专利名称：组织型纤溶酶原激活物突变体的生产方法
技术领域：
本发明涉及了基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种生产组织型纤溶酶原激活物突变体(简称r-PA，其氨基酸序列包含了天然t-PA的第1-3和176-527位氨基酸)的方法，以及工程细胞的构建、r-PA的表达和纯化方法。
背景技术：
在生理条件下，机体某些部位有时会出现血管内皮受损，这些部位可能在血小板聚集成团的基础上发生凝血过程，形成小血栓。由于体内同时存在着与凝血系统相对立的抗凝系统和纤溶系统，因此止血栓完成了止血任务后，大部分被溶解吸收，使机体保持着血液的液体状态和正常的血液循环。
在抗凝功能中发挥重要作用的是血液中的抗凝因子，主要有三个体系凝血酶III、蛋白C系统和组织因子途径抑制物(TFPI)。在纤溶系统中起重要作用的是血液中的纤溶酶元激活物、活化的XIIa和激肽释放酶，这些激活剂及激活剂样物质能使纤溶酶元活化成为纤溶酶，使纤维蛋白水解，因此如果纤溶系统受到抑制，势必加重血栓栓塞。相反，倘若纤溶系统活性亢进，势必引起损伤处重新出血倾向。
血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康，导致死亡率最高的原因之一，如心肌梗塞，脑血管血栓形成，深静脉血栓形成，脑栓塞，肺栓塞等。此外，血栓形成是许多疾病发病机制中涉及的一种重要病理过程，如肾小球肾炎、糖尿病小血管病变、严重烧伤中局部病变的恶化、妊娠高血压综合征、视网膜静脉血栓形成、各种原因所引起的弥散性血管内凝血等。因此，预防血栓形成(防栓)，治疗血栓形成(治栓)，将已形成的血栓溶解(溶栓)，已成为当前临床上重要的防治血栓的方法。
溶栓药是一组通过对纤溶酶元转变为纤溶酶，使纤溶激活，将已形成的血栓溶解的药物。传统的溶栓药有链激酶(SK)、酰基纤溶酶元SK活化剂复合物(APSAC)、组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(t-PA)、尿激酶(UK)、单链尿激酶纤维蛋白溶解酶原激活剂(scu-PA)。SK是C链β溶血性链激酶在培养过程中产生的一种蛋白质，用基因重组技术生产称r-SK，临床应用最早、最广，价格便宜，缺点是有抗原性，可产生抗体并引起寒战、发热、皮疹、低血压等反应；APSAC溶栓作用优于SK，但仍具有抗原性；t-PA是天然存在于血循环种的纤溶酶原激活物之一，现已用基因工程大量制备(r-tPA)，其优点是对纤维蛋白有高亲和力，故有选择性溶栓作用，不产生全身性纤溶状态，但t-PA的半衰期短(4分钟)，需连续滴注，用药剂量大(100mg/剂量)，再加上哺乳细胞培养来源，因此价格昂贵(2200$/剂量)，不适广泛推广；临床上使用的u-PA是尿激酶(UK)或双链尿激酶，从尿中提取，其虽有很强的溶栓作用，无抗原性，在我国应用广泛，但引起全身性纤溶系统的激活，易引起出血；单链尿激酶对纤维蛋白有特异的溶解作用，但它并不与纤维蛋白结合，它溶解纤维蛋白的作用大大地强于对纤维蛋白原的溶解，故它具有选择性溶栓作用，而全身性纤溶系统的激活作用较小，但大剂量使用，仍可引起全身性出血。
目前溶栓治疗最大遗憾是血管开通率仅为60％-85％，而且更重要的是不能保持梗死相关血管持续开通。t-PA的局限性在于血管再通后的几小时内可能会发生再闭塞。这对t-PA这类半衰期非常短的溶栓药来说是一个特殊问题。再闭塞是时间依赖的，除急性再闭塞外，3个月后约有30％的开通血管又会发生再闭塞，这个问题非常严重，因为血管闭塞的患者3年后随访的死亡率明显高于没有再闭塞的患者(92％vs68％)。
近年来，人们针对上述药物的缺点，应用基因工程生物技术对t-PA等药物进行改造。目前正在研究和进行临床试验的新型溶栓药物包括t-PA的变异体(或称突变体)，通过改变t-PA上纤溶酶元激活剂抑制剂1(PAI-1)的结合位点，或通过改变溶栓剂的分子结构，如缺失突变t-PA的F区、EGF区、K1区、K2区，或通过点突变改变t-PA的糖化位点，延长药物的半衰期。目前t-PA变异体在临床试验中已显示出其良好的应用前景。
r-PA是t-PA的一种缺失突变体，从氨基酸序列来讲，它缺失了指形区(F区)、表皮生长因子区(EGF区)和K1区，只保留了t-PA起始的几位氨基酸及K2区和轻链，即只包含了天然t-PA的第1-3和176-527位氨基酸，共355个氨基酸，含9对二硫键。
Reteplase是r-PA在原核系统中的表达产物，大肠杆菌表达的r-PA为不溶性的包含体，无活性，无糖基侧链，通过体外重新折叠后，成为分子量39，571、有活性的单链多肽。
与t-PA一样，Reteplase通过水解纤溶酶原肽链上第560位(精氨酸)和第561位(缬氨酸)之间的肽链，使无活性的纤溶酶原转化为纤溶酶，而纤溶酶使不溶性的、成网状结构的纤维蛋白单体转变为可溶性的纤维蛋白降解产物，从而使血栓溶解。除溶解纤维蛋白外，纤溶酶还可使纤维蛋白原及凝血因子V和VIII降解。第一代溶栓药物如尿激酶、链激酶是非纤维蛋白特异性的，其激活纤溶酶作用不受纤维蛋白存在与否影响，因此引起出血等不良反应较多。同t-PA一样，Reteplase是纤维蛋白特异性的，即纤维蛋白存在时，Reteplase与t-PA和纤溶酶原的亲和力增加600倍左右，当无纤维蛋白存在时，由于纤溶酶元很少被激活，故其引起出血的不良反应较低。
Reteplase的生物特性为(1).保留了t-PA的强溶栓作用，其溶栓作用强于rt-PA5.3倍。
(2).去除了t-PA中的3个区，而由于这些区域的存在，t-PA很易和肝脏上的受体结合，使其血浆清除加快，故t-PA除首剂推注外，其余部份需持续静脉滴注；Reteplase去除了这些部份后半衰期延长，达11～19分钟，可通过静脉推注直接给药，使用更方便。
(3).t-PA与纤维蛋白结合较紧密，在某血栓处发挥作用后很难在其他血栓部位再发挥作用，而Reteplase与纤维蛋白结合不及t-PA，使药物更易自由地扩散到其它部位再发挥作用，从而提高了Reteplase的溶栓作用。
综合以上各点，Reteplase使推注给药得以实现，而不需象t-PA一样维持滴注。
第一个基因重组溶栓药重组组织型纤溶酶原激活剂(r-tPA)早在1987年已由美国Genetech公司开发上市；1996年FDA批准德国Boehringer Mannheim公司的Reteplase(BM06.022)于1996年上市，商品名为Retavase，用于治疗急性心肌梗塞，在临床上具有药物半衰期长、溶栓作用强、副作用小等特点，受到心血管专家的高度重视。这一纤维蛋白特异型溶血栓药物较目前所使用的药物给药方便，无需进行剂量计算，且该药可静脉静注给药，优于静脉推注。
Boehringer Mannheim公司的Retavase的的装量是10.4U(18.1mg)/瓶，临床上的使用方法是推注10U(1千万单位)，间隔30分钟后，再第二次推注10U(1千万单位)。根据INJECT和RAPID-1、RAPID-2的临床试验，其疗效可与SK和rt-PA媲美。
就r-PA生产工艺而言，与国外一样，国内亦以大肠杆菌表达r-PA，需要变性、复性工艺，而Reteplase含9对二硫键，复性工艺复杂，需要用到大量的变性剂、氧化-还原剂，复性时间长，且复性得率低(50L的发酵罐只能产出约80个剂量的Reteplase)。同样工艺生产的Reteplase在国外售价与rt-PA相似(2000$/剂量)，我国的Reteplase售价亦不可能低，不适合我国国情，与目前广泛使用的重组链激酶(2500/剂量)等溶栓药比也没有竞争力。
因此，本领域迫切需要开发新的工艺简便、成本低的生产r-PA的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种工艺简便、成本低的生产r-PA的方法。
本发明的另一目的是提供相应的r-PA编码序列、携带该编码序列的载体以及工程细胞。
在本发明的第一方面，提供了一种生产组织型纤溶酶原激活物突变体的方法，该组织型纤溶酶原激活物突变体r-PA具有SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列，该方法包括步骤(a)在适合的表达条件下，培养毕赤酵母工程细胞，该毕赤酵母工程细胞是在毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合了外源的r-PA编码序列，从而表达出组织型纤溶酶原激活物突变体r-PA；(b)分离纯化出步骤(a)中表达的r-PA。
在一优选例中，所述的r-PA编码序列具有SEQ ID NO1或3中第7-1071位核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有1-30个外源的r-PA编码序列，较佳地整合有2-30个外源的r-PA编码序列，更佳地整合有3-30个外源的r-PA编码序列。
在另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在另一优选例中，步骤(a)中适合表达的条件包括r-PA的发酵及诱导温度保持在25-31℃，较佳地26-30℃；诱导期的pH值为4-8，较佳地pH5-7；诱导期甲醇浓度控制在0.5-2％，较佳地0.5-1％。
在另一优选例中，步骤(a)中适合表达的条件包括起始培养阶段PTM1的量为1-4ml/L培液，较佳地1.5-3ml/L培液，在补料阶段加入量为2-20ml/L补料，较佳地3-20ml/L补料。
在另一优选例中，步骤(b)包括(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除菌体，获得发酵清液，(ii)通过盐析和/或超滤进行初步纯化后再进行层析纯化，或直接进行层析纯化，其中所述的层析纯化选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。
在本发明的第二方面，提供了一种质粒，它克隆有rPA的编码序列，并能够转化毕赤酵母宿主细胞，使rPA基因整合入宿主细胞基因组。
在本发明的第三方面，提供了一种毕赤酵母工程细胞，该毕赤酵母工程细胞的基因组中整合有外源的r-PA编码序列，从而表达出组织型纤溶酶原激活物突变体r-PA。
在一优选例中，在所述的毕赤酵母工程细胞中，所述的r-PA编码序列编码SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列，并且所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有1-30个外源的r-PA编码序列。
在另一优选例中，更佳地，所述的r-PA编码序列具有SEQ ID NO1或3中第7-1071位的核苷酸序列。
图1是本发明的一种表达质粒pPIC9K-rPA的构建示意图。图中，Ampicillin表示氨苄青霉素抗性基因，Kanamycin表示卡那霉素抗性基因。
具体实施例方式
本发明人通过深入而广泛的研究，在国内外首次采用甲醇利用型毕赤酵母(Pichia Pastoris)为宿主细胞，分泌表达r-PA。在此基础上完成了本发明。
Reteplase结构特点，及天然t-PA的第1-3和176-527氨基酸序列是在文献中已公开。可以根据文献，全基因合成或在天然t-PA基因基础上进行点突变与缺失突变，得到r-PA的cDNA。然后，用分子克隆的常规方法，在cDNA 5′端与3′端分别引进特异性酶切位点，克隆入待整合质粒(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，转化、整合入P.Pastoris宿主细胞染色体，在不同浓度(如1-8mg/L)G418筛选鉴定出工程细胞。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut+)或慢速利用甲醇型(Muts)。
整合入酵母染色体(或基因组)中的r-PA编码序列的拷贝数没有特别限制，可以为1-100个或更高，通常为5-30个。
在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于P.Pichia酵母生长、表达的培养基都可用于本发明。例如，合适的培养基包括(但并不限于)以下培养基
一种优选的摇瓶培养条件是挑取YPD平板上的单克隆，以BMGY为摇瓶培养液，培养至OD6002-4，以MM培养液诱导表达，诱导24小时后，培液上清的生物活性可达600-1500IU/mL。
为了大规模生产r-PA，需要对P.Pastoris工程细胞的中试表达与表达条件进行优化。中试发酵指的是发酵罐、摇瓶发酵。不同体积发酵液发酵能力呈线性放大。表达量达180-200mg/L发酵液。
经过本发明的反复实验，一种优选的表达与表达条件进行优化如下1.对于培养基的选择而言，发酵罐发酵时可选择低盐培养基，也可在低盐培养基基础上进行一定更改，但所含离子成份与低盐培养基相似。
2.就温度的控制而言，r-PA的发酵及诱导温度保持在25-31℃。
3.就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在4-8，较佳地为pH5-7。
4.就溶氧(DO)的控制而言DO控制在20-90％。溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决。
5.就补料的流加而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等糖原，可单独补料或混合补料。
6.就PTM1(混合微量元素)的量起始培养阶段PTM1的量为1-4ml/L培液，在补料阶段加入量为2-20ml/L补料。
7.就诱导期甲醇浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常甲醇浓度控制在0.5-2％。
8.就诱导时间而言，没有特别限制，通常为10-100小时，较佳地为30-60小时。
在表达了r-PA之后，其纯化过程就较为简便，因为表达的r-PA为胞外分泌型。通常，发酵样品先以离心、过滤等方式去除细胞，发酵清液含目的蛋白质r-PA。发酵清液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。
层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。
1.离子交换层析(阳离子交换层析、阴离子交换层析)样品的缓冲系统以稀释、超滤、沉淀后复溶、透稀或凝胶过滤层析等手段进行更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，且电导率小于4000uS/cm，直接上样，盐浓度梯度或pH梯度梯度洗脱。
2.疏水层析含较高盐浓度的样品可以直接进行疏水层析，降低盐浓度的梯度方法进行洗脱。
经过上述纯化可得到r-PA纯品，纯化得率通常为65％以上，纯度95％以上，纯品得率约100-120mg/L发酵液。
纯化后的r-PA可用常规方法制成各种剂型。
在本发明的一个实例中，构建了r-PA的P.Pastoris酵母表达工程细胞，甲醇诱导，表达的r-PA为胞外分泌型，不需复性，优于国内外采用的大肠杆菌表达系统。表达量达180-200mg/L发酵液。
因表达蛋白属于胞外分泌型，发酵上清可直接进行纯化。经过纯化，得到r-PA纯品，纯化得率65％以上，纯度95％以上，纯品得率约100-120mg/L发酵液，比活性5.0×105IU/mg。
在本发明另一实例中，纯化后原液加入适当辅料，制成r-PA的注射用粉针剂。稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
与国内外比较，本发明更适合产业化。与用原核系统表达r-PA相比，本发明采用的P.Pastoris表达系统，可以克服表达产物以包含体形式存在、变性后分子须经重新折叠才能获得纤溶活、复性工艺复杂、成本高等缺点。
综上所述，本发明采用酵母系统(P.Pastois酵母)表达r-PA，其优点在于该系统不仅具有高表达、高稳定、高分泌的特点，而且其宿主P.Pastoris酵母具有高密度生长的特性，非常适于基因工程药物大规模高密度的发酵生产。P.Pastoris酵母蛋白产物糖基化简单，r-PA直接以可溶性、具活性形式分泌到胞外；产物可以直接进行纯化，工艺复杂程度大大降低，产率得到较大提高，使r-PA的产业化成为可能。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1r-PA Pichia酵母表达系统的构建1.目的基因的获得参见图1。根据文献报道的Reteplase结构特点，及天然t-PA的第1-3和176-527氨基酸序列，合成42段互补的引物，并在5′端引入Sna BI位点(TAC↓GTA)及pPIC9K 1198-1203碱基序列，3′端引入Not I位点(GC↓GGCCGC)，42条单链DNA按分子克隆的常规方法，首先用T4噬菌体多核苷酸激酶37℃处理30分钟。磷酸化的各寡核苷酸片段以等mol数混合，94℃变性5分钟，立即降至65℃退火10分钟，然后加入T4连接酶，16℃反应过夜。获得核苷酸序列如SEQ ID NO1所示的DNA片段。
2.表达质粒pPIC9K-rPA的构建与转化宿主细胞
pPIC9K质粒(Invitrogen公司)用Sna BI、Not I酶解后回收大片段，与合成的r-PA cDNA片段连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，小量制备质粒，用限制性内切酶Sna BI、Not I(TAKARA)鉴定筛选出含r-PA全长cDNA序列的阳性克隆。用pPIC9K质粒的5′AOX1引物及3′AOX1引物进行正、逆向序列分析，证实克隆序列与设计序列(SEQ ID NO1)完全一致。
把构建好的重组质粒pPIC9K-rPA线性化，并用低熔点琼脂糖胶回收后，转入宿主细胞，不同浓度G418(如2，4，6，8mg/L)的MD平板上筛选。最后得到一株高效表达株(据其抗G418浓度，可判断其基因拷贝整合数大于等于20个)，诱导24小时后表达产物溶栓活性为1000-1200IU/mL。根据其消耗甲醇的速度，判断此工程细胞株为Mut+。
实施例2.中试发酵条件选择NBS BioFlo 3000发酵罐(5L)1.种子液BMGY培养基2.发酵培养基低盐发酵培养基3.发酵培养阶段温度30℃PH5.0DO30％甲醇诱导前湿细胞重88g/L4.发酵诱导阶段温度30℃PH6.5DO20％甲醇补料中PTM1量10ml/L甲醇诱导结束湿细胞重327g/L在培养阶段后期，甘油被耗尽后流加甲醇进行诱导，整个诱导过程甲醇浓度控制在0.5-1％，诱导时间30-60小时。
诱导58小时后，r-PA表达量占发酵上清液总蛋白27％，表达量达180ug/ml(用改良Lowry法测)。
实施例3.r-PA纯化按以下步骤纯化r-PA(A)发酵液4℃下5000rpm离心10分钟，得上清。
(B)超滤浓缩及更换缓冲液使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为20KD，超滤时留取浓缩液。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入以PB(PH7.4 20mM)，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和PB(PH7.420mM)缓冲液的电导水平接近。整个超滤过程滤出液的活性为零。此超滤步骤r-PA的活性回收率95％以上。
(C)层析1层析介质Q Sepharose FF缓冲液溶液APB(pH7.4，20mM)溶液BPB(pH7.4，20mM)+2M NaCl上样将超滤浓缩的r-PA溶液(1L左右，电导为2000cm/s左右)上样。
清洗上样后用6CV(柱体积，下同)的溶液A清洗层析柱。
梯度清洗后用10CV将溶液B从0％-100％。
收集当溶液B在20％-30％时出现样品。
(D)层析2层析介质Superdex 30缓冲液PB(PH7.4，20mM)上样层析1收集的样品主分。
结果样品经过此三步纯化，即超滤、阴离子交换层析、凝胶过滤层析以后，纯度提高至95％以上，纤维蛋白溶解比活性达5.0×105IU/mg。得率汇总结果如下表所示
实施例4.PTM1量对表达水平的影响在实施例2的基础上，比较以下二种方法方法一基础培养基中PTM1量2ml/L诱导阶段补料中PTM1量2ml/L补料方法二基础培养基中PTM1量2ml/L诱导阶段补料中PTM1量10ml/L补料结果如下表所示，表明在诱导阶段补料时，PTM1的量以较高为好(2-20ml/L补料或更高，更佳地3-20ml/L补料)。
表 PTM1量对表达水平的影响
实施例5r-PA注射用粉针剂的制备对实施例3中获得的纯化后原液加入适当辅料，如1-10％甘露醇(或蔗糖、乳糖等)稳定剂，同时还可添加表面活性剂、抗氧化剂等保护剂，及适当缓冲液，分装，冷冻抽干，制成r-PA的注射用粉针剂。经稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
实施例6r-PA的346位Leu→Pro的突变蛋白的制备按实施例1相同方式，合成了r-PA的346位Leu→Pro的突变蛋白[rPA(Leu346→Pro346)]的编码序列(SEQ ID NO3)，克隆入质粒pPIC9K，获得质粒pPIC9K-rPA(Leu346→Pro346)。然后，转入毕赤酵母，获得工程细胞。按实施例2和3相同方式进行发酵，表达和纯化，获得r-PA的346位Leu→Pro的突变体rPA(Leu346→Pro346)。rPA(Leu346→Pro346)的氨基酸序列示于SEQ ID NO4。
经测定，r-PA的346位Leu→Pro的突变体的表达量和活性与r-PA几乎相同。346位发生Leu→Pro改变后，获得的突变蛋白与原来的r-PA基本相同是出乎意料的，因为Leu和Pro并不是相似氨基酸。
然后按实施例5相同方式，制成rPA(Leu346→Pro346)的注射用粉针剂。经稳定性试验表明，该粉针剂稳定。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海新生源医药研究有限责任公司<120>组织型纤溶酶原激活物突变体的生产方法<130>017384<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1076<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(7)..(1071)<220><221>misc feature<223>r-PA的cDNA序列<400>1gtaggc tct tac caa gga aac agt gac tgc tac ttt ggg aat ggg tca48Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser1 5 10gcc tac cgt ggc acg cac agc ctc acc gag tcg ggt gcc tcc tgc ctc 96Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu15 20 25 30ccg tgg aat tcc atg atc ctg ata ggc aag gtt tac aca gca cag aac 144Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn35 40 45ccc agt gcc cag gca ctg ggc cta ggc aaa cat aat tac tgc cgg aat 192Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn50 55 60cct gat ggg gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg ctg aag aac cgc agg 240Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg65 70 75ctg acg tgg gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc tcc acc tgc ggc ctg 288Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu
80 85 90aga cag tac agc cag cct cag ttt cgc atc aaa gga ggg ctc ttc gcc 336Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala95 100 105 110gac atc gcc tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc ttt gcc aag cac agg 384Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg115120 125agg tcg ccc gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc ata ctc atc agc tcc 432Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser130135 140tgc tgg att ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccg ccc 480Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro145150 155cac cac ctg acg gtg atc ttg ggc aga aca tac cgg gtg gtc cct ggc 528His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly160165 170gag gag gag cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac att gtc cat aag gaa 576Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu175 180185 190ttc gat gat gac act tac gac aat gac att gcg ctg ctg cag ctg aaa 624Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys195200 205tcg gat tcg tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc gtg gtc cgc act gtg 672Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val210215 220tgc ctt ccc ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gag 720Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu225230 235ctc tcc ggc tac ggc aag cat gag gcc ttg tct cct ttc tat tcg gag 768Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu240 245250cgg ctg aag gag gct cat gtc aga ctg tac cca tcc agc cgc tgc aca 816Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr255 260265 270tca caa cat tta ctt aac aga aca gtc acc gac aac atg ctg tgt gct 864Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala275280 285gga gac act cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac ttg cac gac gcc tgc 912Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys290295 300cag ggc gat tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg aac gat ggc cgc atg 960Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met305310 315act ttg gtg ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc tgt gga cag aag gat 1008Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp320325 330gtc ccg ggt gtg tac acc aag gtt acc aac tac cta gac tgg att cgt 1056Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg335340 345350gac aac atg cga ccg tgagc 1076Asp Asn Met Arg Pro355<210>2<211>355<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>r-PA的氨基酸序列<400>2Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr1 5 10 15Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp20 25 30Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser35 40 45Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp50 55 60Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr65 70 75 80Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln
85 90 95Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile100105 110Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser115120 125Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp130135 140Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His145150 155 160Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu165170 175Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp180185 190Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp195200 205Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu210215 220Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser225230 235 240Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu245250 255Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln260265 270His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp275280 285Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly290295 300Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu305310 315 320Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro325330 335Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn340345 350Met Arg Pro355<210>3<211>1076<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(7)..(1071)<220><221>misc_feature<223>346位由Leu变为Pro的r-PA突变蛋白编码序列<400>3gtaggc tct tac caa gga aac agt gac tgc tac ttt ggg aat ggg tca48Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser1 5 10gcc tac cgt ggc acg cac agc ctc acc gag tcg ggt gcc tcc tgc ctc 96Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu15 20 25 30ccg tgg aat tcc atg atc ctg ata ggc aag gtt tac aca gca cag aac 144Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn35 40 45ccc agt gcc cag gca ctg ggc cta ggc aaa cat aat tac tgc cgg aat 192Pro Ser Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn50 55 60cct gat ggg gat gcc aag ccc tgg tgc cac gtg ctg aag aac cgc agg 240Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg65 70 75ctg acg tgg gag tac tgt gat gtg ccc tcc tgc tcc acc tgc ggc ctg 288Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu80 85 90aga cag tac agc cag cct cag ttt cgc atc aaa gga ggg ctc ttc gcc 336Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala95 100 105 110gac atc gcc tcc cac ccc tgg cag gct gcc atc ttt gcc aag cac agg 384Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg115120 125agg tcg ccc gga gag cgg ttc ctg tgc ggg ggc ata ctc atc agc tcc 432Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser130135 140tgc tgg att ctc tct gcc gcc cac tgc ttc cag gag agg ttt ccg ccc 480Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro145150 155cac cac ctg acg gtg atc ttg ggc aga aca tac cgg gtg gtc cct ggc 528His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly160165 170gag gag gag cag aaa ttt gaa gtc gaa aaa tac att gtc cat aag gaa 576Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu175180 185 190ttc gat gat gac act tac gac aat gac att gcg ctg ctg cag ctg aaa 624Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys195200 205tcg gat tcg tcc cgc tgt gcc cag gag agc agc gtg gtc cgc act gtg 672Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val210215 220tgc ctt ccc ccg gcg gac ctg cag ctg ccg gac tgg acg gag tgt gag 720Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu225230 235ctc tcc ggc tac ggc aag cat gag gcc ttg tct cct ttc tat tcg gag 768Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu240245 250cgg ctg aag gag gct cat gtc aga ctg tac cca tcc agc cgc tgc aca 816Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr255260 265 270tca caa cat tta ctt aac aga aca gtc acc gac aac atg ctg tgt gct 864Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala275280 285gga gac act cgg agc ggc ggg ccc cag gca aac ttg cac gac gcc tgc 912Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys290295 300cag ggc gat tcg gga ggc ccc ctg gtg tgt ctg aac gat ggc cgc atg 960Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met
305310 315act ttg gtg ggc atc atc agc tgg ggc ctg ggc tgt gga cag aag gat1008Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp320325 330gtc ccg ggt gtg tac acc aag gtt acc aac tac cca gac tgg att cgt1056Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Pro Asp Trp Ile Arg335340 345 350gac aac atg cga ccg tgagc 1076Asp Asn Met Arg Pro355<210>4<211>355<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>346位由Leu变为Pro的r-PA突变蛋白<400>4Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr1 5 10 15Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp20 25 30Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser35 40 45Ala Gln Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp50 55 60Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr65 70 75 80Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln85 90 95Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile100105 110Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser115120 125Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp130135 140Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His145150 155 160Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu165170 175Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp180185 190Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp195 200 205Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu210215 220Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser225230 235 240Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu245250 255Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln260265 270His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp275280 285Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly290295 300Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu305310 315 320Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro325330 335Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Pro Asp Trp Ile Arg Asp Asn340345 350Met Arg Pro35权利要求
1.一种生产组织型纤溶酶原激活物突变体的方法，该组织型纤溶酶原激活物突变体r-PA具有SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列，其特征在于，该方法包括步骤(a)在适合的表达条件下，培养毕赤酵母工程细胞，该毕赤酵母工程细胞是在毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合了外源的r-PA编码序列，从而表达出组织型纤溶酶原激活物突变体r-PA；(b)分离纯化出步骤(a)中表达的r-PA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的r-PA编码序列具有SEQ ID NO1或3中第7-1071位核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有1-30个外源的r-PA编码序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母宿主细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中适合表达的条件包括r-PA的发酵及诱导温度保持在25-31℃，诱导期的pH值为4-8，诱导期甲醇浓度控制在0.5-2％。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中适合表达的条件包括起始培养阶段PTM1的量为1-4ml/L培液，在补料阶段加入量为2-20ml/L补料。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括(i)对发酵样品通过离心和/或过滤方式去除菌体，获得发酵清液，(ii)通过盐析和/或超滤进行初步纯化后再进行层析纯化，或直接进行层析纯化，其中所述的层析纯化选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。
8.一种质粒，其特征在于，它克隆有rPA的编码序列，并能够转化毕赤酵母宿主细胞，使rPA基因整合入宿主细胞基因组。
9.一种毕赤酵母工程细胞，其特征在于，该毕赤酵母工程细胞的基因组中整合有外源的r-PA编码序列，从而表达出组织型纤溶酶原激活物突变体r-PA。
10.如权利要求9所述的毕赤酵母工程细胞，其特征在于，所述的r-PA编码序列编码SEQ ID NO2或4所示的氨基酸序列，并且所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有1-30个外源的r-PA编码序列。
全文摘要
本发明提供了一种生产组织型纤溶酶原激活物突变体r－PA的方法，包括步骤(a)在适合表达的条件下，培养毕赤酵母工程细胞，该毕赤酵母工程细胞是在毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合了外源的r－PA编码序列，从而表达出组织型纤溶酶原激活物突变体r－PA；(b)分离纯化出步骤(a)中表达的r－PA。本发明还提供了工程细胞的构建、r－PA的表达和纯化方法。本发明可简便、低廉、大规模地生产r－PA。
文档编号C12N9/68GK1429909SQ01145280
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者黄阳滨, 杜碧金, 孙红, 蔡海瑜 申请人:上海新生源医药研究有限责任公司