专利名称：一种农杆菌介导的植物转基因技术的制作方法
一、所属领域本发明是一种农杆菌介导的植物转基因技术，属于植物基因工程领域。
背景技术：
农杆菌是一种天然的植物基因转移载体，含有一个大质粒，即Ti质粒；Ti质粒上可以转移到植物细胞的一段DNA叫做T-DNA，其两端各有一个25bp重复序列的边界，分别称为左边界(LB)和右边界(RB)；T-DNA为双链，仅T-DNA的下链才转移到植物细胞，该链称作T链(Tstrand)；RB位于T链的5＇端；仅RB是农杆菌介导的基因转移所必要的，但LB对转移片段的大小是有意义的；LB和RB之间可插入目标DNA。农杆菌介导基因转移的优点是农杆菌细胞内的一系列蛋白有助于DNA的高效转移与整合，如VirD2蛋白在RB区的共价结合和转移中的牵引作用，VirE2蛋白对T链的包裹可以免除植物细胞中核酸内切酶等酶类对转移DNA的破坏，以及VirD2的核定位序列有助于VirD2-T strand-VirE2复合体进入植物细胞核，甚至可能有助于外源DNA在植物核基因组的整合。另外，农杆菌介导的转基因往往是单拷贝的。
因此，农杆菌介导的植物基因转移有着特别的优势。然而农杆菌的天然宿主是双子叶植物细胞，因此对禾谷类植物的感染相对较低，而禾谷类作物为人类提供了90％以上的粮食和饲料。提高禾谷类植物细胞的基因转移频率是非常重要的。
禾谷类植物的农杆菌介导转基因，相对频率较低。其原因在于1、自然状态下，细胞的受伤反应和形成愈伤组织的能力，低于双子叶植物；2、离体培养条件下，愈伤组织存在分生中心即细胞分裂中心，构成较致密的“核心”；而双子叶植物的愈伤组织则一般不存在这样的分生中心；3、由于1而表现出植物细胞表面的农杆菌结合位点少、组织表层具农杆菌结合位点的细胞的频率低；4、由于2而表现出离体培养愈伤组织的外层细胞为分化细胞，松软或较松软，一般无再生能力或再生能力低；5、由于2而表现出具农杆菌结合位点的细胞(位于细胞分裂中心)大多被包裹在愈伤组织内部；6、由于2和4和5而造成具农杆菌结合位点的细胞不能接触到转基因的载体农杆菌工程菌株；7、由于上述6点而造成农杆菌的感染频率低，从而导致农杆菌介导的禾谷类植物转基因频率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种农杆菌介导的高效植物转基因技术，以提高禾谷类以及其它植物的农杆菌介导转基因频率。
本发明的实施方案是首先将离体培养的植物愈伤组织，转移到新鲜的继代培养基上继代培养取材，再处理该愈伤组织，达到细胞离散，离散后的细胞与处于对数生长期的农杆菌工程菌株混合，共培养在固体培养基上，最后将共培养后的培养物转移到含抗生素和选择剂的培养基上，除去农杆菌，筛选转化细胞并继续生长形成愈伤组织、进一步植株再生。
下面具体对本发明进行说明1、取材 离体培养的植物愈伤组织，转移到新鲜的继代培养基上继代培养7～10天，以愈伤组织细胞分裂进入对数期为取材指标；愈伤组织的挑选对转基因频率的提高有帮助，对禾谷类愈伤组织而言更是如此；挑选具有分化再生能力的愈伤组织细胞，尤其是胚性细胞，对基因转化的成功是至关重要的。
2、细胞离散 在无菌条件下，取该愈伤组织置于无菌的研钵压散，或可适当研磨，达到愈伤组织细胞分散为单个细胞至10细胞以下的细胞团、但破裂的细胞数目较少；对很多愈伤组织，可以采用镊子直接夹碎愈伤组织的办法；机械办法分散细胞后，可适当采用短时间(2-3天)的液体悬浮培养使细胞适度恢复。
3、混合共培养 离散后的细胞与处于对数生长期的农杆菌工程菌株混合，共培养在固体培养基上；可以采用液体悬浮培养的办法进行共培养。农杆菌工程菌株过夜培养及其与植物细胞共培养时，额外添加一定浓度的酚类物质，如100μmol/L的乙酰丁香酮，有助于提高转化频率。
4、转基因细胞的筛选 共培养后的培养物转移到含抗生素和选择剂的培养基上，除去农杆菌，筛选转化细胞并继续生长形成愈伤组织、进一步植株再生。如果采用液体悬浮共培养，可以直接向液体培养物中添加抗生素和选择剂，这样除菌和筛选更有效。
本发明的特征和优点在于1、采用细胞离散的办法，可以将具有农杆菌结合位点的细胞暴露，增加与农杆菌工程菌株接触的植物感受态细胞比例；2、可以大幅度提高农杆菌介导转基因的频率；3、操作简单。
具体实施例方式实施例1 烟草细胞，根癌农杆菌介导转基因根癌农杆菌活化 50ml三角瓶，加入10ml液体YEB，高压灭菌降温至室温后，加入抗生素Km(硫酸卡那霉素)至终浓度50mg/L；取一环经划线分离的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA 4404(含质粒pBI121)，接入该培养液中，150rpm振荡26±1℃下过夜培养，达到OD600＝1.0；取2ml过夜培养物，加入到10ml新的含Km的YEB中，150rpm振荡18±1℃下培养4～6h，达到OD600＝1.0；如未达到但较接近OD6001.0，则可用离心-重悬的办法来达到。
植物细胞处理及转化步骤普通烟草(Nicotiana tabacum)离体培养愈伤组织 为已建的稳定的愈伤组织细胞系和悬浮细胞系。烟草细胞系继代培养在含1.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA和0.2mg/L KT的MS培养基(MS无机盐和有机成分，蔗糖30g/L，pH5.4～5.6)上；20～25天继代一次，26±1℃，16h光/8h暗，37.9μmol.m-2·s-1。悬浮培养用同样成分的培养液，120～150rpm振荡。
1、愈伤组织在新的继代培养基上继代培养10天，选取分裂旺盛、体积小、细胞质浓厚的新形成的愈伤组织细胞，置于已加入20ml继代培养液的100ml三角瓶中，用镊子夹碎愈伤组织使细胞分散至小于20细胞的细胞团(无肉眼明显可见的颗粒)，150rpm振荡2天；悬浮培养物用60目筛网过滤，过滤液再用200目筛网过滤；取200目筛上的细胞和小细胞团约1g重悬于已加入15ml继代培养液的100ml三角瓶中，150rpm振荡2天；2、加入新鲜的根癌农杆菌活化液1.0ml，25±1℃，100rpm振荡2天；3、加入羧苄青霉素(Cb)和硫酸卡那霉素(Km)至终浓度分别为600mg/L和300mg/L，继续26±1℃、150rpm振荡2～3天；4、200目筛网过滤，取筛上的细胞和小细胞团，重悬于10ml含600mg/L Cb和300mg/L Km的继代培养液中，铺平板；平板为同样含600mg/L Cb和300mg/L Km的固体继代培养基，26±1℃暗培养。
实施例2 玉米细胞，根癌农杆菌介导转基因根癌农杆菌活化 同实施例1。
植物细胞处理及转化步骤
玉米(Zea mays)离体培养愈伤组织 为未成熟胚和成熟胚诱导所建立的愈伤组织培养物。玉米未成熟胚为盾片长度0.7～1.5mm、授粉14天左右；成熟胚来自成熟种子。愈伤组织在含2.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L6-BA的培养基E(MS无机盐+0.5mg/L VB1+200mg/L Asn，蔗糖20g/L，pH5.2～5.4)上诱导产生，在含1.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA的培养基E上继代培养；20～25天继代一次，26±1℃，16h光/8 h暗，37.9μmol.m-2·s-1。
1、新诱导的愈伤组织，继代培养2～3次；2、选取细胞分裂旺盛、细胞体积小、细胞质浓厚的愈伤组织分裂中心的致密“核”，置于已加入20ml继代培养液的100ml三角瓶中，用镊子充分夹碎，使愈伤组织细胞分散至小于30细胞的细胞团，150rpm振荡8～10天；3、悬浮培养物用60目筛网过滤，取筛上的小愈伤组织块和细胞团，镊子夹碎；重悬于已加入15ml继代培养液的100ml三角瓶中，150rpm振荡4～5天；4、悬浮培养物用60目筛网过滤，取筛上的小愈伤组织块和细胞团，镊子夹碎；重悬于已加入15ml继代培养液的100ml三角瓶中；5、加入新鲜的根癌农杆菌活化液1.0ml，22±1℃，100rpm振荡2天；6、加入羧苄青霉素(Cb)和硫酸卡那霉素(Km)至终浓度分别为600mg/L和500mg/L，继续26±1℃、150rpm振荡2～3天；7、200目筛网过滤，取筛上的细胞和小细胞团，重悬于10ml含600mg/L Cb和500mg/L Km的继代培养液中，铺平板；平板为同样含600mg/LCb和500mg/L Km的固体继代培养基，26±1℃暗培养。
实施例3 水稻细胞，根癌农杆菌介导转基因根癌农杆菌活化 同实施例1。
植物细胞处理及转化步骤水稻(Oryza sativa)离体培养愈伤组织 水稻细胞的离体培养已成为一种常规技术。因此，可以用已经获得的胚性愈伤组织，也可以按下述方法诱导。如已有悬浮培养的细胞系，可参照实例1进行转化。愈伤组织用0.7～1.5cm的幼穗或0.7～1.5mm幼胚诱导产生。诱导培养基为MS+脯氨酸500mg/L，水解酪蛋白500mg/L，2，4-D 2mg/L，6-BA 0.2mg/L，蔗糖20g/L，pH5.2～5.4。继代培养基同诱导培养基，但其中2，4-D为1mg/L。15～20天继代一次，26±1℃，16h光/8h暗，37.9μmol.m-2·s-1。1、新诱导的愈伤组织，继代培养2～3次；2、取2～3g生长旺盛的胚性愈伤组织，用镊子夹碎，使愈伤组织细胞分散至小于30细胞的细胞团；3、加入新鲜的根癌农杆菌活化液0.3ml，镊子边夹碎边充分搅拌均匀，22±1℃，固体继代培养基上共培养3天；4、用含600mg/L Cb的1/2继代培养液冲洗，200目筛网收集细胞和小细胞团；5、用含600mg/L Cb的固体继代培养基上，26±1℃暗培养3天；6、在含600mg/L Cb和400mg/L Km的固体继代培养基上，26±1℃暗培养。
实施例4 黑麦细胞，根癌农杆菌介导转基因根癌农杆菌活化 同实施例1。
植物细胞处理及转化步骤黑麦(Secale cereale)离体培养胚性愈伤组织 为已建的稳定的愈伤组织胚性细胞系，较致密的颗粒状，易碎，浅黄色。黑麦胚性愈伤组织继代培养在含2.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA的继代培养基N(无机盐大量元素为N6、其余成分为MS，蔗糖30g/L，pH5.0～5.4)上；20～25天继代一次，26±1℃，16h光/8h暗，37.9μmol.m-2·s-1。
1、取2～3g继代培养10天左右、生长旺盛的胚性愈伤组织，用研钵压碎愈伤组织使细胞分散至小于20细胞的细胞团；2、加入新鲜的根癌农杆菌活化液0.3ml，轻轻研磨混匀，25±1℃，固体继代培养基上共培养2天；3、用含600mg/L Cb的1/2继代培养液冲洗，200目筛网收集细胞和小细胞团；4、含600mg/L Cb的固体继代培养基上，26±1℃暗培养3天；5、在含600mg/L Cb和400mg/L Km的固体继代培养基上，26±1℃暗培养。
权利要求
1.一种农杆菌介导的植物转基因技术，其特征是首先离体培养的植物愈伤组织，转移到新鲜的继代培养基上继代培养取材，再处理该愈伤组织，达到细胞离散，离散后的细胞与处于对数生长期的农杆菌工程菌株混合，共培养在固体培养基上，最后将共培养后的培养物转移到含抗生素和选择剂的培养基上，除去农杆菌，筛选转化细胞并继续生长形成愈伤组织、进一步植株再生。
2.据权利要求1所述的农杆菌介导的植物转基因技术，其特征是受体细胞充分离散，可采用机械的办法，亦可采用适当酶解的办法。
3.如权利要求书2所述的农杆菌介导植物转基因技术，其特征在于使受体细胞离散的机械办法，如研钵压碎、镊子夹碎。
4.权利要求书1所述的农杆菌介导植物转基因技术，其特征在于受体细胞离散前后，可对组织、细胞进行分类筛选，也可不对组织、细胞进行分类挑选。
5.如权利要求书4所述的农杆菌介导植物转基因技术，其特征在于受体细胞离散前后，可采用手工、网筛过滤挑选分裂旺盛的分生组织细胞、胚性愈伤组织细胞。
6.如权利要求书1所述的农杆菌介导植物转基因技术，其特征在于离散后的受体细胞，在与农杆菌工程菌株混合共培养前，可先进行预培养，也可不进行预培养。
全文摘要
本发明公开了一种农杆菌介导植物细胞转基因技术。针对目前所采用的禾谷类植物转基因技术中作为农杆菌受体的感受态植物细胞少而导致的转基因频率比低,通过机械或其它方法离散植物细胞,使得感受态细胞的表面暴露,达到提高农杆菌介导转基因频率的目的,并且操作简单。
文档编号C12N15/74GK1342772SQ01128988
公开日2002年4月3日 申请日期2001年10月24日 优先权日2001年10月24日
发明者郭骁才 申请人:中国科学院成都生物研究所