专利名称：利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种用酶降解天然产物及多糖的方法，具体地说，涉及一种利用蜗牛酶将天然产物及多糖降解成可利用的、具有一定生物活性的小分子和聚合度为3-20的低聚糖的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是将天然产物或多糖溶解成溶液，按酶量/底物＝0.2-25(重量百分比，以下除有特殊说明外，均为重量百分比)加入蜗牛酶进行降解，降解的反应温度为15-80℃，时间1-10小时，溶液pH＝3.0-10.0。本发明指的天然产物包括纤维素、人参、黄芪、甘草等，多糖原料包括壳聚糖、果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等。
本发明具有如下优点蜗牛酶在降解天然产物和多糖时是以内切方式切断β(1-4)糖苷键，因此它在降解多糖的同时，也能将较高聚合度的寡糖进一步降解成为低聚合度的寡糖。将降解后较高聚合度的寡糖从反应体系中分离出来，一方面可以得到较高聚合度的寡糖，另一方面蜗牛酶可以重复使用。实验结果表明反应温度为15-80℃、pH＝3-10搅拌、并且脱乙酰度为50-100％的底物条件下可获得较高聚合度的壳寡糖。
图2显示了各种酶不同添加顺序对壳聚糖降解的影响。
1、多种酶在降解多糖为寡聚糖的过程中对活性物质还原糖的影响将壳聚糖称取一定量溶于醋酸和醋酸钠的缓冲液(pH2-8，0.01-1M)中，加入纤维素酶、菠萝蛋白酶、脂肪酶、壳聚糖酶、蜗牛酶和溶菌酶等酶液，使酶量/壳聚糖为0.01/1，然后所有的酶液迅速加入到壳聚糖溶液，摇匀后置于20-80℃的水浴中恒温，开始计时反应。结果壳聚糖酶和蜗牛酶降解壳聚糖产生的还原糖量最高，另外四种酶所产生的还原糖都比较相似。说明专一性酶(壳聚糖酶)与非专一性酶(蜗牛酶)对壳聚糖具较好的降解效果。
2、多种酶在降解多糖为寡聚糖的过程中对产物聚合度的影响取纤维素酶、菠萝蛋白酶、脂肪酶、壳聚糖酶、蜗牛酶和溶菌酶等多种酶1-100ml加入到10-1000ml 0.5-5％的壳聚糖溶液中，20-80℃，50-250rpm的摇床中反应2-200小时。结果发现壳聚糖的粘度降低了90％，其产物分析结果得知，产物除单糖和二糖外，还有39％的三糖和约6％的五糖。用硫酸铵沉淀上清液得到粗酶，作用于上述的0.5-5％的壳聚糖溶液中，发现粘度开始显著下降，底物基本降解完毕时，产物中的四、五糖的比例为10％。从酶液的粘度下降和产物组成可以知道，蜗牛酶具有内切酶活性。研究结果表明蜗牛酶可以作为壳寡糖生产的可选酶种。
3、蜗牛酶反应条件对壳聚糖降解活性的影响底物底物浓度太高时，因为溶液粘度太大，酶分子不能自由分散在溶液中，所以还原糖的浓度降低，同时因为底物浓度大，有部分未能降解，在测定时由于壳聚糖沉淀而吸附部分还原糖从而使还原糖的浓度降低。
温度温度对壳聚糖降解有很大影响，温度太低，溶液粘度太大，所以还原糖的浓度较低；而温度太高，由于酶活受到影响，从而还原糖的浓度较低。因此选定温度为15-80℃，较佳温度是20-80℃。
搅拌搅拌有利于的降解反应。见
图1，搅拌对蜗牛酶降解壳聚糖的影响(用磁力搅拌器和恒温水浴反应)。
pH值在调节不同pH时，选定较酸、中性和介于二者之间的三种情况考察了蜗牛酶降解壳聚糖的pH的影响。在较酸的条件下，由于酶的活性受到抑制，所以还原糖的浓度较低，而pH在一定值以上，壳聚糖就会部分不溶解而沉淀出来，所以选定pH在2-10的缓冲区间，较佳pH＝3-10。
下面再通过实例对本发明的技术进一步说明，其中实施例1至实施例4阐述了蜗牛酶在不同条件下降解酶的效果，实施例5至实施例20公开了利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的具体方法。
实施例1多种酶降解壳聚糖的效果将0.01-10％的壳聚糖溶于醋酸缓冲液中，加入各种酶，酶∶底物＝1-10∶2-200，在20-80℃下反应，以反应液黏度下降的百分率表征各种酶的降解活性。用平氏黏度计测定初始和降解若干小时后反应液通过测量段的下降时间t0、t，则壳聚糖黏度下降的百分率为t0-t/t0。
各种酶降解壳聚糖的效果所用酶 黏度下降百分率(％)脂肪酶70.4纤维素酶 75.3壳聚糖酶 94.6菠萝蛋白酶90.4溶菌酶0.2蜗牛酶96.2实施例2不同组合酶的添加顺序对各种酶降解壳聚糖的影响试验分析得知蜗牛酶不仅和脂肪酶、纤维素酶具有切断大分子壳聚糖的功能，而且具有切断低分子壳聚糖的功能。在先添加蜗牛酶的情况下，由于蜗牛酶首先将壳聚糖降解成低片段的壳聚糖，而后加入的脂肪酶和纤维素酶因为不能降解较低片段的壳聚糖而未能发挥功能，相反情况，首先加入脂肪酶和纤维素酶，二者都能先降解大分子的壳聚糖为较低片段的壳聚糖，再加入蜗牛酶后，蜗牛酶降解较低片段的壳聚糖使得还原糖的浓度比前种情况的高。见图2，各种酶不同添加顺序对壳聚糖降解的影响实施例3不同蜗牛酶量对壳聚糖降解活性的影响加入不同酶量到0.01-1％壳聚糖溶液中，使得酶/壳聚糖分别为一定剃度，在20-80℃水浴中反应1-10小时，试验结果得知，当底物浓度一定时，酶浓度增加，将使壳聚糖的粘度下降率增加，降解所产生的还原糖量也随着增加。
蜗牛酶量对壳聚糖降解的还原糖含量的影响酶量(％) 还原糖含量(mg/ml)0.10 1.170.20 1.860.25 2.740.30 4.25
实施例4蜗牛酶降解壳聚糖为具有一定聚合度及生物活性的壳寡糖的批次试验由于蜗牛酶在降解壳聚糖时是以内切方式切断β(1-4)糖苷键，因此它在降解壳聚糖的同时，也能将较高聚合度的寡糖进一步降解成为低聚合度的寡糖。
批次投料酶浓度产品收率产品聚合度(kg)(％) (％) 比色 质谱C-2 1.4 0.14 /19.1 3-16C-3 0.8 0.26 /19.8 3-15C-4 1.0 0.30 /10.3 3-13C-5 1.0 0.30 37.9 17.0 4-11C-6 2.0 0.20 69.2 11.9 3-11C-7 3.0 0.20 90.1 10.2 5-22C-8 2.0 0.25 44.2 11.2 4-24C-9 2.4 0.25 89.2 13.0 4-26C-102.0 0.25 64.6 25.8 4-26C-116.0 0.13 39.1 13.2 4-16实施例5将1％的壳聚糖溶于醋酸缓冲液中，加入蜗牛酶，酶/底物＝1，反应时间5小时、在20℃下反应，pH＝5，可获得聚合度为3-20的壳寡糖。以反应液黏度下降的百分率表征各种酶的降解活性。
实施例6将20％的果胶多糖加水溶解，加入蜗牛酶，酶/底物＝0.2，反应时间10小时、温度80℃，pH＝3，可获得聚合度为3-20的果胶低聚糖。
实施例7将5％的卡拉胶多糖加水溶解，加入蜗牛酶制剂，酶/底物＝25，反应时间1小时、温度15℃，pH＝10，可获得聚合度为3-20的卡拉低聚糖。
实施例8将0.2％的琼胶多糖水溶液，加入蜗牛酶制剂，酶/底物＝10，反应时间3小时、温度50℃，pH＝6，可获得聚合度为3-20的琼胶低聚糖。
实施例9褐藻胶多糖水溶液，按实施例1的条件，可获得聚合度为3-20的褐藻低聚糖。
实施例10黄原胶多糖水溶液，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的黄原低聚糖。
实施例11田菁胶多糖水溶液，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的田菁低聚糖。
实施例12葡聚糖多糖水溶液，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的葡聚低聚糖。
实施例13木聚糖多糖水溶液，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的木聚低聚糖。
实施例14甘露聚糖多糖加水溶解，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的甘露低聚糖。
实施例15肝素多糖加水溶解，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的肝素低聚糖。
实施例16硫酸多糖加水溶解，按实施例1条件，可获得聚合度为3-20的硫酸低聚糖。
实施例17将羧甲基纤维素溶解，按实施例1条件，可获得具有活性的功能物质。
实施例18将人参提取物溶解，按实施例1条件，可获得具有活性的功能物质。
实施例19将黄芪水提物溶解，按实施例1条件，可获得具有活性的功能物质。
实施例20将甘草水提物溶解，按实施例1条件，可获得具有活性的功能物质。
权利要求
1.一种利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法，可以将天然产物转化形成高活性成分和将多糖制备寡聚糖，其特征在于，按酶量/底物＝0.2-25(重量百分比)加入蜗牛酶进行降解，降解的反应温度为15-80℃，时间1-10小时，溶液pH＝3.0-10.0。
2.如权利要求1所述的利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法，其特征在于，所述天然产物是纤维素、人参、黄芪、甘草。
3.如权利要求1所述的利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法，其特征在于，所述多糖是壳聚糖、果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素或硫酸多糖。
4.如权利要求1所述的利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法，其特征在于，所述寡聚糖是聚合度为3-20的低聚糖。
全文摘要
一种利用蜗牛酶降解天然产物及多糖的方法，将天然产物或多糖溶解成溶液，按酶量/底物＝0.2－25(重量百分比)加入蜗牛酶进行降解，降解的反应温度为15－80℃，时间1－10小时，溶液pH＝3.0－10.0。可将包括纤维素、人参、黄芪、甘草等天然产物以及壳聚糖、果胶、卡拉胶、琼胶、褐藻胶、黄原胶、田菁胶、葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、肝素、硫酸多糖等多糖原料降解成具有一定生物活性的小分子的功能物质和聚合度为3－20的寡聚糖。将降解后较高聚合度的寡糖从反应体系中分离出来，一方面可以得到较高聚合度的寡糖，另一方面蜗牛酶可以重复使用。
文档编号C12P19/00GK1417342SQ0113689
公开日2003年5月14日 申请日期2001年11月6日 优先权日2001年11月6日
发明者杜昱光, 白雪芳, 曲天明, 李曙光, 赵小明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所