专利名称：肺癌转基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肺癌转基因疫苗及其制备方法。
背景技术：
肺癌是严重危害人民生命和健康的常见病，是最难治疗的恶性肿瘤之一。目前国内外肺癌的发病率和死亡率还在继续上升，肺癌在男性是所有恶性肿瘤发病中占首位，女性中居第二位。尽管人们花了很大精力，包括手术、放疗、药物化疗、免疫、中医中药等去探究防治肺癌的方法，效果仍不理想。国外至今5年生存率仅为13％，国内最近统计资料显示，上海市的肺癌总5年生存率仅5.5％。近年来，人们逐渐认识到，肺癌远期生存率不能提高的主要原因，不是人们不能使肺癌局部得到控制，而是不能有效地早期发现、预防和治疗肺癌的亚临床转移和全身的远处转移，说明肺癌是一种全身性疾病，而非局部疾病。许多在手术时甚至手术后诊断的早期肺癌，实际上已有亚临床的远处转移，这是造成外科治疗失败和患者死亡的主要原因。
近年来，随着分子生物学与分子免疫学研究的进展，肿瘤的基因治疗受到人们广泛的重视。利用基因重组技术将细胞因子基因修饰的肿瘤细胞作为疫苗治疗肿瘤已成为肿瘤生物治疗中的重要手段。γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)具有多方面的抗肿瘤效应，尤以激发或增强宿主抗肿瘤免疫应答最为重要。目前已有许多细胞因子基因被转入到各种肿瘤细胞，其中IFN-γ最受到重视，因为用鼠源γ-干扰素基因进行的动物实验已显示出有效的抗肿瘤效应。γ-干扰素是一种多功能细胞因子由活化的T淋巴细胞产生，能以不同的方式来影响免应答的结局，用IFN-γ基因来转染肿瘤细胞发现它能上调(up-regulate)主要组织相容性复合体(Major HistocompatibilityComplex，MHC)分子表达，并消除或降低该肿瘤细胞的致瘤性。
发明内容
本发明将克隆的人源IFN-γ全长CDNA，利用逆转录病毒载体PLXSN导入到人肺腺癌A549细胞株中，经G418抗性筛选得到能持续分泌γ-干扰素，能有效增加细胞内II型主要组织相容性复合物(MHC II)含量的转染人γ-干扰素基因的人肺腺癌细胞株(huγ-IFN-A549)，经过常规培养得到疫苗。
所述的人γ-干扰素基因是1)序列公知(略)2)人γ-干扰素引物上游 Hind III下游 Cla I3)逆转录病毒载体LNSX(见图1)所述的肺腺癌细胞株A549，系1972年由Giard D.J等取自一名58岁，男性，白种人男性的肺癌组织，人工培养建系，该细胞贮存在(American TypeCulture Collection)经过多代培养及对其特性的研究表明该细胞有特异的胆碱激酶活性和胆碱磷酸胞苷转移酶。该细胞的致瘤性较低，即在裸鼠致瘤实验上需4×106细胞3-4周成癌。而S180需0.5×104，1-2周成瘤；且免瘤原性低，即不易被机体识别，进行免疫应答反应。
所述的常规培养步骤是1)对数生长期细胞；2)倾去培养液；3)洗细胞；4)酶液消化；5)吹打离心；6)计数；7)收集细胞；8)水浴；9)辐照后得到产品。为了增加免疫原性，还可以在7)8)步骤之间加入S180细胞裂解物，如抗原和免疫佐剂GM-CSF。
本发明的肺癌转基因疫苗，不同于甲肝疫苗，狂犬疫苗和麻疹疫苗等普通疫苗，普通疫苗的作用是预防健康人群发生疾病，而肺癌基因疫苗则用于配合手术消除肺癌或预防复发，能激发增强机体对肺癌的主动免疫排斥反应，这在本质上属于一种主动免疫性治疗措施。这也就是肺癌基因疫苗免疫抗肺癌研究的构思和理论根据。本发明的疫苗能持续分泌γ-干扰素，能有效增加机体细胞内II型主要组织相溶性复合物(MHC II)的含量，提高患者免疫反应能力，有预防肿瘤的复发和转移作用。
图1是逆转录病毒载体程序框图；图2是本发明IFN-γ基因修饰对A-549细胞生长的影响曲线图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1。本例首先将克隆的人源IFN-γ全长CDNA，利用逆转灵病毒载体PLXSN导入到人肺腺癌A548细胞株中，经G418抗性筛选得到了能分泌γ-干扰素的转化细胞株，其表述为A-549-IFN-γ。
其次，对细胞株经过如下步骤的常规培养得到疫苗1)对数生长期细胞；2)倾去培养液；3)清洗1640无血清培养液洗细胞1次；4)酶液消化；5)1640无血清培养液吹打洗细胞，离心3500rpm×5min×2次；6)计数；7)收集细胞；8)加入S180抗原和免疫佐剂GM-CSF；9)水浴37度水浴30分钟；10)辐照Co60照射100rad×50min得注射用肿瘤疫苗。其细胞外分泌量为10pg/ml，总表达量为45pg/ml。
五、IFN-γ基因修饰对A-549细胞生长的影响从图1的生长曲线中可以看出，A-549细胞株和A-549-IFN-γ细胞株在本实验室的细胞培养条件下生长无明显差别，说明IFN-γ基因导入没有改变细胞的生长能力和特性。
六、A-549-IFN-γ转达基因表达的测定用ELISA试剂盒分别测定A-549细胞株和A-549-IFN-γ总的表达量和细胞外的分泌量(见表1.)。结果表明未转基因的对照组A-549细胞IFN-γ表达为阴性，转基因A-549-IFN-γ细胞株培养液和细胞冻溶液都有较高的IFN-γ浓度被测出。提示转入A-549细胞的IFN-γ基因能进行正常的表达。
表1.A-549细胞株和A-549-IFN-γ细胞株IFN-γ含量的测定
七、IFN-γ基因转导对A549细胞MHCII抗原表达的影响对A-549-IFN-γ细胞株及A-549细胞株HLA-DR表达的测定(见表2)表明，h-IFN-γ基因可增强A-549肺癌肿瘤细胞株MHCII的表达，为该细胞株作为瘤苗提供了有利条件，因MHCII分子对完成体内T-细胞的双信号传递起重要作用。
表2 IFN-γ基因转导对A-549HLA-DR表达的影响
八、肺癌转基因疫苗的动物实验1、材料与方法1.1 实验中所用之转基因疫苗由本室供应，均按国家生物制剂要求进行操作，并选用能分泌γ-干扰素的细胞，经CO60照射(100rad×50′)，疫苗剂量1×106γ-干扰素A549细胞/0.2ml/支。
1.2 肿瘤S180引自中国科学院上海药物研究所。
1.3 实验动物购自浙江大学医学院动物中心(合格证医动字22-9601018)。NIH纯种小鼠，雄性，健康，体重为18～20g。随机分组，每组6只，8组共48只。
1.4 肿瘤细胞裂介物及免疫佐剂，裂介物由收集的S180肿块按体积1∶5加生理盐水冻融3次离心后所得上清，测蛋白含量后置-20℃冰箱备用GM-CSF购自厦门特宝生物公司(批号9808)IL-2购自上海华新生物技术公司(批号991106)。
本实验设计的特点是在肿瘤接种前先给动物预先注射3次转基因疫苗(第1天，第6天，第14天)于第15天接种肿瘤后再治疗注射2次(第21天和第28天，到第37天处理全部动物，记录体重、瘤重、脾重，并检查心、肝、肺、肾病变情况。
1.5 动物给药设计方案，见下表。 1.6 注射转基因疫苗分组如下NO.1 A549细胞(i.p0.2ml/只/次)NO.2 A549-IFN-γ细胞(i.p0.2ml/只/次)NO.3 A549-IFN-γ细胞+S180裂介物(i.p0.2ml/只/次)NO.4 A549-IFN-γ细胞+S180裂介物+GM-CSF(i.p0.2ml/只/次)NO.5 A549-IFN-γ细胞+S180裂介物+IL-2(i.p0.2ml/只/次)NO.6 A549-IFN-γ细胞+S180裂介物+IL-2(i.p0.2ml/只/次)NO.7 注射IL-2，再注射A549-IFN-γ细胞-+S180裂介物(i.p0.2ml/只/次)NO.8 生理盐水(N.S)(i.p0.2ml/只/次)*i.p 为腹腔注射；i.s为皮下注射*0.2ml A459或A549-IFN-γ细胞＝1×106细胞数1.7 每只小鼠右前肢皮下接种0.5×104S180肿瘤细胞/0.2ml生理盐水液。
2、结果2.1 我们比较了A549细胞与转γ-干扰素A549细胞两疫苗对小鼠S180肿瘤的抑制作用结果见表1。
表1 A549疫苗与转γ-干扰素基因A549疫苗对小鼠S180的抑制作用
正常A549细胞疫苗组5/6动物长肿瘤，而转基因A549细胞疫苗组只有1/6动物长肿瘤，共对S180肿瘤的抑制率分别为16.7％与83.3％，后者约为前者的4.9倍，两者有显著差异(P＜0.05)而正常A540细胞疫苗组与NO.3生理盐水对照组一样都为5/6出现肿瘤，我们注意到在第37天处理时N.S组的肿瘤都比NO.1组为大，而且出现得早从体重来看3组中以N.S为最重，但其脾重却为最轻，以转基因的NO.2组脾重为最重约是N.S组的2.1倍，表明转基因疫苗组脾重比对照明显增大，提示产生了全身的强烈的免疫应答，这可能是抑制S180肿瘤的一种表征。
2.2 为了观察特异性肿瘤细胞裂介物和免疫佐剂对转基因疫苗抑瘤作用的影响，我们设计了以下实验，结果见表2。
表2 添加S180肿瘤细胞裂解物和免疫佐剂对小鼠S180的抑制作用
在NO.1的转基因基础上加上S180肿瘤细胞的裂介物(内含特异性肿瘤抗原)，结果获得100％的肿瘤抑制率，提示添加特异性肿瘤裂介物将有利于转基因疫苗发挥其特异性抑瘤效能。在NO.2的基础上添加了免疫佐剂以期获得最佳疗效，结果NO.3(加用GM-CSF)肿瘤发生数为0/6；其抑瘤率为100％，我们观察到i，四组的平均体重在处理时基本一致(31.6；29.8；30.8；31.29g)。ii，NO.3添加GM-CSF动物的平均脾重是NO.1转基因组平均重是的1.1倍。iii，NO.3在第3星期(第21天)动物接种处有微小肿瘤出现，但随后却逐渐消失，为其他组所未见。是否是GM-CSF与转基因疫苗和S180肿瘤裂介物共同作用的结果。而NO.4(加用IL-2)肿瘤发生数1/6，抑瘤率为83.3％，与NO.1的情况相同其解释是否是添加的IL-2抵消了肿瘤细胞特异性裂介物的作用。本组实验提示在转基因疫苗中添加针对性的肿瘤细胞裂介物和加用免疫佐剂GM-CSF可发挥最佳的抑瘤效果。
2.3 为了考察疫苗注射部位对小鼠S180的抑瘤影响，我们又作了以下1″的观察，结果见表3。
表3 转基因疫苗注射部位对小鼠S180的抑瘤作用
结果不同的注射部位给予转基因疫苗却获得同样的100％抑制率。提示转基因疫苗能激发机体系统的免疫应答，而非局部效应。注射部位不同未造成改变结果的影响。
2.4 为今后转基因疫苗在临床应用的实际情况而设计以下实验预想在肿瘤病人术后或放、化疗后在恢复期时，应用疫苗前先注射IL-2，以调整患者的免疫状态再给予转基因疫苗，亦可能获得结果，观察结果见表4。表4
*所用转基因疫苗均加S180细胞裂介物两组获得同样的结果，提示为了改善机体的免疫状态在治疗前可用IL-2来替代转基因疫苗发挥同样的作用。也表明今后在临床病人术后或放、化疗后可先使用IL-2调整患者的免疫状态而再给予转基因疫苗，这不仅保证了转基因疫苗疗效的发挥而且大大节约了病人的费用。
3、讨论与小结3.1 肿瘤之所以出现从免疫学角度是因为机体把肿瘤细胞误认为是自身的产物而未加以消灭，研究指出自发性的肿瘤其免疫原性和抗原性都较低或消失。因此用这种取自机体的肿瘤细胞制成疫苗其抑制肿瘤或治疗肿瘤的能力就非常有限。那么如何能使肿瘤细胞提升其免疫原性及抗原性，已有报导指出把外源细胞因子等基因导入肿瘤细胞往往可以达到改变肿瘤细胞的遗传背景，并增加其免疫原性而降低它的致瘤性。我们的实验就证实了这一点，向人肺腺癌A549细胞导入γ-干扰素基因与未导的同源细胞疫苗比较其抑瘤率大为提高(83.3％＞16.7％)。其最重要的原因是导入的γ-干扰素基因上调了MHC-I，II分子的表达，可更有效地提呈抗原，使CTL细胞能识别原来不能识别的抗原，增强了免疫原性，有利于CD8+和CD4+淋巴细胞免疫抑瘤功能的发挥，同时在实验中也观察到转基因疫苗与单纯细胞疫苗两组动物的平均体重及脾重也都是转基因疫苗组比单纯疫苗组为重，这从一个侧面证明转γ-干扰素基因疫苗改善了机体的全身的免疫状态，从表1NO.1组仅有的那只肿瘤(1/6)出现的迟而且体积也比后者(5/6)为小，表明转基因疫苗有较明显的抑瘤优势。
3.2 添加肿瘤裂介物的目的，是为了提升其特异性抗肿瘤反应，因为根据报导肿瘤裂介物内含有特异性肿瘤抗原以及其刺激分子和细胞粘附分子等成份，可以增强转基因疫苗的抗肿瘤免疫反应。我们的实验也证实在γ-干扰素基因疫苗中添加肿瘤细胞裂介物后其抑瘤率得到了提高从83.3％上升到100％。证明添加肿瘤裂介物也是提高转基因疫苗抑瘤效果的有力手段之一。在添加免疫佐剂GM-CSF和IL-2的实验观察中发现有趣的现象，其一是该组动物的脾的体积为最大和最重提示发生了强烈免疫反应，可能与GM-CSF促进树突样细胞提呈抗原和启动T细胞活性有关。其二是在接种肿瘤3星期时有肿瘤结节出现，但到第4星期时却消失而到处理时未再出现肿块。可见选用GM-GSF作为转基因疫苗的佐剂在今后的临床应用时可考虑为优先选用的免疫佐剂。而在IL-2组中未见上述情况，但仍维持转基因疫苗原来的抑瘤率83.3％，其原因有待进一步分析。
3.3 实验中选用腹腔和皮下给予转基因疫苗以考察给药途径在诱发机体抑瘤反应方面有何差异，结果未见存在区别都获100％的抑瘤率，提示γ-干扰素基因疫苗不受注射途径的影响都能激发机体系统全面的免疫抑瘤应答，而非局部效应。
3.4 表4结果表明在患者术后或放、化疗后在应用转基因疫苗前，预先给予IL-2以改善和调整病人的免疫状态，再用转基因疫苗进行治疗在防止肿瘤的复发和转移上可能是一个有益的尝试。
3.5 综上结果所述，本实验证实1、人肺腺癌A549细胞，经γ-干扰素基因传染修饰后经钴60照射制成疫苗对小鼠S180肿瘤有一定的抑制作用，而未经基因修饰的同源细胞疫苗似无此作用；2、添加特异性肿瘤细胞裂介物和免疫佐剂GM-CSF能协同γ-干扰素基因疫苗发挥更佳作用，而免疫佐剂IL-2增效不明显；3、不同给药途径似未对γ-干扰素基因发挥免疫抑瘤应答造成差异，提示给予途径对本实验影响不大；4、采用先给予IL-2以改善和调整机体的免疫状态后，再加用γ-干扰素基因疫苗同样可奏最佳效果。这一模式可供临床应用中参考。
九、肺癌转基因疫苗的临床试验试验表明1、转基因疫苗1×106、2×106、3×106、5×106、1×107五个剂量病例观察未见肝肾功能，血常规等生理、生化指标的变化。
2、本疫苗在1×107以下，皮下给药未发现中、重度不良反应。
3、本次试验观察从转基因疫苗1×106-1×107剂量组，总的13例病人中有3例原发或转移肿瘤明显缩小。另2例全身骨骼转移疼痛缓解；对不可测量病灶病人细胞免疫监测，CD3、CD4、NK、MHC I及活化CD4均有不同程度提高；77％的患者生活质量得到改善。
权利要求
1.一种肺癌转基因疫苗，其特征在于能持续分泌γ-干扰素，能有效增加细胞内II型主要组织相容性复合物(MHC II)含量的转染人γ-干扰素基因的人肺腺癌细胞株(huγ-IFN-A549)。
2.一种肺癌转基因疫苗的制备方法，其特征在于1)将克隆的人源IFN-γ全长CDNA，利用逆转录病毒载体PLXSN导入到人肺腺癌A549细胞株中，经G418抗性筛选得到权利要求1所述的细胞株(huγ-IFN-A549)；2)对上述细胞株进行常规培养得到疫苗。
3.根据权利要求2所述的肺癌转基因疫苗的制备方法，其特征在于所述的常规步骤中加入S180细胞裂解物。
全文摘要
本发明涉及一种肺癌转基因疫苗及其制备方法。其特征在于1)将克隆的人源IFN－γ全长CDNA，利用逆转录病毒载体PLXSN导入到人肺腺癌A
文档编号C12N5/10GK1429624SQ0114532
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者胡伟恩 申请人:杭州市第一人民医院