专利名称：一种广谱性质粒稳定因子PSF－Cxc及其分离方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程；具体地说，涉及质粒的稳定技术。
背景技术：
无论在基因工程的研究领域还是在工业和农业应用领域，质粒的稳定性都是非常重要的关键技术。通过大量深入的研究，人们目前对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)的质粒稳定因子及其广泛应用有了全面的认识。但是，人们对革兰氏阳性菌的质粒及其稳定因子却知之甚少。因为作为基因工程载体的E.coli质粒不能有效地在革兰氏阳性菌里繁殖，因此限制了有关革兰氏阳性菌的基础研究和应用研究。Clavibacter Xyli subsp.cynodontis(Cxc)是一种革兰氏阳性菌，能广泛寄生于植物而不引起明显的植物病症。部分Cxc菌株含有天然质粒(pCXC100)，我们发现在没有任何选择的条件下pCXC100能稳定地在Cxc菌中遗传。我们从pCXC100中分离出了一段长约0.8Kb的广谱性质粒稳定因子(Plasmid Stabilization Function from Cxc，简称PSF-Cxc)，并对此稳定因子在其它质粒中的稳定效果进行了测试。我们发现PSF-Cxc能稳定不同来源的质粒，而且在Cxc和E.coli中有相同稳定效果。PSF-Cxc可以在Cxc和E.coli中稳定多种质粒，有广阔的应用前景。到目前为止，我们未发现有任何类似的文献报道或专利报道，也未在基因数据库(GenBank)中发现任何与它同源的序列。
发明内容
本发明的目的是提供一种广谱性质粒稳定因子(PSF-Cxc)；提供一种分离PSF-Cxc的方法；提供一种将PSF-Cxc应用于科研、工农业生产方面的方法。
本发明的技术方案是1、分离PSF-Cxc的方法通过适当限制性内切酶把pCXC100切成不同长度能覆盖整个pCXC100全长的DNA片段(10-24.5Kb长)，把这些片段克隆到E.coli质粒pBR325上的合适酶切位点得到质粒pCXC101，pCXC102，pCXC103，pCXC104和pCXC105。通过稳定性检测，发现只有pCXC101和pCXC105能100％稳定地在Cxc和E.coli里传代。所以确定PSF-Cxc存在于pCXC101和pCXC105所包含的pCXC100的DNA片段里。(图1A)把pCXC101所含的DNA插入片段用合适的限制性内切酶进行酶切，并把所得到的DNA片段重新克隆到pBR325的相应酶切位点，得到质粒pCXC106，pCXC107，pCXC108，pCXC109和pCXC110。稳定性检测发现只有pCXC106和pCXC108能稳定在Cxc和E.coli里传代，表明PSF-Cxc存在于pCXC106和pCXC108所共有的约5.5Kb长的NcoI-SmaI DNA片段内。(图1A)用NcoI酶切质粒pCXC106，然后用DNase I在锰离子存在的情况下消解此线形质粒的两端，通过控制消解时间得到不同的DNA片段。消解过的DNA进行BglII酶切，分离出的不同长度的酶切片段，将其克隆入E.coli质粒pBCSK(+)的EcoRV和BamHI酶切位点，得到克隆pCXC111，pCXC112，pCXC113和pCXC114。因为消解后的DNA片段不含有完整的Cxc复制子，因而以上克隆不能在Cxc中复制，只能转化入E.coli细胞内进行稳定性检测。检测表明pCXC113含有PSF-Cxc的必需的DNA片段。(图1B)用HindIII和KpnI酶切pCXC113，然后用Exonuclease III和S1 nuclease组合的消解试剂盒处理。通过控制消解时间得到丢失了不同长度DNA片段的pCXC113，自连后得到一系列新质粒，pCXC116和pCXC117是其中的两个。稳定性检测表明这两种质粒均不含有功能的PSF-Cxc。(图1B)用XbaI酶切pCXC113，用Klenow酶填平粘末端以防止Exonuclease III从Hind III一端消解质粒。再用EcoRI酶切此线化的质粒，用Exonuclease III和S1 nuclease组合的消解试剂盒处理。通过控制消解时间得到丢失了不同长度DNA片段的pCXC113，自连后得到一系列新质粒，pCXC119和pCXC120是其中的两个。稳定性检测表明pCXC119能100％稳定在E.coli细胞内传代，而pCXC120不能。所以pCXC119含有功能的PSF-Cxc。(图1B)用HindIII和EcoRI酶切pCXC113，得到的片段连接到pBCSK(+)的相应酶切位点，得到pCXC118。“pCXC118”，其分类命名为E.coli JM109/pCXC118；其保藏日期为2001年12月13日；其保藏单位为中国典型培养物保藏中心中国.武汉.武汉大学 邮编 430072；其保藏编号为CCTCC NOM 201043。
用BamHI酶切去掉pCXC119的插入片段上的相应DNA片段，然后自连，得到pCXC121。稳定性检测表明pCXC118能100％稳定在E.coli细胞内传代，而pCXC121不能。所以pCXC118含有功能的PSF-Cxc。(图1B)因此，我们确知pCXC118和pCXC119均含有来源于pCXC100的质粒稳定因子(PSF-Cxc)。因为pCXC118含有合适的酶切位点，所以被用于构建测序亚克隆和进一步的稳定性分析。
2、测序分析PSF-Cxc质粒pCXC118所插入的DNA片段(773-bp)经过进一步酶切和克隆，并分别对每一个亚克隆测序，得到下面DNA序列1GGATCCCCCG GGCTGCAGGA ATTCGTTGAT TTCCGCGATC AGGCCAATGA51 GGTCTCTGCT TGGATCTGCC CAGTAGTGAT GAGTCGAGCG AGCGCGATCG101 TTGATCCCGT CGAAGTGTTG GTTCAGGCGC TTGTGTAGTA CCGAGAAGGC151 ATGCCCGAAC TCTGCGTCAT CTTCGTAGAG GCGGTCGAAG GTCGGCGATG201 AGCCTGCTCG GCGTACTGCG CCTTCATGTC CGCGACCGCG AGCTCTAGCG251 GGCTAGCCAC AGCACTCCCC CGTTCACGAC CCGTACCTCC GGTCAGCTTC301 CCAGTGGGCG CCCGCGAGTA ACGCCTCGCT CAGCATTCTC GAATCGTCGT351 CCTTCGTTGT ACCGCTGCTC GAGGCGTTGC ACCTCCGCGT CCAGCGCCGC401 GGCGATGAAG CCCGAGAACG TCCGATGACC CTCCTGCAGA TGGGTGAGCG451 TGTACCCGTC CTCAGCCGTG CTCGGCGCTC CTCCCCCACC GTGACAGTCA501 TCTTGACCTC AGAACGCCGC CCTCGGGGCT CCGAGGATCC TCCCGGCACC551 GGCACCGGGA CCGTGGGCGC GACACTGTCC GCCACGGACG GCGACTCCGG601 CACGAAAGCC GGCGCCACCA TCGACGGTGC TGCGGAGGCT TCGCGCTGCG651 ACCGGATCAG GGATCCCGCA CCGGGACGCG ACGGCGGCGG TGCAACCGTG701 CGATCAGCCA TTCGTGACCA CGCTCATTTC GGACTCCTTT GCCTGGATAC751 GTGCGACGAG CTCCGCGGAG ATCGCCTGGA GGTCGTCAGC GATCAAGCTT这段DNA序列有两个开放阅读框(ORF)，一个ORF(#1)的阅读方向是HindIII→SphI，可以编码的蛋白约为145个氨基酸；另一个ORF(#2)的阅读方向是XhoI→HindIII，可以编码的蛋白约为125个氨基酸。此773-bp长的DNA片段不但含有编码质粒稳定因子(PSF-Cxc)的DNA序列，也含有启动质粒稳定因子表达所需的DNA序列；所以此773-bp长的DNA片段可以独立在不同质粒中起到稳定效果。
本序列含有质粒稳定因子(PSF-Cxc)的全部DNA序列和其在载体pBCSK(+)上的克隆位点。本序列是通过对pCXC118的亚克隆测序获得的。载体上的序列用下划线标出。
3、检测PSF-Cxc对不同质粒的稳定效果为了检测PSF-Cxc在不同质粒和不同宿主中的稳定效果，我们把它的DNA序列分别克隆到一系列E.coli质粒上包括pLARF3，pBR325，pBCSK(+)，pUC118和pUC119，并在E.coli中检测不含PSF-Cxc的质粒和含PSF-Cxc的质粒的稳定性。结果表明PSF-Cxc的存在能把所有不稳定的质粒变成100％的稳定，而对原本很稳定的质粒没有影响。因为上述质粒中只有pLARF3，pLARF3-S和pCXC101(由pBR325构建而成，含有PSF-Cxc)可以在Cxc中复制存活，所以对这三个质粒在Cxc中的稳定性进行了检测，发现带有PSF-Cxc的质粒均为100％的稳定。这些结果表明PSF-Cxc对不同质粒在不同宿主中均有非常显著的稳定效果。
质粒在Cxc and E.coii中的稳定性如下表所示
*标出含有PSF-Cxc(773-bp)的质粒。质粒pCXC101含有一个包括PSF-Cxc在内15kb的从pCXC100而来的DNA片段(图1A)。
4、PSF-Cxc的应用此质粒稳定因子的基因(773-bp DNA片段)可以通过酶切连接的方法或体内重组的方法克隆到任何目的质粒的多克隆位点或其他位点，以得到具有高稳定性的新质粒。
(1)在分子生物学研究方面，PSF-Cxc可以克隆到实验室用的各种质粒上，包括原核生物(E.coli，Cxc和其他细菌等)用的质粒和真核生物(酵母，实验室培养的细胞等)用质粒，以增加质粒的稳定性，减少抗生素的应用和降低实验成本。以酵母培养为例，PSF-Cxc的克隆可以因为不需要营养缺陷型培养基而大大降低实验成本。同时酵母在完全培养基上的生长速度比在营养缺陷型培养基上的快两倍左右，所以使用PSF-Cxc可以大大缩短一些实验的周期。
(2)在工业生产方面，目前许多生物工程药物是由E.coli表达质粒上的目的基因而得到的。质粒的不稳定性造成的质粒丢失使目的产品产量较低，产量的不稳定现象也较严重。为了保证含质粒的细菌成为优势菌群，发酵时可抗生素以抑制不含质粒细菌的生长。但抗生素的加入不但增加生产成本、同时也因为杀死不含质粒的细菌和减缓细菌生长而增加能耗、并为生物工程药物的发酵后提取造成一定困难。因此，在发酵工程质粒上装入PSF-Cxc可以省去在发酵中加入抗生素而带来的种种不便，并能提高产品的产量、降低成本和能耗。更为重要的是，通常发酵中使用抗生素会使抗生素大量流失在环境中，造成严重的抗性问题。因此以PSF-Cxc代替抗生素不但简单易行，更是可以保护环境。
(3)在农业生物技术工程方面一方面是转基因植物的获取，将PSF-Cxc装入基因工程质粒以避免植物中因为无法加入抗生素而引起的质粒丢失。二是内生菌表达系统方面，将PSF-Cxc装入基因工程表达质粒可以保证质粒在植物中的稳定性，因而保证在整个植物生长期中目的基因的有效表达。
综上所述，本发明具有以下优点和积极效果(1)本质粒稳定因子对不同的质粒在不同宿主中具有很强的稳定效果；(2)本质粒稳定因子长为773-bp、可独立发挥对质粒的稳定效果，不需要任何其他的辅助因子；(3)本质粒稳定因子目前克隆在E.coli质粒pBCSK(+)的多克隆位点里，可以方便地克隆到任何其他的目的质粒中。
(4)本质粒稳定因子可以广泛应用在与基因工程有关的科研工作、工业和农业生产等方面。尤其是可以显著提高基因工程产品的产量，减少抗生素污染；具有不可估量的经济价值。
中国典型培养物保藏中心用于专利程序的培养物保藏受理通知书(收据)分类命名 E.coli JM109/pCXC118保藏日期 2001年12月13日保藏单位 中国.武汉.武汉大学 邮编 430072保藏编号 CCTCC NOM201043
图1-稳定因子(PSF-Cxc)的分离过程图A-初步确定含有质粒稳定因子的DNA片段；B-确定含稳定因子的最小DNA片段；图2-稳定因子(PSF-Cxc)序列分析图。
如图1A，pCXC100经过一系列酶切得到的合适DNA片段克隆到载体pBR325的相应酶切位点，得到克隆pCXC101，102，103，104和105。这些克隆所含的DNA片段覆盖了51Kb长的pCXC100的所有区段，并且相邻克隆中间有3-8Kb的共同覆盖区。这些克隆转化到Cxc或E.coli细胞内，并在不含有抗生素的情况下至少长24代(Cxc)或32代(E.coli)，之后检测质粒是否还存在于每个细胞中。如果传代后的每个细胞仍还有相关质粒，我们就认为此质粒含有稳定因子，在上图中标为“+”；如果有些细胞丢失了相关质粒，我们就认为此质粒不含稳定因子，标为“-”。有些克隆因为缺失了天然质粒pCXC100的复制子，所以在Cxc中得不到转化子，无法进行稳定性检测，标为“ND”。经过稳定性检测，我们发现克隆然pCXC101是含有稳定因子且插入片段最小的克隆，我们对pCXC101进行进一步的酶切和克隆，得到上图所示的克隆pCXC106，107，108，109和110。并进行以上所述的稳定性分析。
如图1B确定含质粒稳定因子的最小DNA片段。质粒pCXC106所含的DNA片段经过酶切和DNaseIII消解，得到pCXC111至pCXC114。质粒pCXC113所含的DNA片段经过酶切和ExoIII/S1消解，得到pCXC115至pCXC121。稳定性分析如文中所述。
如图2，标出PSF-Cxc的DNA序列(含图2的多克隆位点)所含的常用酶切位点和其从两个方向分别可读出的开放阅读框(ORFs)，以及每个ORF所编码的蛋白序列。
具体实施例方式
编码质粒稳定因子PSF-Cxc的基因(773-bp DNA片段)克隆在pBCSK(+)的EcoRI和HindIII位点中间，可以通过酶切连接的方法或体内重组的方法克隆到任何目的质粒的多克隆位点或其他位点，以得到具有高稳定性的新质粒。
权利要求
1.一种广谱性质粒稳定因子PSF-Cxc，其特征是E.coli JMl09/pCXC118，CCTCC NOM 201043。
2.按权利要求1所述的广谱性质粒稳定因子PSF-Cxc，其特征是被一段长为773-bp DNA所编码，有两个开放阅读框(ORF)，一个ORF编码的蛋白约为145个氨基酸；另一个编码的蛋白约为125个氨基酸；此773-bp长的DNA片段也含有启动质粒稳定因子表达所需的DNA序列。
3.按权利要求1或2所述的广谱性质粒稳定因子PSF-Cxc，其特征是其DNA序列为1GGATCCCCCG GGCTGCAGGAATTCGTTGAT TTCCGCGATC AGGCCAATGA51 GGTCTCTGCT TGGATCTGCC CAGTAGTGAT GAGTCGAGCG AGCGCGATCG101 TTGATCCCGT CGAAGTGTTG GTTCAGGCGC TTGTGTAGTA CCGAGAAGGC151 ATGCCCGAAC TCTGCGTCAT CTTCGTAGAG GCGGTCGAAG GTCGGCGATG201 AGCCTGCTCG GCGTACTGCG CCTTCATGTC CGCGACCGCG AGCTCTAGCG251 GGCTAGCCAC AGCACTCCCC CGTTCACGAC CCGTACCTCC GGTCAGCTTC301 CCAGTGGGCG CCCGCGAGTA ACGCCTCGCT CAGCATTCTC GAATCGTCGT351 CCTTCGTTGT ACCGCTGCTC GAGGCGTTGC ACCTCCGCGT CCAGCGCCGC401 GGCGATGAAG CCCGAGAACG TCCGATGACC CTCCTGCAGA TGGGTGAGCG451 TGTACCCGTC CTCAGCCGTG CTCGGCGCTC CTCCCCCACC GTGACAGTCA501 TCTTGACCTC AGAACGCCGC CCTCGGGGCT CCGAGGATCC TCCCGGCACC551 GGCACCGGGA CCGTGGGCGC GACACTGTCC GCCACGGACG GCGACTCCGG601 CACGAAAGCC GGCGCCACCA TCGACGGTGC TGCGGAGGCT TCGCGCTGCG651 ACCGGATCAG GGATCCCGCA CCGGGACGCG ACGGCGGCGG TGCAACCGTG701 CGATCAGCCA TTCGTGACCA CGCTCATTTC GGACTCCTTT GCCTGGATAC751 GTGCGACGAG CTCCGCGGAG ATCGCCTGGA GGTCGTCAGC GATCAAGCTT
4.一种分离权利要求1所述的广谱性质粒稳定因子PSF-Cxc的方法，包括通用的分子克隆技术如酶切连接等，其特征是用DNase I和Exonuclease III-S1 nuclease组合消解线化质粒的末段，以得到含有PSF-Cxc功能的最短DNA序列(773-bp)，并通过稳定性检测确定稳定功能的存在与否。
5.一种应用权利要求1所述的广谱性质粒稳定因子PSF-Cxc的方法，其特征是此质粒稳定因子的基因(773-bp DNA片段)可以通过酶切连接的方法或体内重组的方法克隆到任何目的质粒的多克隆位点或其他位点，以得到具有高稳定性的新质粒。
全文摘要
本发明公开了一种广谱性质粒稳定因子PSF－Cxc及其分离方法和应用。涉及基因工程;具体地说,涉及质粒的稳定技术。本发明提供的广谱性质粒稳定因子PSF－Cxc(E.coli JM109/pCXC118,CCTCC NO:M 201043),由一段长为773－bpDNA所编码,此基因含两个开放阅读框(ORF),编码的蛋白分别为145个氨基酸;和125个氨基酸。此质粒稳定因子的基因可以通过酶切连接的方法或体内重组的方法克隆到任何目的质粒的多克隆位点或其他位点,即可得到具有高稳定性的新质粒。本质粒稳定因子对不同的质粒在不同宿主中具有很强的稳定效果;可以广泛应用在与基因工程有关的科研工作、工业和农业生产等方面。尤其是可以显著提高基因工程产品的产量,减少抗生素污染;具有不可估量的经济价值。
文档编号C12P19/34GK1385538SQ0113832
公开日2002年12月18日 申请日期2001年12月20日 优先权日2001年12月20日
发明者李太元, 张翼, 陈泽安 申请人:武汉大学