专利名称：人g-csf的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的高产量生产G-CSF的方法，其通过在生产期期间高盐诱导增加质粒稳定性来实现。
背景技术：
细胞因子粒细胞集落刺激因子(GranulocyteColony Stimulating Factor,G-CSF)治疗显著改善了患有严重的慢性中性白细胞减少患者的生活质量[Jones等JAMA270 :1132-1133(1993)]。G-CSF是从骨髓储备释放粒细胞以及增强其抗微生物活性的强效的内源触发剂。G-CSF在急性疾病的多种临床前模型中被广泛评估，并且一般都得到了很有希望的结果[Marshall J. C. Shock 24 120-9 (2005) ] 0由于其在化疗周期中得到证实的功效，G-CSF成为肿瘤学中重要的生物技术药物。G-CSF已被克隆并在多种类型的细胞中表达，例如微生物细胞[Souza L. M. Science 232:61-65(1986) ；Hu Z. Y等Zhongguo ShenghuaYaowu Zazhi (1999), 20 :55-57]、酵母细胞[Lasnik M. A.等 Biotechnol. Bioeng. 81 768-774(2003) ；Lee S. M.等韩国专利 KR 160934B119981116]、水稻细胞[Hong 等 ProteinExpr Purif.在线发表(2005)]、猫细胞[Yamamoto 等Gene 274 :263-269 (2001)]、中国仓鼠卵巢细胞[Monaco L.等 Gene. 180 :145-150 (1996)]、昆虫细胞[Shinkai 等 Protein Expr.Purif. 10 :379-385(1997)],甚至在转基因山羊中表达[Ko J. H 等 Transgenic Res. 9 215-22 (2000)] 0用于药物用途的G-CSF主要在大肠杆菌(Escherichia coli)中以包涵体的形式生产[Jevsevar S.等 Biotechnol. Prog. 21 :632_639 (2005)],所述包涵体是非天然构象的重组蛋白形成的不溶聚集物[Baneyx F. &Mujacic M. Nature Biotechnol. 22 1399-1408 (2004)],其通常不具有生物活性[Bernardez C. E. Curr. Opin. Biotechnol. 9 157-163(1998)]。G-CSF 的分泌生产技术也已报道[Jeong KJ. & Lee S. Y. Protein ExprPurif. 23 :311-318(2001) ；Lee S. Y.等 Methods Mol. Biol. 308 :31-42 (2005)]。分泌表达通常导致正确折叠形式的G-CSF释放到周质空间或细胞外培养基中，但是产量比通过包涵体形式获得的要少得多。因此，在大肠杆菌中以包涵体形式表达G-CSF具有商业优势。可以以商业上可行的方式，在分离和溶解包涵体后采用变性和复性方法容易地从包涵体获得正确折叠的、具有生物活性的 G-CSF 蛋白[Rudolph R,在 Protein Engineering principlesand Practice 中；Cleland, J. L.，Craik, S. C.,电子数据系统；ffiley-Liss, Inc. NewYork，1996 ;283-298 页；Rathore A. S.等 J Pharm Biomed Anal. 32 :1199-1211 (2003)]。在大肠杆菌中生产重组蛋白最有效的方法之一是补料-分批发酵，其可以以循环和非循环的模式进行。非循环方法较不复杂，因此更适于工业生产。事实上，现有技术记载了利用非循环的补料-分批方法生产GCSF的最高产量之一为4. 2-4. 4g/L[Yim SC等 Bioprocess and Biosystems Engineering (2001, 24, 249-254]。为获得更高的累积量、而以循环模式进行补料-分批发酵造成质粒的高不稳定性[Choi S. -J.等J. Microbiol.Biotechnol. 10 :321-326 (2000)],从而限制了该方法的稳健性(robustness)。通常，为了使产物高表达，需要将含有产物基因的染色体外质粒以其合适的形式保持在细胞中。这通常通过向培养基加入合适的抗生素以对重组微生物保持选择压力来实现。已有报道，通过在发酵过程中每1-2小时加入抗生素(氨苄青霉素)以降低重组菌株的“分离不稳定性(segregational nonstability) ” 来提高 G-CSF 的表达水平(KrivopalovaG.N.等俄罗斯专利RU 2158303C220001027)。从终产物清除抗生素的调控需要必然使其应用受到限制。越是大量使用抗生素，越是可能对环境产生不良影响。但是降低抗生素选择压力常常导致质粒稳定性和表达水平的降低，这削弱了该方法的稳健性。因此，在限制抗生素使用的同时提高质粒的稳定性和产物的表达水平(特别是在生产期)是一个技术上的挑战。此外，通常在大体积的培养物中，生产期期间的质粒低稳定性也可由代谢压力所致[Saraswat V.等 FEMS Microbiol. Lett. 179 :367-373 (1999)]，并可能造成低表达水平 [Cheng C. et al Biotechnol. Bioeng. 56 :23-31 (1997)]。除了保持抗生素的高选择压力，还可以在载体构建水平上提高质粒的稳定性[Schweder T.等 Appl Microbiol Biotechnol. 38:91-93(1992) ；PanS. H.和 MalcomB. A. Biotechniques. 29 :1234-1238 (2000)]。实践中，可以通过调整培养条件(例如避免营养饥饿)来提高质粒稳定性[Smith &Bidochka Can. J. Microbiol. 44 :351-355 (1998)]。当实施大规模的底物限制性补料-分批方法时，营养受限/饥饿极易发生，并且在低复杂度的方法中过于频繁或大量地加入抗生素以维持高产量和质粒高稳定性也是不切实际且昂贵的解决方案。因此，需要开发一种使用简单而稳定的方法来保持质粒高稳定性从而制备高体积产量G-CSF的替代方法。
发明内容
本发明描述了一种在大肠杆菌中以高体积产量(volumetric yield)生产粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的非循环式补料-分批方法，其通过在生产培养基和培养液中高浓度联合使用钾离子与镁离子或钠离子来保持培养物中质粒高稳定性来实现。
图I显示在生产期中使用高浓度的钾和钠阳离子对分批收获时BL21 (DE3)细胞中含有G-CSF基因的质粒稳定性的影响。在生产期中，在第2批中使用高浓度的钾盐和钠盐，而在第I批中则不使用高浓度的钾盐和钠盐。各批在30L发酵罐中单独进行。图2显示在生产期中使用高浓度的钾和钠阳离子对所收获批次中G-CSF体积产量的影响。在生产期中，在第2批中使用高浓度的钾盐和钠盐，而在第I批中则不使用高浓度的钾盐和钠盐。各批在30L发酵罐中单独进行。图3显示在生产期中使用高浓度的镁和钾阳离子对分批收获时BL21(DE3)细胞中含有G-CSF基因的质粒稳定性的影响。在生产期中，在第4批中使用高浓度的镁盐，而在第3批中则不使用高浓度的镁盐。两批中均使用高浓度的钾盐，并在30L发酵罐中单独进行。图4显示使用高浓度的镁和钾阳离子对所收获批次中G-CSF体积产量的影响。在生产期中，在第4批中使用高浓度的镁盐，而在第3批中则不使用高浓度的镁盐。两批中均使用高浓度的钾盐，并在30L发酵罐中单独进行。图5显示在生产期中使用高的比生长速率对所收获批次中G-CSF体积产量的影响。在生产期期间，第4批的平均比生长速率约为0. 041/h，而第5批的平均比生长速率则约为0. 071/h。两批中均使用高浓度的钾盐和镁盐，并在30L发酵罐中单独进行。图6显示在生产期中使用高浓度的硫胺素对所收获批次中G-CSF体积产量的影响。在生产期期间，第I批的生产培养基中包含7g/L硫胺素，而在第6批中则不使用硫胺素。两批在30L发酵罐中单独进行。发明详述本发明涉及一种改进的以提高水平的体积产量生产粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的发酵方法。本发明还公开了提高质粒稳定性的培养条件，其进一步提高G-CSF的体积产量。本发明的方法包括经由多次诱导的非循环补料-分批方法，其在生产培养基中存在高 浓度的钾以及另外的高浓度无机盐(例如钠、镁等)下进行。出乎意料的是，当本发明的使用盐的方法(在下文中有详述)与高的比生长速率联合使用时，仍保持高的质粒稳定性并导致体积产量进一步提高。本发明进一步详细描述如下可以应用任何粒细胞集落刺激因子(本文也称为“G-CSF”)多肽。术语“粒细胞集落刺激因子”或“G-CSF”是指天然G-CSF、其突变蛋白、片段、融合蛋白、类似物和衍生物，它们表现出天然hG-CSF的至少60%生物活性或受体结合活性或者保持至少约80%氨基酸一致性。这样的G-CSF序列包括Genbank序列ID GI :27437048以及美国专利No. 4810643中所述的序列。使用本领域公知的转化技术，用合适的表达载体转化大肠杆菌细胞，所述表达载体包含G-CSF的编码序列以及选自t7、tac和类似启动子的合适启动子连同其它载体组分。在下文所述的方法中，所述发酵是指用于生产G-CSF的微生物、尤指重组大肠杆菌的需氧生长。在该方法中，分批生长期(batch phase of growth)是指在接种后,不提供营养而只在发酵罐内的培养液中加入氢氧化铵(如果需要的话)的一段时期。所述培养液是细胞、培养基以及培养基和细胞的衍生物(如果存在的话)的悬浮液。生长期中底物限制性补料-分批是指生长期的一部分，在此期间通过以主要碳源/能源(例如，葡萄糖)浓度受到限制的方式向培养液加入补料分批生长培养基而出现的生物量显著增加(至少翻2番)。所述培养基的流速决定了培养物的比生长速率。诱导前培养基是指与生长培养基组成不同、在加入诱导剂(如IPTG)之前加入培养液的培养基。诱导是通过加入诱导剂(如IPTG和乳糖)来明显增加细胞中G-CSF浓度的方法，所述浓度增加可通过现有技术中已知的工具进行测定。生产培养基与生长培养基的组成不同，在诱导G-CSF基因期间将生产培养基加入发酵罐的培养液中。生产培养基还可以以底物(例如葡萄糖)浓度保持受限的方式加入。生产培养基的流速决定了生产期期间培养物的比生长速率。预先用编码G-CSF的合适表达载体转化的大肠杆菌宿主细胞首先在37°C在摇瓶中培养，用以培育发酵罐用种子培养物。所述种子培养物用于接种到发酵罐中的无菌生长培养基。一旦重组大肠杆菌培养物开始生长并且培养液中的葡萄糖浓度下降到0. 5g/L或更少，底物限制性补料-分批模式的发酵生长期便开始了。在生长期期间，以底物限制性补料-分批模式加入的补料-分批生长培养基保持连续(指数或恒定速率)或不连续地加入。在培养液中细胞密度达到l_60g/L的干细胞重量并且葡萄糖浓度低于0. 5g/L后，加入生产前培养基，随后开始加入生产培养基并采用连续或不连续的底物限制性方式继续添加。使用IPTG对G-CSF基因进行多次诱导。平均比生长速率在加入诱导剂期间或之后均不下降。PH值保持在大约5-7。温度保持在约30-42°C。在加入生产前培养基2_48小时后，根据本领域所述技术取出培养基并进行下游加工。生长期培养基包含碳源和能源，其选自葡萄糖、甘油等或其混合物；复合培养基组分，其选自酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白酶水解物、大豆酪蛋白水解物等或其混合物；合适的盐/营养物，其选自柠檬酸、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、丁酸钠、硫胺素、甘氨酸和氯化锌等。其它发酵条件例如通气、搅拌、接种物、接种时间等均尽可能方便地按照现有技术已知的进行选择。 所述生产前培养基包含复合培养基组分(选自酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白酶水解物、大豆酪蛋白水解物等)连同营养物(例如硫胺素、甘氨酸等或其混合物)；抗生素，例如卡那霉素和氨苄青霉素等。合适的盐类选自柠檬酸、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、丁酸钠和氯化锌等，从而使培养基中含有高浓度水平的K离子以及或者Na离子或者Mg离子。所述生产培养基除了包含生产前培养基的成分外还包含碳源。合适的碳源可以选自甘油、葡萄糖、果糖等或其混合物。本发明优选的碳源为葡萄糖。在生产期期间，培养液中保持高水平的K离子以及或者Na离子或者Mg离子。在培养液中，K离子浓度保持在约60mM至约300mM，Na离子浓度保持在约60mM至约300mM，Mg离子浓度保持在约150mM至约250mM。在一个优选的实施方案中，培养液中的K离子浓度为90mM至150mM，Na离子浓度为60mM至120mM，Mg离子浓度的范围为180mM至220mM。在另一实施方案中，加入高浓度的硫胺素(范围在5g/L至10g/L)提供产量为5-6g/L 的 G-CSF。本发明的方法通过在整个生长期和生产期中保持质粒高稳定性(75-90% )来获得高产量的 G-CSF (5-9. 5g/L)。实施例I高浓度的Na和K离子对质粒稳定性和体积产量的影响该实验在30L发酵罐中进行。将用人G-CSF基因转化的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞
的种子培养物接种到如下组成的生长培养基中。
成分接种前浓度
KH2PO413.3 g/L
(NH4)2HPO44.0 g/L
酵母提取物1.0 g/L葡萄糖10.0 g/L
柠檬酸1.7 g/L
MgSO4-TH2O1.2 g/L
痕量元素溶液20 0 mL/L
卡那霉素50 mg/L痕量金属溶液
成分浓度
FeCI3.6H200.162 g/L
ZnCI2.4H200.0144 g/L
C0CI2.6H2O0.12 g/L
Na2Mo04.2H200.012 g/L
CaCI2.2H200.006 g/L
CuCI21.9 g/L
H3BO30.5 g/L以底物限制性补料-分批模式加入以下“补料-分批生长培养基”，生物量得到了显著增加
成分浓度
葡萄糖700 g/L
MgS04.7H2020 g/L
痕量元素溶液20 mL/L
卡那霉素500 mg/L在生长期用氢氧化铵调节pH至6. 8-7. O。温度保持在37°C。当第2批中的光密度达到约50AU(在600nm)后，将由以下成分组成的诱导前培养基加入培养液成分浓度
酵母提取物84.38 g/L
氯化钟75.41 g/L
氯化钠123.13 g/L
盐酸疏胺素8.44 g/L 培养液中钾和钠阳离子的终浓度分别约为120mM和250mM。
随后开始加入如下生产培养基进行培养
成分浓度
葡萄糖270 g/L
MgS04.7H20I g/L
酵母提取物214 g/L
盐酸疏胺素7 g/L
氯化钾8.94 g/L (仅在第2批中)
氯化钠17.5g/L (仅在第2批中)通过向培养液多次加入经过滤除菌的IPTG溶液来诱导G-CSF基因的表达。在生产期，用氢氧化铵作pH调节剂将pH维持在6. 8。温度保持在37°C。将卡那霉素加至培养物以施加选择压力。为了探究盐对质粒稳定性影响的潜力，在第2批的生产期期间使用的卡那霉素量(37. 5mg，一次性加入)约为第I批中使用量(2925mg，分多次加入)的1%。质粒稳定性通过以下步骤来测定首先将批次末期的样品无菌收集在无菌管中，并将适当稀释的适量样品无菌涂布在含有和不含卡那霉素(50mg/L)的Luria-Bertani培养基上。将平板在37°C培养48小时，并对包含统计学显著的菌落的平板进行计数。将含有卡那霉素平板上获得的集落数除以不含卡那霉素平板上获得的集落数得到的数值用于计算质粒的稳定性。第2批的质粒稳定性(96. 8% )是第I批的质粒稳定性(45. 0% )的两倍还多，这表明了钠和钾阳离子对于提高质粒稳定性的重要性(图I)。在SDS-PAGE电泳后，通过将GCSF条带的光密度定量与标准样品的标准曲线比较来确定G-CSF的体积产量。第I批的体积产量为5. 38g/L，第2批为5. 81g/L。第2批的体积产量比第一批大约高出8% (图2)。实施例2高浓度Mg和K阳离子对质粒稳定性和体积产量的影响该实验在30L发酵罐中进行。由于两个批次(第3批和第4批)的生产期培养基中除了镁阳离子浓度以外均相同(包括钾阳离子的浓度)，因此结果反映的是钾阳离子和镁阳离子联合使用的影响。将用人G-CSF基因转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的种子培养物接种到如下组成的生长培养基中。
成分接种前浓度
KH2PO413.3 g/L
(NH4)2HPO44.0 g/L
酵母提取物1.0 g/L
葡萄糖10.0 g/L
柠檬酸1.7 g/L
MgSO4JH2O1.2 g/L
痕量元素溶液20.0 mL/L
卡那霉素50 mg/L痕量金属溶液
成分浓度
I e( l3.6H200.162 g/L
ZnCI2.4H200.0144 g/L
C0CI2.6H2O0.12 g/L
Na2Mo04.2H200.012 g/L
CaCI2.2H200.006 g/L
CuCI21.9 g/L H3BO30.5 g/L以底物限制性和利-分批模式加入以下“补料-分批生长培养基”，生物量得到了显著增加成分浓度
葡萄糖700 g/L
MgS04.7H2020 g/L
痕量元素溶液20 mL/L
卡那霉素500 mg/L在生长期，用氢氧化铵作为pH调节剂将pH维持在6. 8-7. 0的范围内。温度保持在37°C。当光密度达到约50AU (在600nm)后，将由以下成分组成的诱导前培养基加入培养液
成分浓度
酵母提取物84.38 g/L
氯化钾75.44 g/I
盐酸疏胺素8.38 g/L
硫酸镁187.06g/L (仅在第4批中)随后开始加入如下生产培养基进行培养
成分浓度
葡萄糖270 g/L
硫酸镁I g/L (仅在第3批中)
硫酸镁50.3 g/L (仅在第4批中)
酵母提取物214 g/L
盐酸疏胺素I g/L
氯化钾8.94 g/L通过向培养液多次加入经过滤除菌的IPTG溶液来诱导G-CSF基因的表达。在生产期，用氢氧化铵作为PH调节剂将pH维持在6. 8。温度保持在37°C。将卡那霉素加至培养物以施加选择压力。在生产期期间使用等量的卡那霉素(37.5mg，一次性加入)。在生产期期间，培养液中钾和镁阳离子的浓度分别为约120mM和200mM。
如前所述测定质粒的稳定性。第4批中的质粒稳定性(97. 3% )比第3批中的质粒稳定性(91.8%)高出约6%，这表明了镁和钾阳离子对于提高质粒稳定性的有效性(图3)。镁和钾阳离子存在时得到的质粒稳定性比第一批(在生产期没有高浓度的盐)中的质粒稳定性高出116. 2%。在SDS-PAGE电泳后，通过将GCSF条带的光密度定量与标准样品的标准曲线比较来确定G-CSF的体积产量。第3批的体积产量为5. 48g/L，第4批为8. 35g/L(图4)。第4批的体积产量比第一批大约高出55%。实施例3生产期期间的高比生长速率对体积产量的影响该实验在30L发酵罐中进行。两个批次(第4批和第5批)的生产期培养基组成(包括镁和钾阳离子的浓度)均相同。第5批的生产期期间平均比生长速率比第4批生产期中的要高。将用人G-CSF基因转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的种子培养物接种到如下组成的生长培养基中。
成分接种前浓度
KH2PO413.3 g/L
(NH4)2HPO44.0 g/L
酵母提取物1.0 g/L 葡萄糖10.0 g/L 柠檬酸1.7 g/L
MgSO4JH2O1.2 g/L
痕量元素溶液20.0 mL/L 卡那霉素50 mg/L痕量金属溶液、成分浓度
FeCl3.6H200.162 g/L
ZnCl2.4H200.0144 g/L
CoC12.6H200.12 g/L
Na2Mo04.2H200.012 g/L
CaCI2^H2O0.006 g/L
CuCI21.9 g/L
H3BO30,5 g/L 以底物限制性补料-分批模式加入以下“补料-分批生长培养基”，生物量得到了显著增加
成分浓度
葡萄糖700 g/L
MgSO4JH2O20 g/L
痕量元素溶液20 mL/L
卡那霉素500 mg/L在生长期，用氢氧化铵作为pH调节剂将pH维持在6. 8-7. 0的范围内。温度保持在37°C。当光密度达到约50AU (在600nm)后，将由以下成分组成的诱导前培养基加入培养液
成分浓度
酵母提取物84.38 g/L
氯化钾75.44 g/L
盐酸疏胺素8.38 g/L
硫酸镁187.06g/L随后开始加入如下生产培养基进行培养
成分浓度 葡萄糖270 g/L 硫酸镁50.3 g/L 酵母提取物214 g/L 盐酸疏胺素I g/L 氯化钾8.94 g/L通过向培养液多次加入经过滤灭菌的IPTG溶液来诱导G-CSF基因的表达。在生产期，用氢氧化铵作为PH调节剂将pH维持在6. 8。温度保持在37°C。将卡那霉素加至培养物以施加选择压力。在生产期期间使用等量的卡那霉素(37.5mg，一次性加入)。第4批中生产期期间的平均比生长速率约为0. 041/h，而第5批中的平均比生长速率约为0. 071/h0
如前所述测定G-CSF的体积产量，第4批中为8. 35g/L，第5批中为9.94g/L。第5批中的体积产量比第4批的约高出19% (图5)。两批的批次末样品的质粒稳定性均很高(> 75% )。实施例4在生产期使用高浓度硫胺素对体积产量的影响该实验在30L发酵罐中进行。将用人G-CSF基因转化的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞
的种子培养物接种到如下组成的生长培养基中。成分接种前浓度
KH2PO413.3 g/L
(NH4)2HPO44.0 g/L
酵母提取物1.0 g/L
葡萄糖10.0 g/L
柠檬酸1.7 g/L
MgS04.7H201.2 g/L痕量元素溶液20.0 mL/L
卡那霉素50 mg/L (在第I批中)
氨千青霉素100 mg/L (在第6批中)痕量金属溶液
成分浓度
FeCI3.6H200.162 g/L
ZnCI2.4H200.0144 g/L
C0CI2.6H2O0.12 g/L
Na2Mo04.2H200.012 g/L
CaCI2^H2O0.006 g/L
CuCI21.9 g/L
H3BO30.5 g/L以底物限制性补料-分批模式加入下述“补料-分批生长培养基”，生物量得到了
显著增加成分浓度
葡萄糖700 g/L
MgS04.7H2020 g/L
痕量元素溶液20 mL/L
卡那霉素500 mg/L (在第I批中)氨千青霉素仅在第6批中每次加入50 mg/L(培养液)。在该批的“补料分批生长”期共加入6次。在生长期，用氢氧化铵作为pH调节剂将pH维持在约6. 8。温度保持在37°C。当光密度达到约50AU (在600nm时)后，开始加入如下生产培养基进行培养
成分浓度
葡萄糖270 g/L
MgS04.7H20I g/L
酵母提取物214 g/L
盐酸疏胺素7 g/L (仅在第I批中)
卡那霉素2.925 g (在第I批中多次加入) 氨爷青霉素2.689 g (在第6批中多次加入)通过向培养液多次加入经过滤灭菌的IPTG溶液来诱导G-CSF基因的表达。在生产期，用氢氧化铵作为PH调节剂将pH维持在6. 8。温度保持在37°C。如前所述测定G-CSF的体积产量。第I批(高硫胺素批次)的批次末样品的体积产量比第6批(4. 86g/L)高出约10. 7%，这表明了高浓度硫胺素对于提高G-CSF体积产量的有效性(图6)。本方法的优点(I)较高的体积产量使得以较小规模即可实现较大产量，因而限制了工艺放大时的资本支出。(2)使用成本非常低的培养基成分(镁盐、钾盐和镁盐)实现高体积产量。(3)具有高质粒稳定性的培养物在代谢压力条件下(例如在高比生长速率下的G-CSF基因表达)更能够生产高体积产量的G-CSF。以下内容对应于母案申请的原始权利要求书
I. 一种改进的在培养液发酵中获得高体积产量的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方法，其中所述培养液包含浓度为60mM至180mM的K离子以及高浓度的选自Na或Mg的无机阳离子。
2.项I的方法，其中Na离子的浓度为90mM至300mM，Mg离子的浓度为150mM至250mMo3.项I或2的方法，其中所述培养液包含选自酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白酶水解物和大豆酪蛋白水解物的复合培养基成分。4.项I至3中任一项的方法，其中所述方法为底物限制性补料分批方法。5.前述项中任一项的方法，其中在生产期期间对基因进行多次诱导。6.前述项中任一项的方法，其中所述培养液还包含选自葡萄糖、甘油和果糖的碳源。7.前述项中任一项的方法，其中平均比生长速率在生产期和前生产期保持一致。8.前述项中任一项的方法，其中K离子浓度为90mM至150mM，Na离子浓度为60mM至120mM，Mg离子浓度为180mM至220mM。9.前述项中任一项的方法，其中质粒稳定性至少为75%。10. 一种通过在培养液中加入浓度为60mM至180mM的K离子来提高G-CSF质粒稳定性的方法。11.前述项中任一项的方法，其中生产期中的抗生素浓度低于生长期中使用的抗生素浓度。12. 一种生产G-CSF的方法，其包括如下步骤i)将合适的大肠杆菌培养物接种至发酵罐，所述大肠杆菌培养物预先已用编码G-CSF的合适表达载体进行转化；ii)在生长期采用分批及补料分批模式以提高生物量；iii)加入合适的诱导前培养基；iv)以底物限制性补料分批模式加入合适的生产培养基，其中对基因进行多次诱导；v)其中培养液中的K、Na和Mg离子的终浓度如前述项中一项或多项所述。13.前述项中任一项的方法，其中G-CSF的体积产量为5g/L至9. 5g/L。14. 一种改进的在发酵中获得高体积产量G-CSF的方法,其中所述培养液包含5g/L至10g/L的硫胺素。
权利要求
1.一种生产G-CSF的方法，其包括如下步骤 i)将合适的大肠杆菌培养物接种至发酵罐，所述大肠杆菌培养物预先已用编码G-CSF的合适表达载体进行转化； ii)用合适的培养液进行分批及补料分批模式以提高生物量； iii)向所述培养液中加入合适的生产培养基，其中所述培养液包含至少5g/L的硫胺素。
2.权利要求I的方法，其中所述培养液还包含浓度为60mM至180mM的K离子以及高浓度的选自Na离子和Mg离子的无机阳离子，其中Na离子的浓度为90mM至300mM，Mg离子的浓度为150mM至250mM。
3.权利要求I的方法，其中所述硫胺素以5g/L至10g/L的范围存在。
全文摘要
本发明公开了一种改进的高产量生产G-CSF的方法，其通过在生产期期间高盐诱导增加质粒稳定性来实现。
文档编号C12P21/02GK102776261SQ20121026532
公开日2012年11月14日 申请日期2007年3月5日 优先权日2006年3月6日
发明者桑吉夫·库玛·门迪拉塔, 潘卡伊·R·帕特尔, 维伯尔·萨拉斯沃特 申请人:卡迪拉保健有限公司