实例依照布达佩斯条约提交了保藏，于1999年9月9日提交的保藏获得的编号为90924(#198/A1)，99090925(#198/B1)和99090926(#198/BB1)，于1999年12月16日提交的保藏，保藏号为99121614(#193/AO)，99121615(#196/C4)，99121616(#198/D1)，99121617(198/T2)，99121618(#198/G2)，99121619(#198/AC1)和99121620(#198/U2)。生产方法本发明的抗体可由本领域所公知的方法制备，例如通过常规的杂交瘤技术，或通过噬菌体显示文库的方法，免疫球蛋白链混排或人源化技术(Harlow E.和Lane D.，抗体，实验操作手册，冷泉港实验室，1988)。本发明的抗体或抗体衍生物可以，例如通过传统的杂交瘤技术生产(抗体，实验操作手册，冷泉港实验室，1988，编.Harlow和Lane，148-242页)。依照本发明，可以利用人或非人种动物，例如牛，猪，猴，鸡和啮齿动物(小鼠，大鼠)。通常可以利用例如，具有免疫活性的Balb/c小鼠或FIX-缺陷小鼠，(因子IX-缺陷小鼠可由Chapel Hill，北卡罗来纳州大学，DarrelStafford博士处获得)。可以用例如，因子IX，因子IXaa或充分活化的因子IXap，或其片段进行免疫。
以在所述杂交瘤上清液中的抗体或抗体衍生物可结合因子IX/因子IXa并提高因子IXa促凝血活性为目的筛选杂交瘤。通过本领域已知的方法测定因子VIII-样活性，例如.显色分析，来证明所述促凝血活性的提高。
或者，也可以通过重组生产方法生产本发明的抗体和抗体衍生物。其中，本发明的抗体的DNA序列可由公知的技术确定，全部的抗体DNA或其中的一部分可在合适的系统中表达。可应用的重组生产方法包括噬菌体显示，合成的或天然文库，在已知的表达系统中或转基因动物中表达抗体蛋白(Jones等，自然，1986，321卷，522-525页；肽和蛋白的噬菌体显示，实验操作手册，1996，.Kay等编，127-139页；美国专利号4,873,316；Vaughan T.J.等，自然生物技术(Nature Biotechnology)1998，535-539页；Persic L.等，基因，1997，918页；Ames R.S.等，免疫学方法杂志，1995，177-186页)。
通过重组方式产生的抗体的表达，可以利用传统的表达载体，例如细菌载体，如pBr322及其衍生物，pSKF或真核载体，例如pMSG和SV40载体。这些编码抗体的序列可以带有调节序列，所述调节序列调节复制，表达和从宿主细胞中分泌。这些调节序列包括启动子，例如CMV或SV40和信号序列。
所述的表达载体还可以包括筛选和扩增标记，例如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸腺嘧啶核苷-激酶等。
所用的载体组分，例如筛选标记，复制子，增强子等可以是商购的也可以是通过常规方法制备的。构建所述载体用于在各种细胞培养物中表达例如，哺乳动物细胞，如CHO，COS，成纤维细胞，昆虫细胞，酵母或细菌，如大肠杆菌。优选地，在这些细胞中，所表达的蛋白可以进行理想的糖基化。特别优选的是在CHO细胞或SK-Hep中表达的载体pBax(参见
图17)。
可通过本领域公知的方法生产Fab片段或F(ab)2片段，例如，通过蛋白水解酶，如木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶切割单克隆抗体，或通过重组方法。这些Fab和F(ab)2片段也可以通过噬菌体显示文库制备(Winter等，1994，免疫学年评，12433-455)。
所述的抗体衍生物也通过本领域已知的方法制备，例如通过分子模拟，例如from Grassy G.等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)，1998，16卷，748-752页，或Greer J.等，医药化学杂志，37卷，1035-1054页，或Rees A.等，″蛋白结构预测实用方法″，Sternberg M.J.E.编，IRL出版社，1996，7-10章，141-261页。
所述抗体和抗体衍生物的纯化也可以通过本领域所公知的方法进行，例如，通过硫酸铵沉淀，亲和纯化(蛋白G Sepharose)，离子交换层析，或凝胶层析。下述的方法可以用作检测方法，以说明本发明的抗体或抗体衍生物与因子IX/因子IXa结合，提高因子IXa的促凝血活性或具有因子VIII-样活性。一步凝血检测(Mikaelsson和Oswaldson，Scand.血液学杂志，增刊.，33，79-86页，1984)或显色试验，例如COATEST VIIIC，(Chromogenix)或免疫着色(Immunochrom)(IMMUNO)。原则上，所有用于确定因子VIII活性的方法均可使用。作为检测的空白值对照例如，可以用非特异性小鼠-IgG抗体。
本发明的抗体和抗体衍生物适合应用于治疗凝血疾病，例如在对血友病A，因子VIII抑制剂病人等的治疗中。可以通过任何适当的方法对病人施用有效的医疗制剂进行治疗，例如通过口服，皮下的，肌内的，静脉内的或鼻内的方式。
本发明的医疗制剂可以作为制剂生产，所述的制剂包含作为活性成分的足量的抗体或抗体衍生物及药学上可接受的载体。这些制剂可以是液体形式也可以是粉末形式。而且，本发明的制剂也可以包括不同抗体，其衍生物和/或其所产生的有机化合物的混合物，和由抗体和因子IX和/或因子Ixa所组成的混合物。因子IXa可以因子IXaα和/或因子IXaβ的形式存在。液体载体物质的例子如，生理盐水。所述的溶液是无菌的，可通过常规的方法进行灭菌。
本发明的抗体和抗体衍生物可以冷冻干燥的形式储藏，施用前悬浮于适当的溶剂中。已证明这种方法对常规的免疫球蛋白是有益的，已知冷冻干燥和重建的方法适用于这种情况。
而且，本发明的抗体和抗体衍生物也适合于工业应用，通过亲和层析对因子IX/因子IXa进行纯化，或作为检测方法(例如ELISA分析)的组分，或作为与靶蛋白功能结构域相互作用或对其进行鉴定的试剂。
通过下述的实施例和附图对本发明进行详细描述，其不应理解为对本发明的限制。实施例实施例1对免疫活性小鼠的免疫和分泌抗-FIX/IXa抗体的杂交瘤细胞的产生以腹膜内(i.p.)途径，用100μg抗原免疫1-3组正常的5-8周龄的免疫活性小鼠Balb/c小鼠(100μl剂量)。在典型的实验中，小鼠与重组的人凝集因子(F)IX(BenefixTM)，活化的人FIXaα(酶学研究实验室，批次FIXaa 1190L)或人FIXaβ(酶学研究实验室，批次HFIXAap 1332 AL，)辅以Al(OH)3或KFA。
用100μg抗原(100μl剂量，i.p)在不同的时间对个体小鼠加强免疫，并在两天后将小鼠处死。分离脾细胞，基本上依照Lane等，1985(免疫学方法杂志，81卷，223-228页)将其与P3 X63-Ag8 6.5.3骨髓瘤细胞融合。每一次融合实验都单独编号，即#193，195，196或198。
杂交瘤细胞在96孔培养板巨噬细胞饲育层(app.105细胞/ml)生长，然后在HAT-培养基上筛选(RPMI-1640培养基，添加了抗生素10％ FCS，丙酮酸钠，L-谷氨酸盐，2-巯基乙醇和HAT(HAT 100x1.0×10-2M次黄嘌呤溶于H2O(136.1mg/100ml H2O)，4.0×10-5M氨基蝶呤溶于H2O(1.76mg/100ml H2O)和1.6×10-3M胸腺嘧啶核苷溶于H2O(38.7mg/100mlH2O)。6天后第一次更换培养基，此后每周更换两次。两到三周后将HAT培养基换成HT培养基(RpMI-1640添加抗生素，10％FCS，丙酮酸钠，L-谷氨酸盐，2-巯基乙醇和HT)，其后(1-2周后)转到正常生长培养基中(RPMI-1640培养基添加10％FCS，丙酮酸钠，L-谷氨酸盐和2-巯基乙醇)(参见杂交瘤技术，EMBO，SKMB Course 1980，巴塞尔)。
在另一组实验中用FIX缺陷C57B16小鼠(Lin等，1997，血液，903962)进行免疫和接下来的杂交瘤生产。正常的Balb/c小鼠相比，由于FIX剔除(k.o.)小鼠不表达内源的FIX，其所得的抗(a)-FIX抗体光谱也有所不同(由于缺乏耐力)。实施例2在分泌抗-FIX/FIXa抗体的杂交瘤细胞上清液中分析FVIII-样活性用可商购的检测试剂盒COATEST VIIIC/4(Chromogenix)分析由杂交瘤细胞分泌的抗-FIX/FIXa抗体的FVIII-样活性。所述的分析基本上依照供应商所描述的进行，仅作出下述修改为进行高产率筛选，所述分析缩小到微滴定平皿形式。简要地说，25μl等分杂交瘤上清液转移到微滴定板(Costar，#3598)的孔中，升温到37℃。依照供应商所述方法将显色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制剂(I-2581)，因子(F)IXa和FX在无菌水中重建，FIXa/FX与磷脂混合。每个反应，50μl磷脂/FIXa/FX溶液和25μl CaCl2(25mM)及50μl底物/抑制剂合剂。为起始反应，将125μl预混合液加入微滴定板中的杂交瘤上清液中，在37℃温育。在不同的时间(30min到12h)于Labsystems iEMS ReaderMFTM微滴定板读数仪上测定样品相对于试剂(MLW，用细胞培养基代替杂交瘤上清液)空白对照在405nm和490nm下的吸光度。用GENESISTM软件，通过将样品的吸光度与经稀释的FVIII参照标准(IMMUNO AG#5T4AR00)的吸光度相比较，计算所测样品的FVIII-样活性。
在杂交瘤细胞培养物上清液中筛选FVIII-样活性的结果如
图1所示。在上述的显色FVIII分析中检测由融合实验#193，#195和#196(见上)所得的预选克隆。克隆193/M1，193/N1和193/P1是主克隆193/CO(见下)衍生的亚克隆。主克隆195/10源于融合实验#195，克隆196/AO，196/BO和196/CO源于融合实验#196。在典型的筛选实验中，一次预筛选FVIII-样活性的融合实验获得约1000克隆(在96孔中)。接下来，所筛选的克隆更大规模(3-5ml上清液)培养，并经再次显色分析实验分析。作为阴性对照，细胞培养基在每一平板上分析(MLW)。
表现高FVIII-样活性或基本FVIII-样活性的孔用于亚克隆程序。以IgG细胞系(即193/CO)的筛选和亚克隆过程为例说明筛选和亚克隆过程，对产生IgM的克隆(即196/CO，见下，图5)也是通过同样的方式进行的。
所述的筛选过程首先将所有源于单一的融合实验的杂交瘤克隆置于10个96孔培养板上，由此形成所谓的″主平板″。在主平板上单数位置(孔)通常包含不止一个杂交瘤克隆(通常3到15不同克隆)。接下来，检测由几千细胞分泌的抗体。这些细胞在抗体产生的次最优条件下生长，已知所述的条件对染色细胞是最优的。因此在上清液中预期的特异抗-FIX抗体的浓度在10-12到10-14M的范围内。这解释了为什么与标准的FVIII分析相比，孵育期要延长。
在主平板的杂交瘤细胞培养物上清液中筛选IgG介导的FVIII′样活性的结果如图2所示。将上清液进行显色FVIII分析。显示的是源于#193号融合实验(用FIXaa免疫的Balb/c小鼠)的第五块主平板的结果。在37℃下温育4小时后测定吸光度。ES位显示出明显高于空白(MLW)的FVIII样活性。这一细胞库命名为193/CO并进行进一步亚克隆(图3)。由于主平板上的每个孔均包含不止一个杂交瘤细胞克隆，因此将一个阳性的孔中的细胞扩大并以经计算所得的2-0.2细胞/孔的密度置于96孔培养板上。再次测定上清液的FVIII样活性，对阳性的位置进行下一轮亚克隆。典型地，每一表现高FVIII样活性的克隆要经过3到4轮亚克隆才能获得同源的细胞群。这里显示了所述的193/CO亚克隆的显色分析结果。温育4小时后测定吸光度。A6和D5位表现出基本FVIII样活性，将其分别命名为193/M1和193/P1。将这两个克隆进行下一轮的亚克隆。每板(MLW(H1))上均对空白培养基进行分析作为阴性对照。
小量(3ml)杂交瘤培养物的显色FVIII-样活性和FIX-ELISA反应性的比较如图4所示。在确定主克隆(或亚克隆)是否进行进一步亚克隆之前，培养3-5ml量的克隆并再次检测上清液。此图表明主克隆193/CO及其所有的经鉴定为阳性并经再次检测的亚克隆的FIX特异ELISA结果和FVIII-样显色活性。此处所描述的显色分析和ELISA测定的结果均已去除了空白值(显色试剂本身的吸光度)。克隆193/M1经亚克隆后得到克隆193/V2，193/M2和193/U2。对其它的来自193/P1，193/AB2和193/P2的第二轮克隆进行了亚克隆。193/AF3，193/AB3和193/AE3是193/AB2的亚克隆。其它的第三轮的克隆来自193/P2。最终对193/AF3(→193/AF4)，AE3(→193/AE4，193/AL4，193/AN4和193/AO4)和193/AD3(→193/AG4，193/AH4，193/AD4，193/AI4，193/AK4)进行了亚克隆。
将来自每一融合实验的几个(5-15)主克隆(选自主平板)进行鉴定并亚克隆。三轮亚克隆后，经ELISA，显色分析(参见图4)及cDNA序列测定大多数的细胞系是同源的。一个特定的主克隆和其所有的亚克隆均产生相同的FIX/FIXa结合抗体。但是来自不同主克隆的抗体蛋白序列存在很大的差异(参见实施例11)。大多数的杂交瘤细胞系表达源于IgG亚类的抗体(即克隆#193，#198，如198/A1，198/B1，198/BB1)。但是我们可以挑选出一些表达IgM的抗体。
测定了一些主要的主克隆和亚克隆杂交瘤上清液的显色活性。在37℃下温育1h 30min和3h 30min后测定吸光度(图5)。与所有来自第193号融合的克隆相比，196/CO和其亚克隆196/AP2产生FIX/FIXa-特异性IgM抗体，该抗体即使在短期的温育后也可以给出强的显色活性。
下述的细胞系已依照布达佩斯条约保藏于欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)98/B1(ECACC No.99090925)；198/A1(ECACC No.99090924)；198/BB1(ECACC No.99090926)；193/A0(ECACC No.99121614)；196/C4(ECACC No.99121615)；198/D1(ECACC No.99121616)；198/T2(ECACCNo.99121617)；198/G2(ECACC No.99121618)；198/AC1(ECACC No.99121619)；和198/U2(ECACC No.99121620)。
为对特定抗体的生化性质作更深入地分析，将表达具有FVIII样活性抗体的同源杂交瘤细胞系扩大，并用于更大量(100-1000ml)地表达所研究的抗体。这些抗体在用于进一步研究之前经亲和纯化(参见实施例3)。实施例3因子IX/FIXa(α，β)与表现FIX/FIXa激活活性的抗体结合性质在TBS(25mM Tris HCl，150mMNaCl，pH 7.5)中，将因子IX和FIX的两种活化形式，FIXaα和FIXaβ(FIX/FIXa(α，β))稀释到终浓度为2μg/ml。依照常规方法用100μl FIX/FIXa(α，β)溶液包被Nunc MaxisorpELISA平板(4℃，过夜)，用TBST(TBS，0.1％(v/v)Tween 20)洗几次。用50μl TBST/2％ BSA以1∶1的比例稀释50μl杂交瘤上清液，加入经包被的ELISA平板。在室温(RT)下温育2h后，用TBST洗四次，与100μl/孔1∶25000稀释的(在TBST/1％ BSA中)抗-小鼠IgG(Fc-特异)过氧化物酶连接的抗体(Sigma，#A-0168)一起温育(2h，RT)。用TBST洗涤5次，用100μl新配制的染色溶液(10ml 50mM柠檬酸钠，pH 5添加100μlOPD(60mg OPD/ml)和10μl 30％H2O2)染色。加入50ml H2SO4终止反应后应用基因SISTM软件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上记录492nm和620nm下的光密度值。
在特定的情况下，可以用抗-小鼠IgM ELISA代替抗-小鼠IgGELISA。
从杂交瘤细胞培养物上清液中纯化小鼠-IgG向杂交瘤上清液(100-500ml)中添加200mM Tris/HCl缓冲液(pH7.0)和固体NaCl至终浓度分别为20mM Tris和3M NaCl。上清液经5500xg离心10min澄清。用15ml 20mM Tris/Cl pH 7.0清洗一只1ml蛋白G亲和层析拄(蛋白G Sepharose Fast Flow，Amersham-Pharmacia)，其后用10ml含3M NaCl的pH 7.0的20mM Tris/Cl缓冲液平衡。含有3M NaCl的杂交瘤上清液通过重力加到柱。上述柱用15ml含3M NaCl的pH 7.0的20mM Tris/Cl缓冲液洗。结合的IgG用12ml pH 2.8的甘氨酸/HCl缓冲液洗脱，收集1ml/份馏分。每份加入100μl pH 9.0的1M Tris进行中和。在微滴定板的孔中将50μl包含IgG的馏分与150μl染色溶液(BioRad；浓缩液，用水以1∶5的比例稀释)相混合鉴定含有IgG的馏分。收集阳性馏分，依制造商的说明在超滤浓缩器(Centricon Plus 20，Amicon)中浓缩为1ml。浓缩物用19ml TBS(20mM Tris/Cl缓冲液pH 7.0含150mM NaCl)稀释，然后再次浓缩为1ml。稀释-浓缩步骤重复2次以上以使IgG进入TBS。
从杂交瘤细胞上清液中纯化小鼠-IgM将100-500ml杂交瘤细胞培养物上清液依制造商的说明通过超滤浓缩器(Centricon Plus 20，Amicon)或通过硫酸胺(40％饱和度，0℃)沉淀法浓缩至5-10ml，将沉淀再用5-10ml TBS再溶解。将通过任何一种方法得到的浓缩物在含1.25M NaCl的pH 7.4的20mM Tris Cl缓冲液中透析后再在Centricon Plus 20，(Amicon)超滤仪上浓缩至1ml。依照制造商的说明用免疫纯化IgM纯化试剂盒(Pierce)从浓缩物中纯化IgM。检测在从麦芽糖结合蛋白-柱上洗脱的过程中收集的馏分中的IgM，依照关于IgG的的描述，进行收集，浓缩，并将其引入TBS。
在纯化的沉淀中鉴定IgG浓度测定了总IgG内含物适当稀释后在280nm下的消光值。E280＝1.4相当于1mg/ml蛋白。
因子IXa特异性IgG(定量ELISA)2μg/ml在TBS(25mM Tris/HCl pH 7.5含150mM NaCl)中稀释的因子IXa在微滴定板(Nunc Maxisorp)中4℃温育过夜。用TBST(25mMTris/HCl pH 7.5含150mM NaCl和0.1％(v/v)Tween 20)洗涤四次。将HIX1抗-FIX(精确的)作为标准的单克隆抗体。用含2％(w/v)BSA的TBST稀释标准品和样品。室温下在ELISA-平板上将标准稀释液系列和样品的适当稀释液温育2h。用TBST洗板四次，与100μl/孔1∶25000稀释的(在TBST/1％BSA中)抗-小鼠IgG(Fc-特异)过氧化物酶连接的抗体(Sigma，#A-0168)一起温育(2h，RT)。用TBST洗孔5次，用100μl新配制的染色溶液(10ml 50mM柠檬酸钠，pH 5添加100μl OPD(60mgOPD/ml)和10μl 30％H2O2)染色。加入50ml H2SO4终止反应30min后应用基因SISTM软件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上记录492nm和620nm下的光密度值。实施例4在显色FVIII分析中的表现FVIII-样活性的抗-FIX/FIXa抗体将几个产生抗-FIX/FIXa抗体的杂交瘤克隆亚克隆达四次，然后所得的单克隆杂交瘤细胞系用于生产含单克隆抗体的上清液。源于这些上清液的IgG同种型抗体经亲和柱纯化和TBS透析(见上)。IgM用作非纯化的上清液馏分。下述的实验在两组代表性的抗体中进行193/AD3和198/AC1/1(IgG同种型，抗体198/AC1/1是由亲代198/AC1杂交瘤克隆制备的，即用含198/AC1细胞的小瓶(冷冻的)培养并产生抗体。其上清液用于这些实验)和196/AF2及196/AF1(IgM同种型)(图6A和图6B)。简要地说，每份25μl包含样品的单克隆抗体(未纯化的杂交瘤上清液，或者如果温育的话，一定量的FIX特异抗体)加入到微滴定板的孔中并升温到37℃。显色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制剂(I-2581)，因子(F)IXa和FX与在无菌水中重建且依供应商的说明与磷脂相混合。每个反应，包含50μl磷脂/FIXa/FX溶液和25μl CaCl2(25mM)和50μl底物/抑制剂的混合物。为起始反应，将125μl预混合液加到在微滴定板中的杂交瘤上清液，37℃下温育。在不同的时间(5min到6h)用GENESISTM软件于Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上测定样品相对于试剂(MLW，用细胞培养基代替杂交瘤上清液)空白对照，在405nm和490nm下的吸光度。通过将样品的吸光度与经稀释的FVIII参照标准(IMMUNO AG#5T4AR00)的吸光度相比较，计算所测样品的FVIII-样活性。
与人FVIII(12和16mU/ml)，TBS和细胞培养基相比由单克隆抗体193/AD3(IgG同种型)和196/AF2(IgM同种型)所显示的FVIII-样活性的时间过程如图6A所示。在迟滞期后，根据所测定的在405nm波长处的光密度的升高可知两抗体均引起显色底物裂解。
与人FVIII(16mU/ml)和10μg/ml小鼠IgG相比由单克隆抗体198/AC1/1(IgG同种型，10tg/ml)和196/AF1(IgM同种型，未纯化的上清液)所显示的FVIII-样活性的时间过程如图6B所示。在迟滞期后，根据所测定的在405nm波长处光密度的升高可知两抗体均引起显色底物裂解。实施例5通过抗FIX/FIXa-抗体表现的FVIII-样活性产生因子Xa，并且是磷脂，FIXa/FX和Ca2+依赖性的因子VIII活性通常是由显色分析和/或基于APTT的凝固分析测定的。两种类型的分析依赖FVIIIa/FIXa-介导的因子Xa的产生。在显色FVIII分析的情况下，所产生的因子Xa将接下来与显色底物反应，其可通过光谱学分析监控，例如，在ELISA读数仪中。在基于APTT的凝固分析中，游离的因子Xa与所谓的凝血酶原酶复合物的磷脂表面的Fva组配并激活凝血酶原成为凝血酶。凝血酶进而引起纤维蛋白的产生并最终形成凝集物。两种分析方法的关键均在于由因子FVIIIa/FIXa生成Xa。
为证明通过抗-FIX/FIXa-抗体表现的FVIII-样活性的确产生因子Xa，进行了下列的实验。将几份25μl的未纯化的杂交瘤上清液196/AF2(IgM同种型)加到微滴定板的孔中，升温到37℃。作为阳性对照，用杂交瘤培养基(196 HM 007/99)稀释16mU的RecombinateTM将其与杂交瘤上清液同样处理。用空白杂交瘤培养基作为阴性对照。依照供应商所述方法将显色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制剂(I-2581)，在无菌水中重建因子(F)IXa并将FX FIXa/FX与磷脂混合。用水重建Pefabloc Xa，因子Xa特异性蛋白酶(Pentapharm，LTD)至终浓度为1mM/l。每个反应，50μl磷脂/FIXa/FX溶液与25μl CaCl2(25mM)和50μl底物/凝血酶抑制剂合剂混合。为起始反应，将125μl预混合液加入微滴定板中的杂交瘤上清液中，在37℃温育。此时指出，加入35μM Pefabloc Xa。在不同的时间(每5min到6h)用GENESISTM软件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上，以试剂(细胞培养基)为空白对照测定405nm和490nm下样品的吸光度。
图7A显示了通过易于测定的显色底物S-2222(比较″16mU FVIII″和″196/AF2″)的裂解确定的，通过IgM抗-FIX/FIXa抗体196/AF2表现的FVIII-样活性在产生反应物Xa中的因子IXa刺激作用的结果。因子Xa的活性被Fxa特异性抑制剂″Pefabloc Xa″(比较″196/AF2″对″196/AF235μM Pefabloc Xa″有效地封闭，这说明的确产生了FXa。
用纯化的克隆198/AM1的IgG制剂进行了相同的实验(图7B)。纯化的IgG用TBS稀释到最终浓度为0.4mg/ml和25μl(即总共10μg)，将其移至微滴定板的孔中，升温到37℃。用6mU来自血浆的FVIII作为阳性对照。10μg非特异性小鼠IgG(Sigma，1-5381)用作阴性对照。依照上述进行分析。
进一步的实验显示因子根据易于测定的显色底物S-2222裂解判断显示FVIII-样活性的IgG抗FIX/FIXa-抗体198/AM1刺激因子IXa产生因子Xa(图7B)。再由因子VIII和抗体198/AM1产生可由Fxa特异性抑制剂″Pefabloc Xa″有效封闭的Fxa。非特异性小鼠IgG(Signa，1-5381)用作阴性对照进行分析。
在另外一组实验中，证明了在磷脂(PL)，FIXa/FX和Ca2+存在下，纯化的抗FIX/FIXa-抗体(IgM，图8A)或来自细胞培养物上清液的非纯化抗体(IgG，图8B)对FVIII-样活性的依赖性。小鼠IgG用作对照(图8C)。因子VIII-样活性基本上按上述描述进行分析。可从反应中去除FIXa/FX混合物，PL或Ca2+。在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上读出不同的时间样品相对于试剂空白(缓冲液代替纯化的抗体)在405nm和490nm下吸光度。结果如图8A，图8B和图8C所示。
在磷脂(PL)，FIXa/FX和Ca2+存在下，纯化的FIXa-抗体198/AC1/1(IgG同种型，在分析过程中浓缩为10μg/ml)对FVIII-样活性的依赖性进一步如图8A所示。显然，只有包括抗体，PL，Ca2+，和FIXa/FX的完整分析才能引起适当的FXa产生。在磷脂，FIXa/FX和Ca2+存在下，含未纯化的IgM同种型抗-FIX/FIXa-抗体(196/AF1)的细胞培养物上清液对FVIII-样活性的依赖性如图8B所示。
再次如上述对纯化的IgG制剂，抗体198/AC1/1进行分析(图8A)，只有包括抗体，PL，Ca2+，和FIXa/FX的完整分析才能引起适当的FXa产生。为了表明所述反应的特异性，在与上述完全相同的条件下分析从正常小鼠血浆中制备的全部IgG。结果如图8C所示。没有检测到FVIII-样活性。如所预料的那样，在磷脂，FIXa/FX和Ca2+存在下，没有可检测的活性。所有的实验均在微滴定板上进行，每5min测定一次OD405，共进行6h。实施例6某些抗-FIX/FIXa-抗体在FIXa存在下是促凝血的在通常的止血过程中，FIX是由组织因子(TF)/因子VIIa途径进行初始活化的，或者后来由因子XI(FXIa)活化的。其活化后，FIXa在膜结合复合物的血小板表面上与活化的FVIII结合。因子IXa本身对FX几乎或完全没有酶活性，但在FVIIIa存在下具有很高的活性。为证明某些抗-FIX/FIXa抗体具有FVIII-样活性并从而在FVIII缺陷的病人血浆中是促凝血的，进行了下述的实验。不同量的抗体193/AD3或小鼠IgG(作为对照)用于标准的基于aPTT的单步骤凝集试验。简要地说，100μl含抗体的样品与100μl FVIII缺陷血浆(DP)和100μl DAPTTIN(PTT试剂以确定活化的凝血激酶时间；IMMUNO AG)试剂在KC10A凝集试验器中温育。可将总量为50ng活化的FIX掺入反应混合物中。温育4分钟后，加入100μl CaCl2(25mM)开始反应。结果如表1和图9所示。
凝集时间(sec)μgAB193/AD3 小鼠IgG50ng FIXa 50ngFIXa9101.6 102.54.5 95.6 103.22.25 93.1 103.21.8 93.7 101.91.35 91.4 103.40.9 94.4 102.20.45 98.1 101.90.34 97.1 103.90.23 99.3 103.7表1在50ng活化的FIX(0.01UFIX)存在下，应用不同量的促凝血(193/AD3)的FVIII缺陷血浆和对照抗体(小鼠IgG)在基于APTT的凝集试验实验中的凝集时间。反应中抗体和活化的FIX的摩尔比为10∶1。抗体和总FIX(FIX和FIXa，假定人FVIII缺陷血浆包含1U(5g)FIX)之间的摩尔比在6∶1(9g抗体反应中)和1∶6(0.23g抗体在反应中)之间变化。在最佳的缩短的凝集时间处，抗体和总FIX之间的摩尔比为1∶1。未加入FIXa的凝集时间在120sec的范围内。
图9是表示在50ng活化的FIX(0.01UFIX)存在下，应用不同量的促凝血(193/AD3)的FVIII缺陷血浆和对照抗体(mouse IgG)在基于APTT的凝集试验实验中的凝集时间的曲线图。结果表明抗体在FIXa存在下是促凝血的。实施例7抗-FIX/FIXa-抗体在FVIII抑制剂和FIXa存在下是促凝血的标准的FVIII替代治疗的严重并发症是产生直接针对FVIII的同种抗体，导致FVIII中和与病人血液不能凝集的病症。
为证明某些抗-FIXa-抗体即使在FVIII抑制剂存在下也具有FVIII-样活性，进行了下述的实验。将不同量的抗体193/AD3和作为对照的小鼠IgG用于标准的基于aPTT的单步骤凝集试验。简要地说，将100μl抗体样品与100μl FVIII缺陷血浆(
图10A)或FVIII抑制血浆(抑制剂效力400BU/ml)，
图10B)以及100μl DAPTTIN试剂一起在KC10A凝集试验器中温育。另外，将总量为50ng的活化的FIX掺入反应混合物中。温育4分钟后，加入100μl CaCl2(25mM)开始反应。为确保相同条件，平行地进行使用FVIII缺陷血浆和FVIII抑制血浆的实验。结果如
图10A和10B所示。如已在实施例6中所示的，在FVIII抑制剂存在下，加入抗体193/AD3的样品的凝集时间有明显的剂量依赖性减小。实施例8抗-FIX/FIXa-抗体在缺陷的FVIII和FIXa存在下是促凝血的为证明抗-FIX/FIXa-抗体在缺陷的FVIII和FIXa存在下是促凝血的，进行了下述实验。
将用量逐渐提高的抗体193/AD3或作为对照的小鼠IgG用于标准的基于aPTT的单步骤凝集试验。在这一凝集试验中应用了由于存在缺陷FVIII(DF8)而具有低凝集活性的血友病A病人的血浆。简要地说，将100μl抗体样品与100μl DAPTTIN试剂及100μl DF8血浆或FVIII缺陷血浆一起在KC10A凝集试验器中温育。另外，反应混合物中包含总量为50ng的活化的FIXa。短暂的温育后，加入100μl CaCl2(25mM)开始反应。为确保同等条件，平行地进行使用FVIII缺陷血浆和DF8血浆的试验。实施例9在FIXa存在下具有促凝血活性的抗-FIX/FIXa-抗体在人和牛之间的区别从各杂交瘤上清液中纯化选自第198号融合实验的FIX/FIXa特异性单克隆抗体，并依照实施例3所述进行定量。在改进的单步骤凝集试验(如实施例6所述)中分析这些抗体，其中一些抗体表现出促凝血活性。
在以下的FXa产生动力学分析中测定这些抗体制剂的显色活性将10μg单克隆抗体(25μl)移至微滴定板的孔中并升温到37℃。在无菌水中重建显色底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制剂(I-2581)，因子IXa和FX，并依供应商的说明将FIXa/FX(均来自牛)与磷脂相混合。在每一反应中，将50μl磷脂/FIXa/FX溶液和25μlCaCl2(25mM)和50μl底物/抑制剂合剂混合。为起始反应，将125μl预混合液加到微滴定板的杂交瘤上清液中，在37℃下温育。在不同的时间(5min到2h)用GENESISTM软件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上以试剂(用25mlTBS单克隆抗体)为空白对照，测定405nm和490nm下样品的吸光度。作为平行实验，每一反应加入50ng人FIXa进行相同的实验，表现促凝血活性的抗体相对牛FIX没有显色活性，而在人FIXa存在时具有高显色活性。
图11显示在(+)加入或(-)不加入50ng人FIXaα的情况下，单克隆抗体198/A1，198/B1和198/AP1表现出的FVIII-样活性的时间过程。非特异性小鼠IgG作为对照。198/A1和198/B1表现促凝血活性(与实施例6中的193/AD3相似)而198/AP1则不表现。抗体198/BB1具有相同的活性图案(数据未示出)。
由198号融合实验筛选出的其它单克隆抗体包括198/D1(ECACCNO.99121616)，198/T2(ECACC No.99121617)，198/G2(ECACC No.9912118)，198/U2(ECACC No.99121620)。实施例10由抗-FIX/FIXa抗体衍生的抗体的结构和促凝血活性；源于杂交瘤细胞系193/AD3，193/K2，198/A1和198/B1(克隆AB2)的亚克隆抗体可变结构域克隆方法依制造商的说明，用″QuickPrep微量mRNA纯化试剂盒″(Pharmacia)从(193/AD3，193/K2，198/A1或198/B1(克隆AB2))1×106的各细胞系的杂交瘤细胞中制备信使RNA。依制造商的说明，用″Ready-To-Go-You-Prime-First-Strand Beads试剂盒″(Pharmacia)通过反转录mRNA制备相应的cDNA。用一系列的引物将重链和轻链的编码序列转换到相应的cDNA上。为反转录重链特异性mRNA(VH)，应用等摩尔的寡核苷酸混合物MOCG1-2FOR(5′CTC AAT TTT CTT GTC CAC CTT GGTGC 3′)(SEQ.ID.NO.1)，MOCG3FOR(5′CTC GAT TCT CTT GAT CAACTC AGT CT 3′)(SEQ.ID.NO.2)和MOCMFOR(5′TGG AAT GGG CACATG CAG ATC TCT 3′)(SEQ.ID.NO.3)(RTmixl)。在同一反应管中，用引物MOCKFOR-(5′CTC ATT CCT GTT GAA GCT CTT.GAC 3′)(SEQ.ID.NO.4)合成轻链特异性cDNA(VL)。
采用
图12中描述的引物对和来自上述反转录混合物(RTmixl)的特异性cDNA作为模板，对VH的编码序列进行PCR扩增。由
图13中描述的引物对，并同样用Rtmixl作为模板扩增VK链基因。VH-PCR产物经SfiI-AscI切割后插入到经SfiI-AscI消化的载体pDAP2(GeneBank登记号U35316)上。将如此得到的pDAP2-VH构建体分别命名为pDAP2-193AD3/VH，pDAP2-198A1/VH，pDAP2-198AB2/VH(源于抗体198/B1)和pDAP2-193/K2/VH。所述质粒接下来经AscI-NotI切割，插入相应的经AscI-NotI消化的VK-基因PCR产物。所得的载体命名为pDAP2193/AD3scFv，pDAP2-198/AlscFv，pDAP2-198/AB2scFv(源于抗体198/B1)pDAP2-193/K2scFv编码单克隆抗体193/AD3，198/A1，198/AB2(源于抗体198/B1)和193/K2VH-基因和VL-基因。重链和轻链由人工可变接头(G4SGGRASG4S；Engelhardt等，1994)编码序列连接并可以表达各抗体的scFv变异体。
在
图14中描述了源于杂交瘤细胞系193/AD3的scFv的DNA和推定的蛋白序列。核苷酸1到357编码重链可变区结构域，核苷酸358到402编码人工可变接头，核苷酸403到726编码轻链可变区。重链CDR3区域的蛋白序列具有YGNSPKGFAY(SEQ.ID.NO.5)序列，并用粗体字母给出。人工接头序列为(G4SGGRASG4S)。
在
图15中，描述了源于杂交瘤细胞系193/K2的scFv的DNA和推定的蛋白序列。核苷酸1到366编码重链可变区结构域，核苷酸367到411编码人工可变接头，核苷酸412到747编码轻链可变区。重链CDR3区域的蛋白序列具有DGGHGYGSSFDY(SEQ.ID.NO.6)序列，用粗体字母给出。人工接头序列为(G4SGGRASG4S)。
在
图16中，描述了源于杂交瘤细胞系198/AB2的scFv的DNA推定的蛋白序列。核苷酸1到366编码重链可变区结构域，核苷酸367到411编码人工可变接头，核苷酸412到747编码轻链可变区。重链CDR3区域的蛋白序列具有EGGGFTVNWYFDV(SEQ.ID.NO.7)序列，用粗体字母给出。人工接头序列为(G4SGGRASG4S)。
在
图17中，描述了源于杂交瘤细胞系198/A1的scFv的DNA推定的蛋白序列。核苷酸1到366编码重链可变区结构域，核苷酸367到411编码人工可变接头，核苷酸412到747编码轻链可变区。重链CDR3区域的蛋白序列具有EGGGYYVNWYFDV(SEQ.ID.NO.8)序列，用粗体字母给出。人工接头序列为(G4SGGRASG4S)。实施例11源于抗-FIX/FIXa-抗体CDR3区域的肽的促凝血活性原则上，抗体分子可以想象成在三维空间呈递肽元件组合阵列的生物器件(参见Gao等，1999，PNAS，966025)。因此，抗体(或抗体衍生物例如scFv，Fab，等)可用作检测靶蛋白中功能重要的结构域的工具，或者在另一方面用作描述特异性地介导某种相互作用，即激活或加强FIXa对生理上的底物FX的活性的氨基酸序列的工具。后一过程导致大量重链CDR3区域(CDR3H)衍生的肽序列作为FIXa增强试剂。
增强表现此种活性肽的促凝血活性可通过在所述肽中介导FIXa活性增强至关重要的区域内进行序列变换来完成。作为得到具有增强的促凝血活性的肽序列的可能步骤，抗体即198/A1或198/B1的结合位点，用序列比较分析，竞争结合分析，Western blot分析和竞争ELISA分析进行作图。由于FIX的晶体结构已知，其分子模型用于提高198/B1衍生的肽在人FIXa上的198/B1结合位点的合适程度。
另一方面，通过例如，″丙氨酸扫描突变分析″对给定的肽序列例如198/A1或198/B1 CDR3H衍生的肽序列的系统突变分析可以鉴定对促凝血活性至关重要的肽残基。另一种提高给定肽序列活性的方法用肽文库结合高得率的筛选。
抗体的抗原结合位点是由在VL-HL二聚体(或Fv区域)N-末端并列的六个“互补决定区(CDR′s)”衍生的。单独的CDR对所述抗体对给定抗原的特异性的贡献变化很大，但一般一般认为重链的CDR3区域(CDR3H)具有特别的影响，即CDR3H区域特定的蛋白序列对抗原识别具有特别重要的意义。据报道CDR3H区域的长度变化很大，一般在4-25个氨基酸的范围内(Borrebaeck，16页)。下面是一个肽序列系统突变分析的例子。为提高抗FIX/FIXa抗体的CD3-区域衍生的肽的溶解度/促凝血效力，改变了N末端和C末端的氨基酸序列。另外，构建并分析了一系列的突变的肽。
这一研究的原理由抗体198/A1和198/B1衍生的CDR3H区域衍生的一系列的肽作为示例。起始的肽A1(参见表2)是由抗体198/A1的CDR3H区域衍生的，肽B1是由抗体198/B1的CDR3H区域衍生的。术语“杂乱变型”是指一种肽具有相同的氨基酸序列但以随机的顺序排列。
表2列出一系列由抗体198/A1衍生的肽。所列出的是肽的长度(aa，氨基酸#)，计算出的分子量(MW，以道尔顿(D)表示)和统计的等电点(pI)。D-Arg缩写为Rd。
在第一系列的实验中我们通过去除C末端的Val残基并在肽的N末端和C末端添加几个带电的残基，提高了起始CDR3H肽序列(A1；EGGGYYVNWYFDV)的溶解度。所得的肽A1/2(酸性pI)，A1/3(碱性pI)和其各自的杂乱变型A1/4，A1/5和A1/3scr3在生理pH下的多种缓冲液系统中均易于溶解。为分析所述肽的FVIII-样(FIXa激活)活性，发展了基于可商购的FVIII分析的一种分析系统。(参见实施例2和4)。其基本原理是，没有辅因子的情况下，FIXa对其天然底物FX只有非常有限的活性。只有在具有FVIII激活特性的底物存在时，即FVIII或表现FVIII样活性的物质，才能通过FIXa/激活剂复合物切割FX产生大量的FIXa。所产生的Fxa的量通过显色底物的裂解来监控。修订的显色分析的原理通过两个代表性的肽A1/3和A1/5(表2)进行描述。简要地说，每份25μl贮存溶液(在咪唑缓冲液(IZ)50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)加到微滴定板升温到37℃。显色的FXa底物(S-2222)，合成的凝血酶抑制剂(I-2581)，牛FIXa和牛FX在无菌水中重建，FIXa/FX依照供应商的说明与磷脂混合。由于所述的肽不与牛FIXa反应，(其在检测试剂盒中作为与牛FX的混合物出现)加入2.9nM(大多数情况下是2.3nM)人FIXa(ERL)(参见实施例11，
图19)。每反应50μl磷脂/FIXa/FX溶液与25μlCaCl2(25mM)和50μl底物/抑制剂合剂。为起始反应，将125μl预混合液加入微滴定板中的杂交瘤上清液中，在37℃温育。在不同的时间(5min到2h)用GENESISTM软件在Labsystems iEMS Reader MFTM微滴定板读数仪上以试剂为空白对照，测定405nm和490nm下样品的吸光度。这一实验的结果如实施例11和
图18所示。在2.9nM人FIXa存在下肽A1/3诱导易于测定的Fxa产生，而杂乱变体A1/5是非活性的。另外，在可比较的条件下测定时酸性肽A1/2和杂乱变型A1/4、A1/3-scr3不表现任何显著的显色活性(数据未公布)。为证明肽A1/3类似于亲本抗体198/A1不与牛FIXa和FX反应，进行了如
图19所示的实验。所述的肽A1/3如上所述与(A1/3(24μM)，+hFIXa)或不与(A1/3(24μM)，w/ohFIXa)2.3nM人FIXa(hFIXa)一起温育。在对照实验中，我们加入空白稀释缓冲液(IZ)添加2.3nM hFIXa到反应混合物中。如
图19所示，反应仅在人FIXa存在下才能发生。
图18显示在2.9nM人FIXa(hFIXa)存在下，肽A1/3的显色FVIII-样活性。肽A1/3的杂乱变型A1/5不引起任何Fxa产生。
图19显示肽A1/3的FVIII-样活性对人FIXa(hFIXa)存在的依赖性。缺乏人FIXa时肽A1/3不引起任何Fxa产生。所述的缓冲液对照，空白咪唑缓冲液称为IZ。
还分析了所述的肽在FVIII缺陷血浆中缩短凝集时间的潜在能力。基于aPTT的一阶段凝集试验基本上按照上述描述进行(参见实施例6)。凝集时间(从起始反应到“凝集”形成的时间)与FVIII，缓冲液对照(IZ)或控制肽(杂乱变型)。用不同的aPTT试剂(DAPTTIN和Pathromtin SL)进行的两种典型的凝集试验结果如表3A和表3B所示。
表3A.在2.2nM人FIXa存在或不存在(w/o)下，肽A1/3和A1/3-scr(肽A1/3的杂乱变型)在FVIII缺陷血浆中的凝集活性。所示的是两个独立的代表性实验(Exp1和Exp2)。所有的凝集试验均进行两次。给出各次实验的凝集时间和平均凝集时间，以秒计(sec)。表3A中所示的实验是用aPTT试剂DAPTTIN(Baxter Hyland Immuno)进行的。与缓冲液对照(IZ，咪唑缓冲液)相比较，所述的肽A1/3所引起的凝集时间缩短与剂量无关。通过添加2.2nM活性的人FIX到反应混合物中使凝集时间缩短变得更加明显。肽A1/3的杂乱变型A1/3-scr3不引起任何凝集时间的缩短。实际上，浓度在2.5M以上，所述的杂乱肽变成了抑制剂并延长了凝集时间。肽A1/1，A1/2，A1/4和A1/5不引起任何凝集时间缩短，说明其缺乏促凝血活性(数据未公布)。
表3B.当Pathromtin SL(DADE Behring)用作aPTT试剂时，FVIII缺陷血浆中肽A1/3的凝集活性。这些实验在2.2nM人FIXa存在或不存在(w/o)下进行。给出各次实验的凝集时间和平均凝集时间，以秒计(sec)。其中包括因子VIII和咪唑缓冲液(IZ)分别作为阳性和阴性对照。
与表3A中所示的实验相比，使用aPTT试剂Pathromtin SL进行表3B中所示的实验。在FIXa存在下，肽A1/3引起的凝集时间缩短是不依赖剂量的，而缺乏FIXa时不能检测到凝集时间缩短。
我们进行的另一套实验是为提高肽A1/3在血浆中的稳定性(防止例如，由蛋白水解裂解)。一种方法是用D-Arg残基(以肽A1/3-rd和A1/3-Rd-srmb为例)替换N-和C-末端的L-Arg残基。然后在显色试验和基于aPTT的凝集试验中分析肽A1/3-rd和A1/3-Rd-srmb(所述肽的杂乱变型)。通过这些实验揭示出将末端的L-Arg残基变为D-Arg残基不改变FVIII-样活性，如显色分析中所测定的那样，这说明Arg-残基的偏光力不对显色活性起主要作用(图20)。另外，基于aPTT的单步骤凝集活性尽管在一定程度上减弱了，但仍易于检测出来。(表4)。
表4肽A1/3，A1/3-Rd和A1/3-Rd-srmb单步骤凝集活性(序列参见表2)。图20证明肽A1/3-Rd未改变的显色活性。终浓度为12M的肽或缓冲液对照(IZ)在2.3nM人FIXa(+)存在下温育。发现肽A1/3和A1/3-Rd的显色活性基本上没有改变，且在显色分析中给出几乎相同的结果。肽A1/3，A1/5的杂乱变型和缓冲液没有明显产生Fxa。
我们另一组实验是通过将每一残基替换为丙氨酸以测定肽的核心序列中任意氨基酸各自的作用(表5)。
表5.列出为阐明肽核心序列(E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12)内任意氨基酸的功能而设计的肽。下标的数字表示所述肽中氨基酸的位置。丙氨酸，不带电荷的小氨基酸，用以替代任何氨基酸(″丙氨酸扫描″)。同时列出的还有所述肽的长度(氨基酸#)，所计算出的分子量(MW，道尔顿(D)和统计的等电点(pI)。每一种肽分别溶解在咪唑缓冲液(50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)中，接下来在凝集缓冲液(50mM咪唑，100mM NaCl，1％人白蛋白，pH7.4)中稀释到所需的终浓度。分析了所述的肽的显色活性和在FVIII缺陷血浆中缩短凝集时间的潜力。单步骤凝集试验基本上按照所述的进行(参见实施例6)。将凝集时间(从起始反应到“凝集”形成的时间)与FVIII，缓冲液对照(IZ)或控制肽(杂乱变型)进行比较。已给出对肽A1/3-2和A1/3-3进行″丙氨酸扫描″的一些结果。
例如，肽A1/3-2中G3-A3的改变获得高显色活性，并使在2.2nM人FIXa存在下的单步骤凝集时间(在浓度为12.5μM时为34sec)大大缩短。肽A1/3-3(G4-A4)在终浓度12μM附近表现最佳的显色活性，在较高或较低浓度时，活性下降。在单步骤凝集试验中，所述的肽在较高浓度(12.5μM)和不存在FIXa情况下，在单步骤凝集试验中是受一定程度抑制的，而在2.2nM FIXa(31秒，12.5μM)存在下表现很强的活性。
我们进行的下面一系列实验通过将所述的氨基酸替换为谷氨酸来测定所述肽核心序列的任意氨基酸(E)各自的作用(参见表6)。
表6.列出为阐明肽核心序列(E1G2G3G4Y5Y6V7N8W9Y10F11D12)内任意氨基酸的功能而设计的肽。下标的数字表示所述肽中氨基酸的位置。谷氨酸，不带负电荷的大氨基酸，用以替代任何氨基酸(″谷氨酸扫描″)。同时列出的还有所述肽的长度(氨基酸#)，所计算出的分子量(MW，道尔顿(D)和统计的等电点(pI)。
将每一种肽分别溶解在咪唑缓冲液(50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)中，接下来在凝集缓冲液(50mM咪唑，100mM NaCl，1％人白蛋白，pH7.4)中稀释到所需的终浓度。还分析了来自“谷氨酸扫描”的肽的显色活性和在FVIII缺陷血浆中缩短凝集时间的潜力。单步骤凝集试验基本上按照上述进行(参见实施例6)。
肽A1/3-24表现出一些有趣的特性。所述分子在浓度为6.5μM-12μM时表现高显色FVIII-样活性，而在更高浓度(达24μM)下则失去活生。所述的肽在缺乏人FIXa时没有促凝血活性但在2.2nM hFIXa存在下活性很高。
在第二套实验中我们通过去除C末端的Val残基并在肽的N末端和C末端添加几个带电的残基，提高了由起始肽序列(B1；EGGGFTVNWYFDV)衍生的抗体198/B1 CDR3H的促凝血活性。第一步我们通过去除C末端的Val残基并在所述肽的N-和C-末端添加几个带电的残基以提高起始肽序列的溶解性。所得的肽B1/4，B1/6(酸性pI)，B1/7(碱性pI)和其各自的杂乱变型B1/5，B1/7scr3在生理pH下的多种缓冲液系统中均易于溶解。
表7列出一系列抗体198/B1衍生的肽。所列出的是所述肽的长度(氨基酸#)，所计算出的分子量(MW，道尔顿(D)和统计的等电点(pI)。
将肽B1/4和B1/5溶解在50mM Tris，100mM NaCl，pH＝6.5。两种肽均进行了显色活性分析。发现肽B1/4而非其杂乱变型具有一定的显色活性(数据未公开)。
接下来分析了B1/6，B1/7和B1/scr3。每种肽均单独溶解于咪唑缓冲液(50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.2)中，接下来在凝集缓冲液(50mM咪唑，100mM NaCl，1％人白蛋白，pH7.4)或咪唑缓冲液中稀释到所需的终浓度。还分析了所述的肽的显色活性和在FVIII缺陷血浆中缩短凝集时间的潜力(表8&9)。单步骤凝集试验基本上按照上述进行(参见实施例6)。与缓冲液对照(IZ)或控制肽(杂乱变型)比较凝集时间(从起始反应到“凝集”形成的时间)。
首先在上述的显色分析中测定了肽B1/7的FIXa激活活性(FVIII辅因子样活性)。
如图21所示，添加2.4μM肽B1/7到反应混合物中导致产生容易测定的Fxa。相比之下，添加35μM Pefabloc Xa，Fxa一种蛋白活性的特异抑制剂，使得显色底物裂解反应显著减小，由此证明的确存在肽-FIXa介导的Fxa产生(图22)。若没有向反应混合物中添加FIXa和FX，则没有Fxa合成(图22)。肽B1/6和对照肽B1/5和B1/7scr3不表现活性(数据未公布)。
图21表明肽B1/7的显色活性。终浓度为2.4μM的肽或缓冲液对照(IZ)在2.3nM人FIXa存在下温育。
在图22中，终浓度为2.4μM的肽B1/7或缓冲液对照(IZ)在2.3nM人FIXa(如所示的″+2.3nM hFIXa″或″+″)存在下温育。发现肽B1/7的显色活性依赖于FIXa和FX的存在，因为在反应中省去FIXa和FX(w/oFIXa/FX)时则没有可检测到的反应。为证明所述的肽B1/7的确介导Fxa产生，向反应混合物中加入Fxa特异性蛋白酶抑制剂Pefabloc Xa(35μMPefabloc Xa)。
在第二组实验中，基于aPTT的单步骤凝集试验检测肽B1/6，B1/7和B1/7scr3的促凝血效果。所述的实验基本上按实施例6中的描述进行。结果如表8和9所示。
表8在不存在活化的人FIX的情况下，将FVIII缺陷血浆与肽B1/6，B1/7scr3或B1/7一起温育。将空白缓冲液加到缺陷血浆作为阴性对照。给出了各种组合的凝集时间。在这些条件下，由其延长的157秒的凝集时间说明肽B1/7在其最高浓度(12.5μM)下成为凝血过程的抑制剂。
表9在不存在活化的人FIX的情况下，将FVIII缺陷血浆与肽B1/6，B1/7scr3或B1/7一起温育。将空白缓冲液加到缺陷血浆作为阴性对照。给出了各种组合的凝集时间。FIXa存在下，由其缩短的凝集时间说明，肽B1/7成为促凝血的(83sec，相比之下杂乱型肽为102sec和缓冲液对照为100sec)。实施例12在FVIII抑制剂血浆中由抗-FIX/FIXa-抗体CDR3区域衍生的肽衍生物的促凝血活性为分析在FVIII抑制剂血浆中肽A1/3的促凝血活性，进行了下述实验。我们进行了标准的基于aPTT的单步骤凝集试验，但我们用FVIII抑制剂血浆代替FVIII缺陷血浆。所述血浆的抑制剂效力是8.1 Bethesda单位每ml。
表10将各种量的肽A1/3(12.5μM-1.25μM)加到FVIII抑制剂血浆(在2.2nM FIXa存在(FIXa)或不存在(w/o FIXa)下)。将空白缓冲液加到所述血浆(IZ)作为阴性对照。所述实验进行两次，计算平均值(aver.)。给出了各种组合的凝集时间(以秒计)。很容易了解到所述的肽A1/3在FIXa存在下缩减了(以剂量依赖的方式)FVIII抑制剂血浆的凝集时间，尽管程度很小而且也是在FIXa不存在下。实施例13196/C4 IgM向IgG1的转换由于一些IgM抗体在显色分析中显示高FVIII-样活性，因此尝试将这样的IgM抗体转变为IgG抗体(也可以生成抗体衍生物，如Fab，F(ab)2，scFv，等)下面详细描述IgM可变区基因的补救。
表达载体pBax-IgG1(图23)首先是由载体pSI(Promega)和pEF/Bsd(Invitrogen)通过多重克隆步骤构建的。从血液中纯化供体B淋巴细胞，再用″微量mRNA纯化试剂盒″(Pharmacia)从这些细胞中纯化成熟的mRNA。用″you-primefirst-strand-cDNA-″试剂盒″(Pharmacia)通过特定的引物制备人κ链和人γ1的cDNA。
人κ轻链恒定区结构域的编码序列是使用特定的引物由其cDNA通过PCR扩增获得的。
人γ1链恒定区(CH1-hinge-CH2-CH3)结构域的编码序列是使用特定的引物由其cDNA通过PCR扩增获得的。
用XbaI和NheI消化所得的上述轻链恒定区结构域的PCR产物，再插入经消化的pSI中。所得的载体用EcoRI和XbaI切割，插入退火的寡核苷酸，得到载体pSI-Cκ。上述退火的寡核苷酸提供引导肽和用于插入κ链可变区的SacI-XbaI位点。用SpeI和BamHI消化人γ1链恒定区的PCR产物，再插入经消化的pSI中。所得的载体SpeI和NotI切割，插入退火的寡核苷酸，得到载体pSI-Cγ。上述退火的寡核苷酸提供引导肽和用于插入重链恒定区的XhoI-BstEI位点。载体pEF/Bsd用NheI和SfiI消化，用Klenow处理平末端，插入用BglII和BamHI切割的整个pSI-Cκ表达盒(经Klenow处理后)。所得的载体用EcoRI和HindIII切割并用Klenow处理。pSI-Cγ的整个表达盒用BglII和BamHI切割并插入(Klenow处理后)。所得的载体命名为pBax-IgG1。
所述的轻链可变区可插入到SacI-XbaI位点之间，获得完整的κ轻链编码序列。所述的重链可变区可以克隆到XhoI-BstEI位点之间，得到完整的IgG1重链基因。
两开放阅读框均在SV40-启动子的控制之下表达，并在所述基因的5′末端含有信号肽序列以便将重链和轻链分泌到内质网中。转染到COS细胞以使与亲代IgM具有相同结合特性的IgG1表达。
质粒pBax-196/C4的构建进一步通过使用特定的引物由PCR扩增所述196/C4 scFv(如实施例10所述的亚克隆)的VH来完成。所述的PCR产物用XhoI和BstEII消化后插入到用XhoI和BstEII消化的pBaxIgG1中。196/C4 scFv的VL用特定的引物通过PCR扩增。所述的PCR产物用SacI和XbaI消化后，插入到经SacI和XbaI消化的pBax IgG1-VH中。所得的载体(pBax-196/C4)通过电穿孔转染到COS细胞中表达与亲代IgM具有相同特异性的杂合IgG1分子(鼠可变区和人恒定区)。实施例14通过抗-FIXa抗体激活FIXa酰胺裂解活性简要地说，在不同量的抗-FIX抗体198/B1(IgG同种型)或196/AF1(IgM同种型)存在或不存在的条件下，将20μl因子IXa(含200mU FIXa(Stago))与200μl反应缓冲液(50mM TrisHCl pH7.4，100mM NaCl，5mMCaCl2和40％乙二醇)，25μl FIXa底物(CH3SO2-D-CHG-Gly-Arg-pNA，AcOH，10μM/ml，Pentapharm LTD)在37℃下温育。在ELISA读数仪上405nm下监控FIXa底物的特异性裂解。抗-FIX抗体的存在对FIXa酰胺裂解活性可加强至少两倍。图24显示在抗体198/B1(图24A)和抗体198/AF1(图24B)存在下，FIXa酰胺裂解活性的增加。实施例15由抗-FIX/FIXa-抗体衍生的Fab片段显示的FVIII-样活性抗-FIX/FIXa抗体的Fab片段通过常规方法制备和纯化。简要地说，1ml抗体198/A1(4mg/ml，于50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.4)与87μl裂解缓冲液(1M醋酸钠，10mM EDTA 67.5mg/ml L-半胱氨酸)和0.25mg木瓜蛋白酶(固定于琼脂糖珠上)在37℃下温育过夜。过滤所得制剂去除木瓜蛋白酶。加入L-组氨酸(终浓度50mM)，其后调节pH至7.0。最后加入固体NaCl至终浓度1M。
接下来，通过与蛋白L的结合将198/A1 Fab片段纯化我们在PHARMACIA XK 16/20柱上使用免疫纯化固定的蛋白L Plus(Pierce)(凝胶-体积2ml)。用于层析的缓冲液是1)平衡-缓冲液50mM L-组氨酸pH 7.0；1M NaCl；0,1％(w/v)NaN3；2)洗涤-缓冲液50mM L-组氨酸pH7.0；0.1％(w/v)NaN3；3)洗脱-缓冲液100mM甘氨酸pH 2.5；0.1％(w/v)NaN3；和4)中和缓冲液2M Tris/Cl pH 8,0；基本上按照表11所述的步骤1-7进行层析。为中和洗脱缓冲液的低pH，预先加入“Fraction-tube”和0.2ml 2M Tris pH 8.0。
表11用50mM咪唑，100mM NaCl pH7.4透析(图25)最终的198/A1 Fab制剂，并如上述在显色FVIII试验中进行分析(图25)。与完整的抗体相比，所述的198/A1 Fab片段的活性有一定的减弱；但是所述的Fab片段仍可引起FIX依赖的Fxa产生。
图25显示在2.3nM人FIXa存在下抗体198/A1 Fab片段的显色的FVIII-样活性。我们用完整的抗体198/A1及7.5pM FVIII作为阳性对照。缓冲液对照(IZ)替代198/A1 Fab片段或FVIII用作阴性对照。实施例16由抗-FIX/FIXa抗体的scFv片段和大肠杆菌碱性磷酸酶之间的融合蛋白表现FVIII-样活性用pDAP2载体系统(Kerschbaumer等，1996)将抗体198/B1(亚克隆AB2)单链FV片段(参见实施例10)与大肠杆菌碱性磷酸酶的N末端相融合。分离出两个一样的克隆命名为pDAP2198AB2#1和pDAP2-198AB2#100(图26)。所得的融合蛋白在大肠杆菌中表达，通过金属亲和层析(Kerschbaumer等，1997)纯化，并进行标准的显色分析(图27)。
图27显示在2.3nM人FIXa存在下，两抗体198/B1(亚克隆AB2)scFv片段碱性磷酸酶融合蛋白(198AB2#1和198AB2#100)的显色FVIII-样活性。我们用7.5pM FVIII作为阳性对照。实施例17由二价小抗体表现的FVIII-样活性为获得二价小抗体，用pZip1载体系统(Kerschbaumer等(分析化学249，219-227，1997)将所述抗体198/B1(亚克隆AB2)的scFv片段与两性螺旋结构相融合。简要地说，SfiI和NotI消化质粒pDAP-198AB2#100(实施例16)分离所述198/B1 scFv片段的基因。所述的DNA片段经凝胶纯化的后插入到经SfiI/NotI消化的载体pZip1中。将所得质粒测序，命名为pZip-198AB2#102(图28)。平行地，我们由名为#8860的无关单克隆抗体构建了小抗体变型。第一步，将抗体#8860的单链Fv片段组装到载体pDAP2中。克隆过程基本上按照实施例10所描述的进行。所得构建体命名为pDAP2-8860scFV#11(图29)。
将包含于pDAP28860scFv#11的scFv片段亚克隆到质粒pZip1(见上)中。获得小抗体构建体p8860-Zip#1.2(图30)由于抗体#8860不与FIX/FIXa(通过Western Blot和ELISA分析判断)反应，其适于作为阴性对照。接下来，所述的小抗体蛋白在大肠杆菌中表达，依照下述方法通过与蛋白L结合从细菌上清液中纯化出来我们用具有4ml凝胶容量的PHARMACIA XK 16/20柱的免疫纯化固定的蛋白L Plus(Pierce)进行亲和层析。所使用的缓冲液是1)平衡-缓冲液50mM L-组氨酸pH 7.0，1M NaCl，0.1％(w/v)NaN3；洗涤缓冲液50mM L-组氨酸pH(w/v)NaN3；洗脱-缓冲液100mM甘氨酸pH(w/v)NaN3；中和缓冲液2M Tris/Cl pH 8.0。
样品按下述方式制备离心(11,000xg，4℃，10min)细菌表达培养物获得细菌培养物上清液。将470g硫酸铵加到1升上清液中，所述溶液在冰上搅拌1h以沉淀蛋白。所得沉淀2℃下以14,000xg离心35min形成小球，再溶解于100ml 20mM Tris pH 7.0中。然后浓缩液经20mM TrispH 7.0透析，加入L-组氨酸至终浓度为50mM，调节pH至7.0。最后加入固体NaCl至终浓度为1M。在上样于柱上之前，样品先在室温下经16,000xg离心15min，再经0.45μM无菌滤器过滤。层析基本上按照表12中1到7所述进行。为了中和洗脱缓冲液的低pH，预先装入″Fraction-tubes″和0.2ml 2M Tris pH 8.0。
表12.最终的198/B1(亚克隆AB2)小抗体制剂(命名为198AB-Zip#102)和阴性对照8860-Zip#1.2经50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.4透析，如上所述进行显色的FVIII分析(图31)。
从图31中可以看出，所述小抗体构建体198AB-Zip#102引起大量Fxa产生(与FVIII相比)，而阴性对照小抗体8860-Zip#1.2不能。
图31显示在2.3nM人FIXa存在下，198/B1(亚克隆AB2)小抗体198AB-Zip#102的显色FVIII-样活性。我们使用4.8pM FVIII作为阳性对照，无关的小抗体(8860-Zip#1.2)和空白缓冲液(IZ)作为阴性对照。实施例18抗FIXa/FIX抗体scFv片段表现的FVIII-样活性用pMycHis6载体系统表达所述抗体198/B1(亚克隆AB2)的单链FV片段和抗体#8860的scFv片段。用以下方法构建载体pMycHis6(图32&33)用NotI和EcoRI切割载体pCOCK(Engelhardt等，1994，生物技术，1744-46)并插入下列寡核苷酸序列mychis6-co5′ggccgcagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatggggcggcacatcaccatcaccatcactaataag 3′(SEQ.ID.NO.79)和mycchisic5′aattcttattagtgatggtgatggtgatgtgccgccccattcagatcctct tctgagatgagtttttgttctgc 3′(SEQ.ID.NO.80)。
图32是质粒pMycHis6的示意图。所述的c-myc-标记序列用于在ELISA或Westem Blot分析(Evan等，分子细胞生物学1985，5(12)，3610-6页)中检测scFv片段。
加入His6-标记序列以使scFv片段易于通过金属离子层析法进行纯化(Hochuli等，1988.生物技术，61321-1325)。所述的质粒包括lacZ基因启动子(PlacZ)，PelB-前导序列(参见图26图示)，大肠杆菌复制起点(colElori)和M13噬菌体复制起始位点(M13ori)。为进行特异性筛选，所述质粒还带有由β半乳糖苷酶(AmpR)介导的抗氨苄青霉素的抗性基因。
198/B1(克隆AB2)-scFV的基因由SfiI和NotI切割质粒pDAP2-198AB2#100(实施例16)获得，再将其插入到SfiI/NotI切割的pMycHis6中。所得的质粒命名为pMycHis198AB2#102。图34是198AB2 scFv(连接到c-myc-tag和the His6-标记上)的核苷酸和氨基酸序列所得表达载体的ORF命名为pMycHis6-198AB2#102。载体pMycHis6是由NotI-EcoRI切割载体pCOCK(Engelhardt O.等，生物技术17，44-46，1994)并插入下列退火的寡核苷酸序列(5′-GGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCGGCACATCACCATCACCATCACTAATAAG-3′(SEQ.ID.No.103)和5′-TTATTAGTGATGGTGATGGTGATGTGCCGCCCCATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCTGC3′(SEQ.ID.NO.104))构建的。所得的载体命名为pMycHis6，经SfiI-NotI切割，而基因scFv 198AB2由载体pDAP2198AB2#100交换到这一载体上。
与198AB2构建体类似，#8860 scFv是从名为pDAP28860scFv克隆11的质粒上克隆的。#8860的纯scFv蛋白命名为8860-M/H#4c(质粒p8860-M/H#4c，图35).
所述的scFv在大肠杆菌中表达，并在蛋白L柱上从细菌上清液中进行亲和纯化(参见实施例17)。最终的MycHis-198AB2#102和8860-M/H#4c制剂经50mM咪唑，100mM NaCl，pH7.4透析，再如上述进行显色FVIII分析(图36)。
在图36中我们可以看出，所述的scFv构建体MycHis198AB2#102引起大量的FXa产生，而阴性对照8860-M/H#4c和空白反应缓冲液(IZ)不能。
图36显示在2.3nM人FIXa存在下198/B1(亚克隆AB2)scFv片段(MycHis-′198AB2#102)的显色FVIII-样活性。我们用4.8pM FVIII作为阳性对照，无关的scFv(8860-M/H#4c)和空白反应缓冲液(IZ)作为阴性对照。
权利要求
1.一种针对因子IX/因子IXa的抗体或抗体衍生物，其可增强FIXa的促凝血活性。
2.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述的抗体或抗体衍生物在FVIII抑制剂存在下可增强FIXa的促凝血活性。
3.如权利要求1所述的任意一种抗体，其中，所述的抗体选自IgG，IgM，IgA和IgE抗体。
4.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述的抗体或抗体衍生物选自单克隆抗体，抗体片段，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，双特异性抗体，双抗体，及其二聚体，寡聚体或多聚体。
5.如权利要求1所述的抗体衍生物，其中，所述的抗体衍生物包含互补决定区(CDR)肽。
6.如权利要求5所述的抗体衍生物，其中所述的CDR肽是CDR3肽。
7.如权利要求6所述的抗体衍生物，其中所述的CDR3肽包一种氨基酸序列，所述的氨基酸序列选自Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr；Cys-X-X-Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr-X-X-Cys，其中，X可以是任何所需的氨基酸；Tyr-Gly-Asn-Ser-Pro-Lys-Gly-Phe-Ala-Tyr；Asp-Gly-Gly-His-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Phe-Asp-Tyr；和Phe-Arg-Asn-Arg-Gly-Met-Thr-Ala-Leu-Leu-Lys-Val-Ser-Ser-Cys-Asp。
8.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述抗体或抗体衍生物的可变区包含如
图14所示的氨基酸1到357和/或氨基酸403到726。
9.如权利要求8所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述的抗体或抗体衍生物还包含人工接头序列。
10.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述抗体或抗体衍生物的可变区包含如
图15所示的氨基酸1到363和/或氨基酸409到747。
11.如权利要求10所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述的抗体或抗体衍生物还包含人工接头序列。
12.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物，其中所述抗体或抗体衍生物的可变区包含如
图16所示的氨基酸1到366和/或氨基酸412到747。
13.如权利要求12所述的抗体或抗体衍生物，其中，所述的抗体或抗体衍生物还包含人工接头序列。
14.一种杂交瘤细胞系，其表达如权利要求1所述的针对因子IX/因子IXa的抗体或抗体衍生物。
15.如权利要求14所述的杂交瘤细胞系，其中所述的细胞系选自196/AF1，#196/AF2，#193/AD3，#193/K2-1，#198/AC1/1，#198/AM1，#198/A1，#198/B1，#198/AP1，198/A1，198/B1，198/BB1，198/A1，198/B1，198/BB1。
16.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物，其是由如权利要求14所述的杂交瘤细胞系表达的。
17.一种DNA分子，其中，所述的DNA分子编码如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物。
18.一种药物制剂，其包含如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物和制药上可接受的载体。
19.如权利要求18所述的药物制剂，还包含因子IXaα和/或IXaβ。
20.治疗患有凝血疾病的病人的方法，该方法包括对所述病人施用药学上有效剂量的如权利要求18所述的制剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述的凝血疾病包括血友病A和出血素质。
22.如权利要求21所述的方法，还包括选择血友病抑制剂病人的步骤。
23.一种获得能与因子IX/因子Ixa相互作用、并且可以提高因子IXa促凝血活性的抗体或抗体衍生物的方法，该方法包括下述步骤-用选自FIX，FIXaα，FIXaβ，或其片段的抗原免疫具有免疫活性的小鼠，-分离所免疫小鼠的脾细胞，-生产杂交瘤克隆，-为获得因子Ixa促凝血活性提高筛选所述杂交瘤细胞上清液，从表现出因子Ixa促凝血活性提高的杂交瘤细胞上清液中分离纯化所述的抗体或抗体衍生物。
24.如权利要求1所述的抗体或抗体衍生物的提高因子IXa酰胺裂解活性的用途。
全文摘要
一种针对因子IX/因子IXa的抗体或抗体衍生物,其可增强FIXa的促凝血活性。
文档编号C12N5/10GK1390258SQ00815678
公开日2003年1月8日 申请日期2000年9月13日 优先权日1999年9月14日
发明者F·谢夫林格, R·凯尔施鲍默, F·G·法尔克纳, F·多纳, H·P·施瓦茨 申请人:巴克斯特股份公司