专利名称：一种旱地土壤微生物磷测定方法
技术领域：
本发明涉及一种土壤微生物的测定方法，更具体地说它是一种旱地土壤微生物磷的测定方法。
背景技术：
土壤微生物不仅控制土壤有机质和主要养分(如氮、磷、硫)的循环过程，而且其本身就是一个重要的活性养分库，对维持作物的养分供应起重要作用。土壤微生物量及养分含量测定对于了解土壤微生物与土壤养分转化动力学及作物供应能力等方面的功能都有重要意义。
测定土壤微生物磷的基本方法是由Brookes等(1982)和Hedley等(1982)分别建立的。
Brookes法采用氯仿蒸汽熏蒸24后，0.5摩尔碳酸氢钠提取剂(pH8.5)在1∶20土水比提取30分钟，测定熏蒸后提取无机磷(Pi)的增量。他们假定土壤微生物磷的熏蒸释放率为40％，熏蒸释放后微生物磷的土壤固定率与无机磷(外加正磷酸盐态磷)一致。
Hedley法采用液态氯仿直接加入土壤的方法熏蒸(30分钟)，用碳酸氢钠提取剂在1∶60土水比提取16小时，测定熏蒸后提取全磷(Pt)增量。他们发现在无土壤的情况下，培养微生物磷的熏蒸释放率远高于40％，加入土壤的提取率也与外加无机磷没有相关性。尽管Hedley等建议采用了0.4作为熏蒸提取的全磷增量与土壤(pH6.2～8.2)微生物磷的转换系数(Kp)，同时指出需要对微生物磷在不同土壤的回收率进行测定。
上述两种方法都存在有一些实际问题，特别是对酸性土壤应当采用那种方法必须进行对比研究才能确定。Brookes法的假设条件不一定与实际情况相符。Hedley法也存在几个问题。第一，采用风干后培养的土样，势必改变土壤微生物原有状态。第二，提取时间过长，对于在磷固定能力强的土壤可能会因熏蒸释放的微生物磷的转化(成无机态)和吸附增加而影响提取效率。第三，采用1∶60的土水比限制了测定土壤的样品用量(0.5克)，这对于新鲜土壤来说其代表性是不够的(过2毫米筛至少要在2克以上)。第四，全磷测定不仅消化过程繁琐，而且稀释比例进一步扩大(3～5倍)，从而加大分析误差。这些问题使该方法在磷固定能力强和微生物磷很低的土壤因熏蒸增量太小和测定误差相对较大而不能使用。
另外，有些学者对土壤微生物磷测定方法也做过改进性研究，但未取得一致的结果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有测定土壤中微生物磷的方法精密度和准确度差，以及适用范围窄，过程繁琐等不足，而发明了一种精确测定不同类型土壤的微生物磷的方法。该方法的发明对开展我国乃至全球的土壤微生物磷和磷在土壤中的微生物转化，土壤磷素活化和循环等研究提供了可靠的测定方法。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案一种旱地土壤微生物磷测定方法，该方法依次包括如下步骤(1)将采集的新鲜土壤除去土样中可见植物残体(如茎、叶、根)及土壤动物(蚯蚓等)，过筛(孔径2毫米)，彻底混匀、调节含水量为饱和持水量的40～50％左右，称取9份4～10克(烘干基重)土样；(2)其中3份土样加入0.5毫升培养的土壤细菌和真菌(4∶4～8，重量比)混和液(含磷量为220～270微克磷/毫升)；3份土样不加，同时在0.05～0.08Mpa真空度和20～40℃条件下，用去乙醇氯仿熏蒸24小时，除去氯仿后再用0.025～0.5摩尔提取剂(土水比1∶10～25)提取；另3份土壤直接用于提取；测定提取液磷含量；(3)土壤微生物磷含量转换方法土壤微生物磷＝熏蒸与不熏蒸土壤提取的磷增强/外加培养微生物的磷的回收率。
所述提取剂和土水比最佳值为0.5mol/LNaHCO3，1∶20。
本发明提出了测定不同类型土壤(pH3.3～7.4)微生物磷的土壤熏蒸的真空度和温度技术参数，最佳提取剂和土水比，土壤细菌和真菌的培养和收获方法以及土壤微生物磷含量精确测定方法。
本发明一种旱地土壤微生物磷测定方法具有如下优点(1)规范化了土壤熏蒸的真空度和温度参数，提高了不同批次样品测定结果的可比性；(2)发明了最佳提取剂和土水比，提高了不同类型土壤中微生物磷提取测定的精密度；(3)发明了简便而有效的土壤细菌和真菌培养基及培养和收获方法；(4)发明了对于不同类型的土壤直接采用外加培养微生物磷的回收率来测定土壤微生物磷的方法，与以前常用方法比较大大提高了土壤微生物磷测定结果准确度；(5)该方法提取剂对操作人员无毒负作用，操作安全简便快速；(6)适应性广，适合于我国主要类型旱地土壤(pH3.3～7.4)的微生物磷精确测定，乃至可用于全球旱地土壤。
综上所述，目前还没有测定土壤微生物磷的一种标准统一的方法。本发明一种精确测定不同类型土壤的微生物磷的方法，对开展我国乃至全球的土壤微生物磷以及磷在土壤中的微生物转化、土壤磷活化和循环等研究提供了可靠的测定方法。
图1为本发明测定方法流程示意图。
具体实施例方式
下面结合附图、试剂配置、仪器和设备、操作步骤详细说明本发明的具体实施方式
。一、试剂配制1.1去乙醇氯仿制备在通风橱中将分析纯氯仿和水按1∶2(体积比)加入分液漏斗，摇动1分钟，放出氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
1.2提取剂选择土壤磷提取剂配制成0.025～0.5摩尔浓度，提取液pH为4.5～8.5。
1.3显色试剂配制(1)硫酸溶液取70毫升分析纯浓硫酸稀释至0.5升；(2)钼酸铵溶液取20克分析纯钼酸铵溶于水中定溶至0.5升；(3)抗坏血酸溶液取1.32克抗坏血酸溶于75毫升水即可；
(4)酒石酸锑钾溶液取0.2743克分析纯酒石酸锑钾溶于水定溶0.1升；(5)混合显色试剂试剂(1)、(2)、(3)、(4)按10∶3∶6∶1混合。
1.4土壤细菌和真菌培养基配制(1)细菌培养基(克/升)牛肉膏8～12、蛋白胨2～4、氯化钠3～7，真菌抑制剂0.00～0.02，水1000。
(2)真菌培养基(克/升)硝酸钠0.5～0.8、磷酸二氢钾0.2～0.5、硫酸镁0.1～0.2、硫酸铁0.005～0.007、酵母膏0.15～0.18和蔗糖9～11，链霉素硫酸盐0.06～0.12，四环素氢氯化合物0.003～0.006，水1000。二、仪器和设备真空干燥器，水泵抽真空装置(制备)，往复振荡器，高压灭菌锅，摇床，土壤筛，塑料桶(带螺旋盖可密封)，移液器，加液器，分光光度计，聚乙烯提取瓶，容量瓶，烧杯，三角瓶。三、操作步骤3.1样品前处理采集的新鲜土壤应立即处理或保存在4℃冰箱中，测定前除去土样中可见植物残体(如茎、叶和根)及土壤动物(蚯蚓等)，过筛(孔径2毫米)，彻底混匀。处理过程应尽量避免破坏土壤结构，含水量过高应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜(为40～50％的饱和持水量)。此样品即可用于土壤实时测定。开展其它研究(如培养实验)可将土壤置于密封的大塑料桶内培养7～15天，桶内应有水以保持湿度，内放一小杯氢氧化钠溶液吸收土壤呼吸产生的二氧化碳，培养温度为25℃。经过前培养的土壤应立即分析。如果需要保留，应放置于4℃的恒温箱中，下次使用前需要在上述条件下至少培养24小时。这些过程为消除土壤水分限制对微生物的影响，及植物残体组织对测定的干扰。3.2土壤细菌和真菌培养及混合悬浮液制备土壤细菌和真菌的培养、收获及配比方法有创新。在每瓶细菌培养液中接种10-4土壤悬浮液0.5～1毫升，在25℃黑暗条件下培养5天。收获细菌采用离心方法(15分钟，1500～4000转/分钟)，再用0.85％氯化钠溶液重复洗涤3～7次。在每瓶真菌培养液中接种10-1土壤悬浮液0.5～1毫升，在25℃下培养5天。采用过滤方法收集真菌菌丝，用0.85％氯化钠溶液洗涤3～7次。洗涤过的细菌和真菌分别加入适量0.85％氯化钠溶液制成悬浮液，置于4℃冰箱中保存。使用前真菌适当打散。将细菌和真菌悬浮液按4∶4～8(干重比)制成混合悬浮液，使其基本接近土壤中细菌和真菌比例。测定细菌与真菌混合悬浮液全磷含量，使混合液含磷量在220～270微克磷/毫升。3.3土壤熏蒸和提取经前处理的土壤称取4～10克(烘干基重)土样3份，于烧杯中，置底部有少量水和氯仿的真空干燥器中，并放入盛有25毫升去乙醇氯仿和防爆珠的烧杯1～3个，在-0.04～-0.08Mpa真空度和20～40℃温度下使氯仿剧烈沸腾3～5分钟，在25℃下熏蒸24小时。将土样转入干净真空干燥器，抽真空3～5次，除去土壤中氯仿。然后将土样转入提取瓶，加入0.025～0.5摩尔提取剂，震荡，过滤。同时，另取3份4～10克土样于提取瓶中直接提取。3.4外加微生物磷回收率测定称取3份4～10克土壤，加0.5毫升细菌和真菌混合悬浮液，混匀，按上述方法熏蒸提取。3.5提取液磷测定提取液磷测定应及时进行。在25毫升容量瓶中加入适量(1～5ml)提取液。同时制备标准磷工作曲线，加入混合显色剂前，提取液及其工作曲线用盐酸中和，放置1～4小时并不断摇动以排除二氧化碳。加蒸馏水至约20毫升，在25～30℃温度下加入4毫升混合显色试剂，定容，混匀，用分光光度计测定。3.6土壤微生物磷含量转换方法土壤微生物磷＝熏蒸与不熏蒸土壤提取的磷增强/外加培养微生物的磷的回收率。
需要说明的是对于本领域变通技术人员来说，在不需要创造性劳动的情况下，还可以对本发明测定方法作出若干改进和变型，这同样属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种旱地土壤微生物磷测定方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)将土壤pH3.3～7.4除去土样中可见植物残体及土壤动物，过筛，混匀、调节含水量，称取土样；(2)将3份土样加入0.5毫升培养的土壤细菌和真菌混和液；细菌培养基为(克/升)牛肉膏8～12、蛋白胨2～4、氯化钠3～7，真菌抑制剂0.00～0.02，水1000；真菌培养基(克/升)硝酸钠0.5～0.8、磷酸二氢钾0.2～0.5、硫酸镁0.1～0.2、硫酸铁0.005～0.007、酵母膏0.15～0.18和蔗糖9～11，链霉素硫酸盐0.06～0.12，四环素氢氯化合物0.003～0.006，水1000；土样不加，同时在-0.05～-0.08Mpa真空度和20～40℃条件下，用去乙醇氯仿熏蒸24小时，除去氯仿后再用0.025～0.5摩尔提取剂提取；土样直接用提取剂提取；测定提取液中磷含量；(3)土壤微生物磷含量转换方法土壤微生物磷＝熏蒸与不熏蒸土壤提取的磷增强/加培养微生物的磷的回收率。
2.根据权利要求1所述的一种旱地土壤微生物磷测定方法，其特征在于所述提取剂和土水比为0.5mol/LNaHCO3，1∶20。
全文摘要
本发明涉及一种旱地土壤微生物磷测定方法。该方法规范了氯仿熏蒸土壤的温度和真空度技术参数,发明了适合不同类型的土壤微生物磷提取的最佳提取剂和水土比,大大提高了测定结果的精密度；提高了测定结果的准确度。它克服了现有测定土壤微生物磷的方法中,精密度和准确度适应范围窄等缺点。可广泛适用于我国乃至全球的土壤微生物磷的测定,并为探讨磷素在土壤中的微生物转化、土壤磷素循环和土壤磷的活化等研究提供了可靠的测定方法。
文档编号C12Q1/02GK1423116SQ01138248
公开日2003年6月11日 申请日期2001年12月5日 优先权日2001年12月5日
发明者吴金水, 肖和艾, 李卫红, 陈桂秋 申请人:中国科学院长沙农业现代化研究所