专利名称：关于提高病毒滴度的材料与方法
技术领域：
本发明涉及与提高病毒滴度有关的材料与方法。特别是，但不是唯一地，本发明涉及从包装细胞上清液中纯化和浓缩逆转录病毒的新方法。本发明也涉及这些方法在导向特定组织、疾病治疗领域和筛查与诊断中的应用。
背景技术：
逆转录病毒介导的基因治疗需要可释放大量传染性逆转录病毒颗粒的逆转录病毒包装细胞，和/或提高逆转录病毒/靶细胞相互作用效率的方法(优选地同时采用这两种方法)。优化逆转录病毒载体有效滴度的努力集中于以下三种策略。
1)设计新的载体构建体，它们将用于逆转录病毒载体RNA的更有效的表达和包装1，2。通过离心6或人补体5，6，它们与能产生更多逆转录病毒颗粒的新一代包装细胞系偶联3-5，也可能具有更广的靶细胞趋向性(trophism)3，5，6，并且对灭活有更强的抗性。
2)改进最佳逆转录病毒载体颗粒生产的培养条件和逆转录病毒/靶细胞相互作用的效率。提高逆转录病毒产量的方法包括可相互传染的包装细胞的“乒乓”机制7、超感染8、靶细胞9或包装细胞在32℃时的培养10，有时加入组蛋白脱乙酰酶抑制剂丁酸钠11。分泌到上清液中后，通过与聚阳离子(如polybrene和鱼精蛋白硫酸酯)温育12，13，逆转录病毒颗粒与脂质体或脂质体脂类复合14，培养上清液的流通15和低速离心逆转录病毒颗粒与其靶细胞9，10，能提高逆转录病毒颗粒感染靶细胞的可能性。通过在排除磷酸盐的培养基中培养10，或加入纤连蛋白及其截短衍生物16，也能使靶细胞更易感染。
3)上述多种方法能与浓缩或纯化的逆转录病毒结合。曾经报道，使逆转录病毒上清液通过分子量截止滤器9，17，20，冻干，与磷酸钙共沉淀21，能减少上清液体积而保持逆转录病毒的传染性。然而，也能通过浓缩可抑制感染22或对靶细胞有毒性21的其它成分，实现这种减少。这种发展是由于离心作为完整传染性逆转录病毒的一种纯化方法的限制。“经典方法”的不同形式包括以18000g超离心可达16小时23，似乎效果极好。然而，能够纯化的上清液体积相对较少，传染性逆转录病毒的回收率较低，使用低滴度逆转录病毒时该方法效果最好23。文献中提到的其它变型使用速度降低的离心24-26(可低至3000g)，而保持时间长度，或者提高g值并减少时间19。然而离心有许多优点，它易于进行，在不与感染抑制剂共纯化的情况下能减少上清液体积。离心浓缩有许多潜在的优点，因此已经设计了用于生产假型逆转录病毒载体的包装细胞，主要考虑对离心应力灭活的抗性4，6。这种VSV-G(水泡性口炎病毒G)假型载体能50000g离心90分钟6，27，使体积减少可达2000倍，而传染性病毒的回收率高于70％6。
如果没有用于VSV-G假型之外的载体的最佳逆转录病毒浓缩方案，人们不能简单地通过使用较多的上清液来提高用于靶细胞的逆转录病毒颗粒的数量。这是由于37℃下5-7小时的逆转录病毒载体半衰期与在此期间它接触靶细胞的可能性之间的平衡。仅仅通过布朗运动移动的逆转录病毒颗粒在一个半衰期内不可能移动600μm以上28。因此，在1ml的静置培养物中，多达90％的逆转录病毒可能不能用于感染。由于靶细胞利用性有限，人们不能使用足够数量的细胞与所有可用的逆转录病毒有效地相互作用。
发明概述本发明者认为，需要有提高病毒滴度，从而增加可用于感染的病毒数量的方法。因此，在上述逆转录病毒的实例中，为了充分利用不可能接触细胞的90％的逆转录病毒，发明者设计了使用能与逆转录病毒结合形成复合物的结合成员的方法。然后能从包装细胞上清液中有效收集该复合物。发明者意外地发现，短时低速离心能实现这种收集，使得在体积只减少200倍后，滴度至少提高1000-2000倍。
因此，本发明提供一种提高含病毒颗粒样品的病毒滴度的方法，该方法包括使样品接触能与病毒颗粒结合形成复合物的结合成员；浓缩该复合物，例如通过离心样品；必要时测定病毒滴度。
病毒滴度的提高不会引起样品中病毒数量的增加。实际上，不必知道样品中病毒的准确数量，对于本发明，病毒滴度的提高肯定是病毒感染靶细胞的数量和可能性的函数。因此，浓缩后病毒滴度的提高可根据靶细胞的传染性确定。
为方便起见，下文参照逆转录病毒说明了本发明及其各方面。然而，本领域技术人员应当明白，本发明适用于所有病毒，包括逆转录病毒假型包装细胞系，例如具有vsvg假型包膜的MoMulv载体。例如，发明者特别关注逆转录病毒科，它在复制病毒中包含ssRNA、阳性有义、非节段基因组、包膜和DNA步骤。逆转录病毒科的亚科包括肿瘤病毒亚科(即莫洛尼鼠白血病病毒)、慢病毒亚科(即HIV和其它慢病毒载体)和泡沫病毒亚科。
然而，本发明也适用于其它病毒科，如疱疹病毒科(dsDNA和包膜病毒)，例子包括单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒。
其它科包括腺病毒科(ds和非包膜病毒)，例子包括腺病毒和腺病毒载体，如基于Ad.5的；乳头多瘤空泡病毒科(ds和非包膜病毒)，例如猿空泡病毒40和多瘤病毒；小RNA病毒科(ssRNA+有义，非包膜，非节段病毒)，例如肠道病毒、脊髓灰质炎病毒；弹状病毒科(ssRNA，-ve有义，非节段，包膜病毒)，例如水泡性口炎病毒；痘病毒科(dsDNA，非包膜病毒)，例如痘病毒(天花)和牛痘。本发明适用的其它科包括沙粒病毒科、双RNA病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、嗜肝DNA病毒科、虹色病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、细小病毒科、呼肠病毒科、披膜病毒科。此清单并非全部。如上所述，为方便起见，下文涉及逆转录病毒，包括慢病毒。
按照上述方法，希望将逆转录病毒与结合成员分离。然而，本发明者已经确定了大量结合成员，它们可用于上述方法，不需与逆转录病毒分离，逆转录病毒即可保持有效的传染性。以下作为本发明的一个方面描述。
例如，在本发明的第一方面，发明者设计了一种使用便宜、易于获得、颗粒性、稠密底物的方法。当包装细胞上清液中的逆转录病毒与过量底物混合时，形成逆转录病毒/底物复合物，其足够稠密，在病毒半衰期内在静置培养中因重力而沉淀。必要时这种复合物也能进行短时低速离心，以进行逆转录病毒浓缩。使用这种颗粒性稠密底物，发明者发现病毒意外地保持传染性，促进其释放不需要特殊处理，这种无毒底物能在培养物中长时间保留，足以引起最佳逆转录病毒/靶细胞的相互作用14，29。
因此，本发明提供一种提高样品中逆转录病毒滴度的方法，包括向样品中加入一种能与逆转录病毒形成复合物的稠密、颗粒性底物；离心样品以浓缩该复合物；根据靶细胞的传染性，确定逆转录病毒的浓度。
优选地，这种稠密、颗粒性底物是Pansorbin，一种加热杀死的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌，尽管也可使用其它底物，如Sansorbin。情况可能是，其它细菌具有与Pansorbin和Sansorbin相同的能力。这可能是基于细菌表面存在的纤连蛋白结合蛋白(fnb)，fnb型蛋白质可以在不同细菌中表达。因此，根据此处所述，技术人员能确定其它合适的稠密、颗粒性底物。
如下文“发明详述”部分所述，发明者证实，从鼠成纤维细胞衍生的PG13包装细胞(Gibbon Apc白血病病毒[GaLv]包膜蛋白假型)释放的逆转录病毒颗粒能有效浓缩为传染性逆转录病毒。PG13衍生的逆转录病毒颗粒自发地与加热杀死的福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Pansorbin)复合。这种复合物能够离心浓缩，结合的逆转录病毒颗粒保留感染靶细胞的能力，而不需要促进其释放的预先措施。
Kayman S.C.等人(J.Virology.99年3月，第1802-1808页)描述了使用Pansorbin排除(或负富集)野生型病毒的上清液，尽管他们没有涉及提高逆转录病毒滴度。然而，与本发明不同，该作者使用针对以前插入病毒(SC258)env基因中的表位的抗体，将其与病毒和Pansorbin混合，这是根据抗体的Fc将与Pansorbin上的蛋白A结合。作者认为，正富集需要从结合态回收传染性病毒，而且用来破坏抗体-抗原复合物的标准条件对逆转录病毒是致死的。与之相反，本发明者惊奇地确定，对于逆转录病毒保持传染性，逆转录病毒和Pansorbin的复合物不需要破坏。因此，Pansorbin或其它类似的颗粒性、稠密底物，例如Sansorbin，可用于帮助提高病毒滴度，而浓度乃至传染性不丢失，因为能够避免与逆转录病毒形成的复合物的破坏。
本发明者认为，在Pansorbin中使用的、最近克隆的存在于金黄色葡萄球菌Cowan I株表面的纤连蛋白结合蛋白(fnbA32和fnbB33)能解释观察到的这种结合，以及感染能力的保持。这些蛋白质可与PG13包装细胞基于的NIH 3T3细胞分泌的鼠纤连蛋白相互作用。上清液中的纤连蛋白然后可与PG13产生的逆转录病毒颗粒结合。因此，逆转录病毒似乎不直接与Pansorbin相互作用，而是通过纤连蛋白中间物结合。已知这种纤连蛋白相互作用加强而不是抑制逆转录病毒传染性，并且可以解释当与Pansorbin复合时逆转录病毒为何保持传染性。
尽管该方法对于PG13、PA317和GP+envAM12产生的逆转录病毒十分有效，但是使用其它逆转录病毒(如基于NIH 3T3的GP+E-86和基于人HT1080的FLYRD18和A13包装细胞)的结果并不令人满意。
因此，本发明者设计了另一种方法作为本发明的第二方面，前提是能利用抗纤连蛋白抗体从上清液中捕获逆转录病毒。因此，根据本发明的第二方面，结合成员是一种针对可与病毒结合的蛋白质的抗体或抗体结合域。该抗体可以针对实际存在于病毒表面上的蛋白质，或者可以针对可与病毒结合的蛋白质，即具有逆转录病毒自然结合亲和力的蛋白质。
当抗体结合成员不是稠密底物时，能通过静置培养利用重力或通过短时低速离心浓缩形成的复合物。因此，本发明的第二方面也提供捕获剂捕获复合物使其浓缩的用途。这类捕获剂的例子包括可利用磁体浓缩的顺磁颗粒(PMP)(Promega；其它供应商包括Dynal，MiltenyiBiotec)。也能使用非磁珠，只要它们较小，例如为1μm数量级，并且对低速离心敏感。在此处所述实施例中，所述抗体针对鼠纤连蛋白，发明者使用与多克隆兔抗小鼠纤连蛋白抗体偶联的链霉亲和素包被的顺磁颗粒，根据与鼠纤连蛋白的结合，磁性纯化PG13产生的颗粒。发明者表示，抗体可通过其Fc域结合蛋白A。蛋白A可通过生物素结合PMP形成复合物。此外也可使用生物素化的多克隆抗体。
因此，本发明的第二方面需要使用可与捕获剂结合的第一种偶联配偶体，例如链霉亲和素；和可与抗体结合域结合的第二种偶联配偶体，例如生物素。技术人员能够设计可与本发明联合使用的其它偶联配偶体。
然而，根据本发明第二方面的方法只适用于分泌纤连蛋白并产生具有纤连蛋白结合活性的病毒(如逆转录病毒)的鼠包装细胞。因此，为了提供更加通用的策略，发明者改进了这一方法，使用基于凝集素的亲和捕获方法，这将亲和捕获策略的适用范围扩展到其它病毒包装细胞，例如逆转录病毒包装细胞，如人HT1080衍生的包装细胞。这基于以下发现逆转录病毒包膜蛋白被包装细胞特异地糖基化，这些细胞释放的逆转录病毒的表面修饰反映了这一事实。
因此，根据本发明的第三方面，结合成员是一种能结合病毒(例如逆转录病毒)表面上糖基化蛋白质的凝集素。发明者第一次认识到，该方法可应用逆转录病毒的表面蛋白质(例如包膜蛋白)的翻译后糖基化修饰，而不需要为了保持传染性从结合成员释放。在下文关于本发明该方面的实施例中，使用的凝集素是从Bandeiraea Simplicifolia分离的同工凝集素B4(BS-IB4)(结合人类中不存在的α-半乳糖基)或主要结合α-甘露糖修饰的琥珀酰-伴刀豆球蛋白A。也可以使用技术人员所知的可与糖基化位点结合的其它凝集素，例如PHA。
对于本发明的第二方面，可能需要捕获剂捕获凝集素/逆转录病毒复合物，以便在静置培养中通过重力或通过短时低速离心浓缩。捕获剂优选地是顺磁颗粒。
关于本发明的第二和第三方面，捕获剂需要一种能捕获复合物(例如偶联配偶体，如抗体/逆转录病毒或凝集素/逆转录病毒)的机制。该机制可由偶联配偶体引起，如生物素/生物胞素-亲和素/链霉亲和素、受体-配体、抗体-抗原等。于是可以设计复合物，使它进一步含有偶联配偶体的一个成员，例如生物素，并且可以设计捕获剂，使其含有偶联配偶体的另一个成员，例如链霉亲和素。这样，当复合物与捕获剂接触时，偶联配偶体结合(生物素结合链霉亲和素)，从而连接复合物与捕获剂。
还存在其它实例。例如，本发明者使用可与抗体Fc区结合的蛋白A。因此可以使用一种可结合逆转录病毒的抗体，它对逆转录病毒表面存在的蛋白质是特异性的。蛋白A可以生物素化，使其被捕获剂(例如链霉亲和素包被的PMP)捕获，并与抗体/逆转录病毒接触。抗体的Fc区和蛋白A用作偶联配偶体，并用于使抗体/逆转录病毒复合物与捕获剂(PMP)接触。技术人员应当理解，蛋白G和蛋白L同样可以代替蛋白A使用。
利用偶联配偶体，例如配体，优选地将其与捕获剂(如PMP)结合，之后导入病毒上清液中。这样能优化捕获剂/偶联配偶体与上清液中的逆转录病毒复合物之比。
最后，发明者研究了第四种策略，它适用于所有病毒，优选地是当前可以获得的(和尚未发展的)逆转录病毒包装细胞型。除了包装细胞特异的逆转录病毒翻译后修饰外，发明者还研究了包括向逆转录病毒表面引入修饰的对蛋白质更有效(proactive)的方法。该方法使用琥珀酰酯(例如，生物素琥珀酰酯)的蛋白质特异的共价偶联活性。生物素修饰包装细胞的表面蛋白产生可被例如链霉亲和素PMP有效捕获的传染性逆转录病毒。
发明者惊奇地发现，偶联配偶体可用来向逆转录病毒表面表添加结合成员。这优选地利用琥珀酰酯衍生物实现，它能将生物素与包装细胞表面的蛋白质共价偶联。这些生物素化细胞产生的逆转录病毒例如与捕获剂上的链霉亲和素亲和偶联。
因此，本发明的第五方面提供了一种修饰病毒颗粒，以便于从含有这种修饰病毒颗粒的样品中捕获，以提高其滴度的方法，该方法包括在病毒包装细胞表面添加偶联配偶体的步骤，使包装细胞产生的病毒颗粒在其表面上展示这种偶联配偶体。
根据本发明的方法不仅可使病毒从包装细胞上清液中浓缩为升高的滴度，而且具有使用此处所述结合配偶体带来的其它优点。
例如，发明者发现，逆转录病毒不需要从结合表面分离才具有传染性。进而，发明者还发现，捕获剂/结合成员/病毒复合物能够冷冻。尽管融化过程将丢失可达50％的逆转录病毒活性，但这大大优于已知的其它方法。另外，由于根据本发明的方法逆转录病毒的初始浓度较高但体积较小，与未浓缩的病毒相比，只使用极少量的冷冻溶液，例如DMSO。这在治疗因DMSO毒性的患者中极有价值。
发明者进一步认为，根据本发明形成的复合物可用于疾病的治疗。例如，PMP/逆转录病毒复合物可用于体内导向。使用适当的PMP将允许利用NMR聚焦所需的磁场将其分离到特定区域。
因此，本发明也提供根据上述方法形成的复合物在制备用于向组织体内导向病毒(例如逆转录病毒)的药物中的用途。此处，本发明提供一种向人体或动物(哺乳动物)体内组织导向逆转录病毒复合物的方法，该复合物含有逆转录病毒和磁性颗粒，该方法包括对人体或动物体施用该复合物，并利用磁场将复合物吸引到组织。
也提供另一种导向组织的方法，它使用对结合成员或捕获剂的任何空余的结合能力。例如，如果根据本发明的第四方面修饰逆转录病毒表面使其携带生物素，它可被链霉亲和素PMP捕获。然而，发明者发现，不是所有的链霉亲和素都结合。因此，生物素化的抗特定组织抗原的抗体也可以通过链霉亲和素-生物素偶联配偶体与PMP结合。这样，抗体将与特定组织抗原结合，从而使结合的逆转录病毒与该组织接触。此外，蛋白A也可用来结合抗体的Fc域。组织抗原可以是对选择用于导向的组织类型特异的任何已知抗原。在一个实施方案中，组织抗原可以是一种肿瘤抗原，它可使逆转录病毒与特定肿瘤接触。逆转录病毒可进一步修饰，以携带外源核酸用于基因治疗。该方法具有逆转录病毒不需要根据导向的组织类型修饰的优点。
发明者也认为，根据本发明的方法可用于病毒的标记或鉴定。例如，上述捕获剂和/或偶联配偶体可用来从生物样品(如血液、血清、尿、精液等)中鉴定或分离病毒。可以从血样中有效提取HIV病毒。这可提供敏感性提高(提高约100倍)的HIV检测。此外，该方法也可与用来处理生物样品的其它技术结合使用。例如，在透析过程中可以利用捕获剂和/或偶联配偶体从血清中去除病毒。
因此，另一方面，本发明提供一种从样品(例如血液)中分离或去除病毒的方法，该方法包括下列步骤(a)使样品接触能特异结合该病毒的结合成员，使该病毒和结合成员形成复合物；(b)使该复合物接触一种能捕获该复合物的捕获剂；和(c)从样品中分离或去除该复合物和捕获剂。
如上所述，捕获剂可以通过偶联配偶体(如生物素和链霉亲和素)捕获复合物。如果捕获剂是PMP，可以利用磁场将它与它捕获的复合物一起去除。捕获剂也可以是偶联配偶体(如链霉亲和素)包被的固体载体，样品在其上流过。如果结合成员是可与偶联配偶体(如生物素)结合的抗体或凝集素，它将与固体载体偶联，从而从样品(如血液、尿或血清)中去除或分离复合物。
此处描述了适用于鼠源和人源包装细胞上清液的本发明每一方面的详细方法。
本发明的另一方面是，提供了一种试剂盒，或一种试剂盒在实施根据上述方法提高包装细胞上清液逆转录病毒滴度的方法中的用途；该试剂盒含有一种能与病毒结合的结合成员，和任选地如上所述的一种捕获剂和/或偶联配偶体。该试剂盒也可含有实施本发明的方法的说明书。根据本发明的试剂盒的组件的实例有顺磁珠、磁体、蛋白A-生物素复合物、抗鼠纤连蛋白抗体、抗人纤连蛋白抗体、伴刀豆球蛋白A-生物素复合物、BSI-B4-生物素复合物、生物素琥珀酰亚胺酯和洗涤缓冲液。
现在将通过实施例，参照
本发明的各方面和实施方案。本领域技术人员将明白其它方面和实施方案。本文提到的所有文件均在此引用作为参考。
附图简述图1。逆转录病毒上清液与浓度逐渐升高的Pansorbin预温育提高了有效滴度。在与福尔马林固定的金黄色葡萄球菌温育后测定PG13产生的逆转录病毒(IL-2/B7)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆转录病毒上清液立即滴定(T＝0，对照)或在不含Pansorbin(T＝0，对照)或含指定体积的Pansorbin时4℃温育2小时，之后用连续稀释的混合物感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图2。Pansorbin/逆转录病毒预温育的持续使有效滴度成比例升高。5ml等份PG13产生的逆转录病毒(IL-2/B7)上清液在不含Pansorbin下或与25μl Pansorbin温育，在指定时间用连续稀释的混合物感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图3。PG13产生的逆转录病毒载体(IL-2/B7)上清液/Pansorbin复合物的离心浓缩。收集逆转录病毒上清液，采样，连续稀释，立即感染K562细胞(T＝0)。然后将上清液分为50ml等份，在4℃下不加其它(T＝3)、只与250μl Pansorbin(P)或250μl Sansorbin(S)温育3小时。然后用连续稀释的T＝3、P和S样品感染K562细胞。另外，对5ml等份的T＝3和P样品进行0.45μm过滤，用于感染(第二次过滤和P过滤)。然后离心浓缩所有样品，并从T＝3和P中吸出上清液进行滴定(Cont Dep和Pdep)。T＝3的剩余上清液充分混合(如同悬浮沉淀)，用于滴定(Cont conc)。剩余的Pansorbin和Sansorbin样品沉淀重悬浮于10ml新鲜培养基中，再次离心，重悬浮于最小体积的培养基中(比初始体积减少180倍)，进行感染(P conc和S conc)。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图4。Pansorbin介导的逆转录病毒滴度的提高不只是对K562有效。收集PG13 IL-2/B7产生的逆转录病毒上清液，分为50ml等份，在4℃下不加其它(T＝3)、与250μl Pansorbin(P)温育。3小时后，用所有条件的样品感染NB4、U937和HeLa细胞(T＝3)。如上所述离心浓缩所有Pansorbin/逆转录病毒样品的剩余体积，再次用来感染NB4、U937和HeLa细胞(P conc)。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图5。Pansorbin与逆转录病毒复合不依赖于载体插入片段。收集PG13 RaRT产生的逆转录病毒上清液，立即用来感染K562、NB4、U937和HeLa细胞(T＝0)。剩余的50ml上清液在Pansorbin存在下4℃温育3小时(P)。温育后，离心浓缩样品，用于感染(P conc)。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图6。Pansorbin介导的浓缩效率随包装细胞型不同而不同。收集GP+envAM12IL-2/B7、PA317IL-2/B7、FLYRD18pBabe.puro、FLYA13pBabe.puro和GP+E-86pBabe.puro产生的逆转录病毒上清液，立即对人K562或鼠32Dp210骨髓细胞滴定(对照)。剩余的样品分为50ml(FLYRD18、FLYA13和GP+E-86)或10ml(GP+envAM12和PA317)等份，并在4℃下与250μl或50μl Pansorbin温育。3小时后，如上所述离心浓缩样品，再次感染靶细胞(Pansorbin浓缩物)。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图7。纤连蛋白结合的PG13产生的逆转录病毒的顺磁颗粒介导的浓缩。在与顺磁颗粒(PMP)温育之前和之后测定PG13产生的逆转录病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆转录病毒上清液立即滴定(对照)，或在4℃下与2.5×109链霉亲和素磁球(预先单独与蛋白A-生物素偶联，或与蛋白A-生物素和多克隆Ig兔抗小鼠纤连蛋白偶联)温育2小时。在如上所述磁性浓缩并洗涤后，用连续稀释的混合物感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图8。凝集素/PMP介导的PG13产生的逆转录病毒颗粒的捕获和浓缩。在与顺磁颗粒(PMP)温育之前和之后测定PG13产生的逆转录病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆转录病毒上清液立即滴定(对照)，或在4℃下与2.5×109链霉亲和素磁球(预先与生物素化的凝集素同工凝集素4(BSI-B4)、生物素化的凝集素伴刀豆球蛋白A(ConA)偶联)温育2小时。在如上所述磁性浓缩并洗涤后，用连续稀释的混合物感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图9。凝集素/PMP介导的FLYRD18和A13逆转录病毒颗粒的捕获和浓缩。在与顺磁颗粒(PMP)温育之前和之后测定FLYRD18和A13产生的逆转录病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。5ml等份的逆转录病毒上清液立即滴定(对照)，或在4℃下与2.5×109链霉亲和素磁球(预先与生物素化的凝集素同工凝集素4(BSI-B4)、生物素化的凝集素伴刀豆球蛋白A(ConA)偶联)温育2小时。在如上所述磁性浓缩并洗涤后，用连续稀释的混合物感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图10a。生物素琥珀酰亚胺酯/PMP介导的PG13逆转录病毒颗粒的捕获和浓缩。在与顺磁颗粒(PMP)温育之前和之后测定PG13产生的逆转录病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。未处理、DMSO温育或生物素琥珀酰亚胺酯标记的包装细胞的5ml等份逆转录病毒上清液立即滴定(对照，DMSO，生物素SE)，或者DMSO温育或生物素标记的包装细胞的上清液在4℃下与2.5×109链霉亲和素磁球温育2小时。在如上所述磁性浓缩并洗涤后，用连续稀释的混合物(DMSOconc，生物素SE conc)感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图10b。生物素标记的包装细胞的流式细胞分析。PG13细胞如上所述生物素化，并在37℃下温育过夜。在收集上清液进行逆转录病毒加工后，如上所述从底层取出细胞，1×106个细胞用亲和素FITC标记。两张分布图代表单独与载体(DMSO，实线)温育的细胞或在亲和素-FITC标记24小时前生物素化的细胞(生物素SE，虚线)。载体对照的平均荧光指数(MFI)为6.5，生物素化细胞的MFI为2000。
图11。生物素琥珀酰亚胺酯/PMP介导的FLYRD18和A13逆转录病毒颗粒的捕获和浓缩。在与顺磁颗粒(PMP)温育之前和之后测定FLYRD18和A13产生的逆转录病毒(pBabe.puro)上清液的cfu/ml。未处理、DMSO温育或生物素琥珀酰亚胺酯标记的包装细胞的5ml等份逆转录病毒上清液立即滴定(对照，DMSO，生物素SE)，或者DMSO温育或生物素标记的包装细胞的上清液在4℃下与2.5×109链霉亲和素磁球温育2小时。在如上所述磁性浓缩并洗涤后，用连续稀释的混合物(DMSO conc，生物素SE conc)感染K562细胞。每个值代表一式三份集落计数的平均值和标准差。
图12显示制品的冻融。未浓缩的对照逆转录病毒以2-5ml等份置于-20℃下冷冻。PMP捕获的浓缩逆转录病毒通过加入三倍体积的标准冷冻混合液(10％DMSO，20％FCS，终DMSO浓度为7.5％)并置于-20℃下冷冻。逆转录病毒制品尽可能快地融化，取出一等份进行检测，其余的放回-20℃。
图13。磁场介导的逆转录病毒感染HeLa细胞的定位。平板a)显示未感染培养物的嘌呤霉素选择的毒性作用，平板b)证实在没有磁性导向的情况下感染均匀扩散，c)显示靶细胞向培养物特定区域的有效定向感染，由逆转录病毒感染后存活的抗药性细胞的模型证实。平板d)显示用来引导局部感染的最初磁性模板，并证实定向感染非常接近地反映最初模板的形状。
关于本发明第一方面的详述PG13上清液与福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Pansorbin)的温育为了基因治疗的目的，我们使用含GaLv(Gibbon Ape白血病病毒)包膜蛋白的鼠成纤维细胞衍生的假型PG13包装细胞3。利用软琼脂集落计数试验对K562细胞滴定产生基于MoMuLv的载体(pWZLIL2/B7M Fusagene30，赋予盐酸杀稻瘟菌素S抗性，以后称为IL-2/B7)的混合细胞群体。图1中可见由这种混合群体获得的滴度(1.95×104cfu/ml)的代表性实例(T＝0，对照)。尽管这种滴度比以前的包装细胞大大提高，但仍不足以用于我们的目的。
发明者于是决定检验这样一种假说由于已知Galv假型31逆转录病毒和金黄色葡萄球菌32，33附着于纤连蛋白，那么与相对较大和稠密的细菌结合的逆转录病毒能在培养中在重力下沉淀，从而提高能感染靶K562细胞的逆转录病毒的局部浓度。与细胞培养物相容的金黄色葡萄球菌的易于获得的来源经加热杀死，甲醛固定，但在表面上仍保留功能性蛋白A34，因而可能保留其它表面表达的蛋白质活性。
图1显示一个实验，它使用与Pansorbin预温育的PG13产生的IL-2/B7逆转录病毒上清液。不含Pansorbin时，新鲜收获的上清液对K562细胞的cfu/ml滴度为1.95×104±4×103/ml(T＝0，对照)。在不含Pansorbin时4℃温育2小时后(T＝2，对照)，cfu/ml不变，为1.75×104±4×103/ml。然而，预温育中存在Pansorbin对逆转录病毒的cfu/ml滴度具有剂量依赖的影响。可达25μl的Pansorbin与PG13产生的逆转录病毒载体预温育2小时使得对K562细胞的有效cfu/ml滴度提高多达3倍。
Pansorbin/逆转录病毒预温育时间对传染性的影响使用25μl Pansorbin/5ml逆转录病毒上清液，研究了最佳预温育时间(图2)。温育2小时后，Pansorbin介导的滴度增加达到稳定期(5.3×104±9.5×103cfu/ml)，而不含Pansorbin的对照cfu/ml滴度保持稳定(T＝0，9×103±1.1×103cfu/ml；2小时，8.33×103±1.7×103cfu/ml)，但在4小时后降低为5.4×103±1.1×103cfu/ml。在随后的实验中，常规使用3小时的温育时间和25μl Pansorbin/5ml上清液。值得注意的是，在使用25μl Pansorbin的图1中，2小时后cfu/ml滴度提高3倍，而在图2中在相同条件下超过7倍。这与其它实验(数据未显示)一致，这类实验平均约有5倍cfu/ml提高。
与Pansorbin复合后逆转录病毒的低速离心浓缩图1和图2所述的实验以小体积上清液进行，但为了成为实用方法需要放大。逆转录病毒只在重力下的Pansorbin特异的沉淀提示，低速离心可从包装细胞上清液中浓缩并纯化逆转录病毒。本发明者于是将50ml逆转录病毒上清液样品与250μl Pansorbin温育，并试图浓缩逆转录病毒；图3显示一个典型实验的结果。
温育前的对照滴度约等于图1和图2中的类似滴度(1.4×104±7.5×102cfu/ml)，4℃预温育3小时后减半为7.2×103±7.3×102cfu/ml，表明这可能是温育时间的上限。与Pansorbin温育3小时再次将有效cfu/ml由1.4×104提高到2.3×105(即16倍)。这部分过程的效率是最佳结合时间、逆转录病毒传染性降低和逆转录病毒或Pansorbin与容器非特异性结合之间的平衡。这可以解释单独预温育在只温育3小时后在放大形式中为何更加有效。为了证实病毒与Pansorbin物理复合，从温育混合物中取出5ml等份，通过0.45μm滤器过滤一次，立即滴定。在不含Pansorbin情况下温育3小时后，第二次过滤逆转录病毒使滴度降低38％(由7.2×103cfu/ml[T＝3]降为4.4×103cfu/ml[第二次过滤])。对Pansorbin温育样品(P)进行的相同处理使滴度降低97％以上(PP过滤，2.3×105cfu/ml5.4×103cfu/ml)。因此只通过过滤就能从共温育中除去97％以上的逆转录病毒滴度。
在滴定之前低速离心剩余的45ml Pansorbin逆转录病毒混合物，洗涤一次，重悬浮于250μl新鲜培养基中(体积减少180倍)，使cfu/ml为1.1×108cfu/ml(Pconc)，代表cfu/ml提高7.8×103倍。当单独与对照上清液比较时，浓缩物中检测到的有效滴度大大高于预期。当浓缩物和与Pansorbin温育并不经离心滴定的上清液相比较时，这种异常并不显著(P conc，1.1×108cfu/mlP，2.3×105cfu/ml)，尽管在体积只减少180倍的情况下仍达到滴度提高473倍。用离心样品(Pdep)的上面25ml上清液进行感染滴定证实，不是所有逆转录病毒传染性都与Pansorbin一起沉淀，在上清液中仍保留了2.7×104cfu/ml的滴度。这可能代表不与Pansorbin结合的逆转录病毒，或者与低速离心下不沉淀的Pansorbin结合的逆转录病毒。
作为对照，也在不含Pansorbin下温育3小时后，进行逆转录病毒上清液的离心。将不可见的沉淀重悬浮于250μl浆液中，不需要洗涤步骤(cont conc)，显示1.6×106cfu/ml的惊人的高滴度；与对照相比提高115倍，尽管比单独Pansorbin达到的低＞60倍。理论上，在这种条件下不可能达到68-123％的逆转录病毒回收率(根据与作为对照的T＝0或T＝3比较)，因为2600g 10分钟在时间和g值上都大大低于其它任何离心方案。
为了排除B7-135的胞外Ig样域可显示于逆转录病毒表面36，37并与Pansorbin蛋白A结合的可能性，利用Sansorbin(蛋白A阴性的金黄色葡萄球菌，Wood 46)平行进行浓缩。利用Sansorbin仍能将逆转录病毒浓缩为1.15×107cfu/ml，尽管效率比Pansorbin低10倍(也在未离心的Sansorbin中见到)，但仍好于单独的离心。这表明，Pansorbin浓缩的蛋白A成分可能主要贡献于浓缩作用。然而，也可能是Sansorbin(Wood 46)以通常不可检测的水平表达蛋白A，或者Wood46对纤连蛋白有较低的亲和力。
逆转录病毒浓缩不是靶细胞特异的为证明该作用不是只对K562细胞特异，平行使用相同的逆转录病毒制品感染其它两种人骨髓细胞系，NB4和U937，它们示于图4，同时用分别的逆转录病毒制品感染人粘附上皮HeLa细胞。逆转录病毒上清液温育3小时后，对照物对NB4细胞的滴度极低(46±40.4)，标准差极大，这是用稀释于1ml细胞悬液中的100μl纯上清液测定的。体积减少180倍后，有效滴度升高到1.3×104cfu/ml，表示滴度只升高了282倍。
利用稀释于1ml细胞悬液中的100μl纯上清液，U937细胞根本不感染，因此对K562细胞的滴度为7.2×103cfu/ml的PG13产生的相同上清液(图3)对NB4细胞的滴度减少150倍，对U937细胞的滴度为0。U937细胞的可靠感染只在浓缩后实现(P conc，1.3×103cfu/ml)，并且由于初始滴度为0，无法估计浓缩效率。最后，对于HeLa细胞，在160倍浓缩后，逆转录病毒上清液的初始滴度由410±46提高了超过4×103倍(P conc，1.65×106cfu/ml)。虽然病毒(对于K562、NB4和U937，同一天，相同的病毒制品)的初始滴度有很大差异，但在任何情况下通过与Pansorbin温育和离心，滴度都会增加，尽管对于NB4不是特别有效。
逆转录病毒浓缩不是载体插入片段特异的已经表明逆转录病毒的浓缩对于其它靶细胞是有效的(尽管易变)，我们设法确定逆转录病毒与Pansorbin偶联是只限于逆转录病毒载体中特异插入片段(即B7-1)的作用，还是适用于PG13释放的其它逆转录病毒载体。发明者扩展到研究与pWZLIL2/B7MFusagene30相同但含有另一个插入片段的逆转录病毒载体spine(pWZLblast38)。该载体编码一种不含信号肽的截短基因，被称为RaRT(截短的视黄酸受体α)。图5显示，这种PG13生产细胞混合群体释放能以相同方式浓缩的逆转录病毒。过滤后立即对K562细胞滴定显示滴度为1.25×105cfu/ml(比IL-2/B7约高10倍)。Pansorbin介导的离心浓缩在体积减少200倍后使滴度提高到7.7×108cfu/ml(Pconc，提高6333倍)。通过离心(和洗涤)浓缩对照逆转录病毒证实，在体积减少200倍的情况下，滴度提高50倍(6.6×106±8.6×105cfu/ml)(数据未作图)。
同样浓缩的逆转录病毒制品当用来感染NB4细胞时，也显示有限的滴度升高(875倍)(T＝05.6×103cfu/ml，P conc4.9×106cfu/ml)。在这种情况下，该病毒上清液对U937的初始滴度为9.4×103cfu/ml，在P conc中升高到4.65×107cfu/ml(4900倍)。初始滴度为3.35×104cfu/ml的HeLa细胞显示滴度并不显著地提高约2500倍。逆转录病毒浓缩不是PG13特异的Pansorbin介导的浓缩用PG13释放的不同载体进行，对K562靶细胞不是特异性的。表1显示了对当前其它包装细胞系和不同插入片段的有限调查。PG13包装细胞似乎最有效地浓缩(3500倍，体积减少200倍)。然而，仅次于它的是GP+envAM1239(当对200倍浓缩标准化时，滴度提高3500倍)和PA31740(当对200倍浓缩标准化时，滴度提高1500倍)。鼠成纤维细胞衍生的包装细胞似乎以完全不同的方式对人肉瘤细胞衍生的FLY5包装细胞反应，对于后者Pansorbin介导的浓缩基本无效。亲嗜性GP+E-8641细胞不能只对鼠靶细胞检测，因此与感染人细胞的比较是不恰当的，但是来自这些细胞的逆转录病毒不能十分有效地浓缩。
讨论Pansorbin用作不溶性稠密底物证明了这些高密度颗粒在传染性逆转录病毒寿命内能与相对较低滴度的逆转录病毒上清液相互作用的原理。在图1中，显示逆转录病毒上清液与Pansorbin共温育能提高转录病毒的有效滴度(cfu/ml)。这种相互作用时程的确定(图2)显示，尽管最初的相互作用极快，但是在超过60分钟的温育后获得最佳结果。发明者将这种结果解释为，逆转录病毒与Pansorbin复合，在静置培养中一定比例的复合物在重力作用下沉淀，从而提高了可与靶细胞结合的逆转录病毒的局部浓度。显然，K562细胞暴露于Pansorbin即便过夜温育也没有毒性。可以认为，Pansorbin不是促进感染而是螯合上清液中可能存在的某些抑制因子8，22。然而，发明者认为这一解释是不可能的，因为在标准感染方案中加入未感染的PG13生产细胞的上清液不能抑制逆转录病毒的有效滴度(数据未显示)，过滤逆转录病毒/Pansorbin共温育物表明cfu/ml活性与Pansorbin分离。也清楚逆转录病毒不需要与Pansorbin分离也具有传染性，或者仅仅37℃温育过夜就足以促使其释放。然而，在使用Pansorbin和抗逆转录病毒包膜抗体介导复合物形成的其它方法中可能不是这样，此时逆转录病毒的传染性似乎受到损害42。
使用图1和图2所示的数据，合理选择Pansorbin体积和共温育时间，并在放大实验和离心浓缩中使用。在我们的方案中Pansorbin/逆转录病毒相互作用十分强，允许在2600g下进行两轮离心，相对剧烈地重悬浮于新鲜培养基中，之后滴定。静置培养中重力引起的体积减少和传染性提高可能是对K562测定的滴度升高远高于单独体积减少所预期的这一事实的一种解释。某些靶细胞对Pansorbin也可能有亲和力，它能在靶细胞附近保留逆转录病毒。图3显示，无论机制如何，在体积只减少180倍的情况下，有效滴度能提高可达7500倍。另一个意外是，在不含Pansorbin的情况下离心上清液也能提高滴度，尽管有效性很低。这可能表明，PG13产生的逆转录病毒能与培养物中的未知因子复合，使可离心的沉淀物交联并浓缩。
图3的排除研究(Pdep)不很清楚；发明者将上清液的活性解释为，在这种速度下Pansorbin不会完全沉淀。在复合的逆转录病毒通过0.45μm滤器时，样品形成更清楚的图片，预过滤物的滴度降低多达90％(PP过滤)。但是滴度不会降为零，可能表明多数可利用的逆转录病毒仍未结合Pansorbin(甚至是优化的方案)，或者过滤足以将结合的逆转录病毒与Pansorbin分离。
在没有阴性对照的情况下，对于浓缩方案(理解地没有逆转录病毒结合活性的Pansorbin)，Pansorbin上蛋白质A的活性不能完全降低。应用Sansorbin的平行实验显示，作用可能相当复杂，尽管Sansorbin远不如蛋白A阳性相应物有效，但它仍产生非常令人鼓舞的结果。Sansorbin(Wood 46株)不是只缺乏蛋白A的Cowan I(Pansorbin)的遗传工程亚株，而是一种完全不同的菌株，因此这些细胞中也可能缺乏完全不同的细胞表面蛋白。用链霉亲和素偶联的顺磁珠(与从分泌型变异金黄色葡萄球菌株中纯化的生物素化蛋白A复合)再次浓缩的努力只显示较低的逆转录病毒结合活性(数据未显示)，这可有助于将(discount)蛋白A作为配体。
为了确定该浓缩方法的用途如何广泛，发明者希望确定K562是否是这类方法的唯一靶细胞。图4相当清楚地显示，附着HeLa细胞以与K562细胞相同但程度较低的方式反应。IL-2/B7逆转录病毒对U937细胞的传染性的低滴度也意味着对这些细胞不能估计浓缩比。
尽管浓缩病毒感染细胞系的能力不是细胞特异的，但对于确定逆转录病毒对Pansorbin的向性是否是IL-2/B7插入片段独有的至关重要。因此，发明者用其它载体(如pWZLblast中的RaRT插入片段)重复了该方案。图5中详述的结果显示，浓缩逆转录病毒载体的能力不是对特定插入片段/载体构建体特异的。然而，令人感兴趣的是注意到，在这种情况下，U937靶细胞比NB4细胞更易于感染。这可能是由于插入片段的作用，如对U937细胞具有毒性的IL-2表达，尽管发明者不能证明在只加入浓度高达50000U/ml的人IL-2的三种悬浮细胞中软琼脂克隆效率有任何抑制。在IL-2存在或不存在下，U937、K562和NB4的克隆效率分别为78％、43％和10％(细胞以200个细胞/平皿接种；数据未显示)。因此，外源IL-2对这些细胞无毒，但是为了确定从头合成的胞内IL-2的存在对这些细胞是否具有不同的毒性，需要调节型表达载体。
通常对50ml上清液样品进行Pansorbin离心浓缩，并且放大，该方法主要依赖于能输入系统中的上清液的量。利用50ml离心管每10分钟能离心400ml上清液，使得从成升的上清液中生产病毒变得相对容易。最初是由于病毒滴度较低的问题进行该研究，并推测用高滴度原料能达到什么程度。Pansorbin购买时为10％(w/v)悬液，但用血细胞计数器能获得估计的颗粒数，表明浓度为1×1010-1×1011/ml。因此，浓缩50ml上清液的标准方案(250μl Pansorbin)使用约1.25×1010个颗粒，甚至假定每个颗粒只能结合一个传染性逆转录病毒颗粒，这使Pansorbin具有携带50ml上清液中1.25×1010个逆转录病毒颗粒的能力。该方法利用高滴度生产细胞可能与利用发明者研究的细胞同样(或更加)有效。假定上清液含有1×106cfu/ml逆转录病毒，当与正常浓度的Pansorbin(2.5×108/ml)混合时，每个逆转录病毒距其邻近病毒平均100μm，而Pansorbin颗粒平均相距只有16μm。因此，逆转录病毒在到达Pansorbin颗粒附近之前只需要运动10-20μm，因此提高或降低上清液中的逆转录病毒含量(假如它低于Pansorbin的携带能力)使逆转录病毒接触Pansorbin颗粒的可能性差异极小。人们可能预期逆转录病毒当与Pansorbin结合时将不能感染靶细胞，事实上当在37℃下用靶细胞稀释时确实如此，此时存在向培养基中逐渐释放逆转录病毒的逆反应。然而，发明者认为逆转录病毒在感染靶细胞时仍与Pansorbin复合。
尽管没有关于结合机制的权威性数据，但发明者确信病毒与Pansorbin结合，如图3所见(P和P过滤)，过滤共温育的上清液将不会降低滴度。
此处显示本发明的第一方面对PG13细胞有效，浓缩方法对PG13优化。然而，利用相同方案导向K562细胞，发明者也发现单独的Pansorbin对GP+envAM1239和PA31740(小鼠包装细胞，兼嗜性鼠白血病病毒包膜)很有效，当对200倍体积减少标准化后，滴度分别增加1500倍和600倍。此外，也对其它包装细胞系实施该方法，如FLYA135(人HT1080纤维肉瘤细胞，兼嗜性鼠白血病病毒包膜)、FLYRD185(具有RD114猫内源病毒包膜的HT1080)。另外，发明者还发现，对鼠32Dp21043骨髓细胞滴定的亲嗜性包装细胞GP+E-8641(Mo-LULV env)产生的逆转录病毒在体积减少200倍的情况下Pansorbin能被浓缩150倍，这符合FLYA13对K562细胞的效率。
发明者认为，纤连蛋白中间物可介导逆转录病毒与Pansorbin的结合。至少两种细菌基因的蛋白质产物似乎是特化的膜结合纤连蛋白结合蛋白(fnbA32和fnbB33)，它们均从金黄色葡萄球菌(不是CowanI株)中克隆。然而，外源应用重组fnbB短肽33能阻断Cowan I的纤连蛋白结合能力(fnbA未检测)。尽管没有这样直接检测Wood 46株，但已经证实，Cowan I在纤连蛋白或层粘连蛋白存在下凝集的能力在Wood 46中基本不存在44。也注意到这两种菌株同样地附着于纤连蛋白包被的塑料组织培养器皿44，表明Wood 46可能fnbA或fnbB缺陷，但或许不会两者都缺陷。也曾经报道，包装细胞系GP+E-86、GP+envAM12、PA317和PG13产生的逆转录病毒都可结合重组人纤连蛋白片段(CH-296116，31，也称作RetroNectinTM)。因此，NIH3T3衍生的包装细胞45产生的逆转录病毒和纤连蛋白在培养过程中能与纤连蛋白结合是合理的，这种纤连蛋白/逆转录病毒复合物然后可通过fnbA或fnbB与Pansorbin结合。大多数包装细胞表达纤连蛋白的水平肯定是测定逆转录病毒滴度的限制因素，在RetroNectin处理后未见提高。尽管没有正式检测鼠包装细胞的纤连蛋白分泌，但FLYA13和FLYRD18核心处的人HT1080纤维肉瘤细胞只表达占总蛋白质0.004％的纤连蛋白，相比而言，与正常人二倍体成纤维细胞相关的占0.3％46，FLYRD18包膜甚至不能结合纤连蛋白47。FLYA13细胞尽管应用与GP+envAM12和PA317相同的env蛋白，在浓缩试验中也表现极差。
Pansorbin/纤连蛋白/逆转录病毒复合物也可能以类似于RetroNectin的方式促进感染，因为纤连蛋白中的细胞结合域可与靶细胞交联16，这在NB4细胞中效率较低，因为它们表达的许多VLA-4和VLA-5可能无活性48。
发明者曾经使用不同的4批Pansorbin、两批Sansorbin和一批来自Sigma Aldrich的Pansorbin相当物。他们发现Pansorbin的浓缩能力有2-4倍的批间差异(浓缩后滴度升高2000-7500倍)，他们发现Pansorbin总比Sansorbin更有效，而且总是优于Sigma Aldrich的产品。初看起来，可能担心这种批间差异。然而，Cowan I的制备方法已经优化，并且对蛋白A但未对fnb进行质量控制。Sigma Aldrich产品的较差活性似乎与它在2600g下沉淀的程度相关，因此优化更好的离心条件可提高其活性。
尽管本发明明显适用于体外研究，但对治疗的适用性则有争议，因为在高浓度Pansorbin存在下甚至体外转导的细胞也必须花费时间。可以认为，在感染过程中毒性因子可以滤除Pansorbin，如果它们附着于细胞疫苗则可能具有体内毒性。但是，本领域的其他作者不考虑这种可能性。然而，尽管这样，只有Pansorbin的蛋白A成分获准用于人体(自身免疫性血小板减少性紫癜，ITPP)50。此外，只用蛋白A离体吸收患者血浆在病毒诱导的大鼠恶性肿瘤51中获得的下列有希望的结果对转移性乳腺癌52，53、卡波氏肉瘤53和结肠癌53已经到达临床试验阶段，这基于去除认为抑制抗肿瘤免疫应答的抗体复合物52，53。然而试图推测蛋白A和fnb在治疗其它恶性肿瘤中对Cowan I的相对贡献，逆转录病毒作用的证据十分引人注目，病毒败血症的减少将取决于循环逆转录病毒/抗体复合物54，55。
Pansorbin的作用证明，在逆转录病毒的半衰期内能发生逆转录病毒与颗粒性底物的相互作用。这允许我们发展一种简单的浓缩逆转录病毒载体的方法。但是，本发明的其它方面是使用可能更加有助于临床实践并适用于多种包装细胞系的试剂的改进。
关于本发明第一方面的材料与方法细胞系人(NB4、U937、K562)和小鼠(32Dp21043)骨髓细胞系和HeLa上皮细胞在RPMI+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(均为Sigma，Poole，UK)中常规生长。悬浮细胞保持于1×105-1×106/ml，而HeLa细胞通过胰蛋白酶消化传代，并保持低于7×106/90mm组织培养皿。
小鼠胚胎成纤维细胞衍生的GP+envE-8641、PG13 GaLv假型3(CRL-10686，从ATCC获得)、GP+envAM12、GP+E-86、PA317和人肉瘤衍生的FLYA13和FLYRD18包装细胞在DMEM+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素中常规生长。细胞保持于90mm组织培养皿中，通过胰蛋白酶消化传代，保持于5×105-7×106/90mm组织培养皿。
试剂Pansorbin(Calbiochem-Novabiochem，Nottingham，507858)是加热杀死的、福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Cowan I)的10％(w/v)悬液，携带高细胞表面密度蛋白A的1μm颗粒，在4℃下贮存，4-6周后更换。Sansorbin(Calbiochem-Novabiochem，Nottingham，557601)是加热杀死的、福尔马林固定的金黄色葡萄球菌(Wood 46)的10％(w/v)悬液，不含蛋白A的1μm颗粒，在4℃下贮存，4-6周后更换。不溶性蛋白A(Sigma，Poole，UK，P-7155)细胞悬液，约10％(湿重/体积)不能存活的金黄色葡萄球菌Cowan株，在4℃下贮存，4-6周后更换。标记的蛋白A-生物素(Sigma，Poole，UK，P-2165)从分泌蛋白A的金黄色葡萄球菌株的培养基中纯化(2mg/ml，于pH8.0的PBS中，-20℃贮存)。盐酸杀稻瘟菌素S(ICN Pharmaceuticals，Basingstoke，UK，150477)过滤除菌，以5mg/ml-20℃贮存于水中。纯净琼脂(Difco Laboratories，Detroit，USA，0142-17-0)。polybrene(Sigma，Poole，UK，H-9268)在水中制成8mg/ml，过滤除菌贮存于-20℃。链霉亲和素磁球顺磁颗粒(Promega，Madison，USA，Z5482)为1mg/ml(5×108颗粒/ml)1μm直径顺磁颗粒，在PBS中4℃贮存。
生产细胞的产生和培养FG13、GP+envAM12和PA317包装细胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接种；4小时后，吸出培养基，更换为10ml过滤(0.45μM)的含4μg/ml polybrene的GP+E-86上清液。这些磷酸钙转染的GP+E-86混合细胞群体产生pWZLIL-2/B730或pWZLRaRT逆转录病毒载体(赋予杀稻瘟菌素S抗性)或pBabe.puro载体(赋予嘌呤霉素抗性)。24小时后重复感染，细胞再培养48小时，在含10μg/ml杀稻瘟菌素S或5μg/ml嘌呤霉素的DMEM+10％FCS中筛选4周，冻存抗性细胞的混合群体。
FLYRD18和FLYA13包装细胞以7.5×105/90mm平皿的密度开始，过夜培养后吸出培养基，更换为10ml过滤(0.45μm)的含8μg/mlpolybrene的PG13.pBabe.puro。72小时后吸出培养基，更换为含5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。细胞再培养7天，此时所有对照培养物均死亡，冻存存活细胞的混合群体。
逆转录病毒的产生PG13、GP+envAM12、PA317和GP+E-86生产细胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接种；72小时后更换培养基；24小时后吸出培养基，通过0.45μm滤器过滤，进一步处理。FLYA13和FLYRD18细胞以2×106/90mm平皿的密度接种，48小时和72小时后更换培养基，总共96小时后吸出培养基，通过0.45μm滤器过滤，进一步处理。
金黄色葡萄球菌的制备Pansorbin、sansorbin或不溶性蛋白A用PRMI+10％FCS 1∶20稀释，4℃贮存18小时。离心(2600g，20分钟，4℃)所需的量，在PRMI+10％FCS中重悬浮为希望的浓度。
Pansorbin/Sansorbin的制备和浓缩逆转录病毒复合物将指定体积的Pansorbin/Sansorbin加入到无菌聚丙烯管中希望体积的逆转录病毒上清液中，混合物在4℃和恒定摇动下温育(StuartScientific SRT1倾斜旋转混合器)。在指定时间时，直接取出混合物测定cfu/ml滴度或离心浓缩。对于浓缩离心45或50ml混合物(2600g，10分钟，4℃)，弃去上清液，沉淀重悬浮于10ml冷DMEM+10％FCS中，如上所述再离心一次。倾出上清液，试管倒置贮存60秒排净，沉淀重悬浮于约250μl冷RPMI+10％FCS中。重悬浮沉淀可能较困难，因为它倾向于凝块(特别是Pansorbin)，250μl终体积倾向于由50％堆积体积和浆液和50％的新鲜培养基组成。必要时能以150g脉冲混合物(使之有效恢复)，移到聚丙烯冻存瓶中在冰上贮存并测定cfu/ml滴度。
cfu/ml滴度的测定计数K562、U937、NB4和32Dp210细胞的悬液，用含有4.4μg/mlpolybrene的RPMI+10％FCS调节为4×105/ml。然后将细胞以1ml等份接种于24孔细胞培养板中，在37℃/5％CO2下温育1-3小时。逆转录病毒制品用RPMI+10％FCS 1∶10连续稀释，将100μl加到一式三份孔中充分混合。18-24小时后，0.9ml细胞与3.8mlRPMI+24％FCS+1.3mM丙酮酸钠混合，保持于37℃下，随后加入0.3ml高压灭菌的5％v/v纯净琼脂水溶液(终浓度为0.3％)，保持于60℃。细胞然后接种于60mm组织培养皿中，使琼脂凝固后，置于37℃/5％下。再过18-24小时后，小心加入含有20μg/ml杀稻瘟菌素S或10μg/ml嘌呤霉素的5ml RPMI+20％FCS+1mM丙酮酸钠，分别使软琼脂选择浓度为10μg/ml和5μg/ml。平皿再放回培养2-3周，之后测量软琼脂集落数。cfu/ml浓度计算为每个平皿的集落数/孔乘以稀释倍数。在所有cfu/ml测定中进行倍数稀释，尽管大多数没有价值，含有太少或太多的集落而无法精确计数(即多于300/60mm平皿)。
附着的HeLa细胞用胰蛋白酶消化，计数，并用RPMI+10％FCS调节为1×105/ml，然后以0.5ml等份接种于24孔细胞培养板中。温育18小时后(37℃/5％)，感染1-3小时前，加入另外0.5ml含polybrene的培养基，使终浓度为4.4μg/ml。
逆转录病毒在RPMI+10％FCS中进行1∶10连续稀释，向靶细胞中一式三份加入100μl等份的适当稀释液，并混合。感染48小时后，培养基更换为含有10μg/ml杀稻瘟菌素S的新鲜培养基。每3-4天更换一次培养基，持续2周，之后吸出培养基，培养板用2ml考马斯蓝染液染色(5.35％wt/vol溶于45％甲醇∶10％乙酸)，用自来水洗涤，计数集落，测定滴度。
关于本发明第二、第三和第四方面的详述纤连蛋白结合的PG13产生的逆转录病毒的顺磁颗粒介导的浓缩为了确定PG13产生的逆转录病毒实际上是否与包装细胞上清液中的纤连蛋白结合，发明者使用与PMP偶联的抗鼠纤连蛋白多克隆抗体。图7详述了使用以前描述软琼脂集落形成试验56测定这些颗粒捕获传染性PG13逆转录病毒的能力。在未浓缩情况下，对人骨髓K562细胞的初始滴度(cfu/ml)为1.4×105±9×103cfu/ml(对照)，用蛋白A-生物素偶联的PMP(PAB)将上清液体积浓缩125倍使其滴度提高100倍以上，至1.6×1 07±3.4×106cfu/ml。然而，多克隆兔抗小鼠纤连蛋白、通过蛋白A-生物素与PMP偶联的抗体(蛋白A抗体生物素PAAB)在体积同样减少125倍的情况下，使滴度提高到4×108±9.5×107cfu/ml，增加2800倍。导致定向特异性抗体锚定的抗体蛋白A-生物素组合比单独的蛋白A-生物素效率高25倍。然而，单独的蛋白A-生物素的效率不能提示蛋白A对纤连蛋白或逆转录病毒的有限亲和力。
小鼠纤连蛋白抗体允许从逆转录病毒上清液中捕获鼠纤连蛋白衍生的包装细胞产生的传染性逆转录病毒。体积只降低125倍导致逆转录病毒滴度提高2000-3000倍。捕获的逆转录病毒群体的总传染性(cfu/ml)约20倍于对照上清液。这可反映病毒向细胞的输送增强，这是由于重力介导的PMP沉积，而不是单独的布朗运动15，或在PMP捕获后逆转录病毒的传染性提高。在磁性浓缩后使用逆转录病毒/PMP混合物的上清液的排除(depletion)研究也表明，上清液的逆转录病毒滴度降低约90％。该数据证实PG13包装细胞向上清液中分泌鼠纤连蛋白，大多数逆转录病毒颗粒与之结合，或者在不含纤连蛋白时逆转录病毒没有传染性。
该方法的效率显示，在这些条件下，负责逆转录病毒与纤连蛋白、纤连蛋白与靶细胞结合的表位不被抗体空间阻碍。该方法使用总共1.25×109PMP浓缩5ml逆转录病毒上清液，而PMP数量减少的其它实验导致广泛的交联，这由PMP的凝集证实。使用较低浓度蛋白A-生物素和抗体的其它试验也使逆转录病毒浓缩效率降低。
凝集素/PMP介导的逆转录病毒颗粒的捕获鼠包装细胞释放的逆转录病毒颗粒对人血清灭活极敏感，这似乎依赖于使用的包装细胞和包膜蛋白57。这种敏感性主要由鼠包装细胞释放的逆转录病毒颗粒的包膜蛋白的末端Gal(α1-3)Gal修饰引起。这种鼠酶的人同源物具有遗传获得的突变，导致人细胞中(α1-3)半乳糖基转移酶活性不明显。针对人血清中可见的Gal(α1-3)Gal修饰的高水平抗体确保鼠包装细胞产生的逆转录病毒载体在体内快速灭活57。PG13产生的逆转录病毒上存在Gal(α1-3)Gal修饰提供了捕获PG13逆转录病毒的第二种策略。图8显示使用与Gal(α1-3)Gal结合同工凝集素B4(BSI-B4)61或伴刀豆球蛋白A(ConA)62偶联的PMP的浓缩效率，ConA主要结合更多普遍存在的α-甘露糖修饰。使用与PMP偶联的这两种凝集素的任一种，在上清液体积减少125倍后，4×105±5.5×104cfu/ml的对照滴度能升高到7×108±6.4×107cfu/ml(1700倍)(生物素-BSI-B4)，或5.4×108±5×107cfu/ml(1300倍)(生物素-ConA)。单独的PMP浓缩导致升高4倍(1.6×106±4×105cfu/ml)，证明逆转录病毒浓缩依赖于凝集素而不是链霉亲和素。这一策略可以更广泛地应用，因为它对于不能结合纤连蛋白的逆转录病毒载体也可能是有效的47。在这种情况下意外发现，由于逆转录病毒与PMP紧密结合，并且不能被大的中间蛋白质(如纤连蛋白)捕获，它仍有传染性，这是本发明的第二方面。对于ConA尤其如此，ConA是一种已知可抑制HIV-1体外传染的凝集素63，尽管这可能是反映其独特受体应用的特殊情况64。类似的ConA捕获策略实际上消除了HIV-1的传染滴度(降低95％以上)65也令人感兴趣，与之明显相反的是应用PG13产生的载体可见的提高。然而，凝集素也能以类似于纤连蛋白的方式结合上清液中作为中间物的蛋白质，而不直接结合逆转录病毒本身。
应用于人HT1080衍生的包装细胞的凝集素/PMP介导的磁性浓缩也对FLYA13和FLYRD18产生的逆转录病毒测试了凝集素策略5，66，发明者以前不能设计对它们有效的方法。图9显示凝集素/PMP介导的FLYRD18和FLYA13产生的逆转录病毒的浓缩。FLYRD18细胞的(对照)滴度为3.5×104±1.1×104cfu/ml，ConA介导的浓缩(125倍)将其提高为1.2×107±3.6×106cfu/ml。这种342倍的提高远少于用PG13能达到的1300倍，表明ConA/PMP介导的FLYRD18逆转录病毒效率通常比PG13产生的低5倍。BSI-B4/PMP浓缩的滴度只比对照高6倍(2.2×105±6.4×104cfu/ml)，证实人细胞上最低程度的存在α-半乳糖基。FLYA13细胞的(对照)滴度为6.2×10±5.7×102cfu/ml，在ConA/PMP介导的体积减少125倍后，滴度升高369倍，为2.3×106±2×105cfu/ml。BSI-B4在捕获人源包装细胞释放的逆转录病毒中无效。尽管对FLY的有效性比PG13产生的逆转录病毒低，但凝集素介导的浓缩仍是至今对于HT1080(FLY)产生的逆转录病毒家族所述中最有效的。
生物素琥珀酰亚胺酯/PMP介导的PG13逆转录病毒颗粒的捕获本发明的第二方面(抗体介导)和第三方面(凝集素介导)也许不能广泛适用于或有效用于迄今在基因治疗中使用的所有包膜逆转录病毒包装细胞系。因此，发明者设计了本发明的第四方面，这也许是对于PMP介导的逆转录病毒浓缩最有效的一方面。使用标记包装细胞的方法67，68，用琥珀酰亚胺酯衍生物标记PG13包装细胞，该衍生物共价偶联生物素与包装细胞表面上的蛋白质。图10a显示生物素化包装细胞产生的逆转录病毒的PMP介导浓缩的结果。未浓缩时，包装细胞的生物素化(BSE)或单独的载体(DMSO)处理对滴度没有影响(对照4.6×103±1.5×104cfu/ml，DMSO4.2×105±2.6×104cfu/ml，BSE4.2×105±3.6×104cfu/ml)。未生物素化时(单独用DMSO载体处理细胞)，单独的PMP不能捕获逆转录病毒(DMSO浓缩4.6×105±1×105cfu/ml)。生物素化的包装细胞分泌一种逆转录病毒，它与PMP上的链霉亲和素亲和偶联，并在体积只减少125倍后使浓度升高为1.8×109±1.8×108cfu/ml的滴度(升高4200倍)，这似乎是迄今对PG13最有效的策略。此外，排除的上清液的滴度显示降低为6.4×104/ml±1.4×104/ml，表示与对照滴度相比80％以上排除。图10b显示FACS图，说明标记24小时后可用亲和素-FITC检测的表面修饰程度。关于该图的详述是，与24小时前用生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯处理并用亲和素-FITC染色的(BSE-Av-FITC)细胞相比，单独用DMSO处理并用亲和素-FITC染色的(DMSO+Av-FITC)对照细胞的荧光。甚至在培养24小时后，荧光有大于2log的改变。生物素化反应对包装细胞无毒性，被认为是针对赖氨酸侧链的NH2末端。以前悬浮细胞生物素化的经验提示，由于蛋白质更新(turnover)，表面修饰非常快速地内吞。因此，几乎没有生物素化蛋白质分泌到上清液中。包装细胞表面上的包膜蛋白可在芽殖过程中在与逆转录病毒gag和pol结合前生物素化。这样能从生物素化的包装细胞中分泌生物素标记的逆转录病毒。由于其它细胞的表面蛋白也可以作为逆转录病毒外壳上的生物素化衍生物，env蛋白可能不被生物素化。另外，包装细胞产生的蛋白质(后来可与逆转录病毒结合)也可能是生物素化的主要靶标。在逆转录病毒表面上估计有300个包膜分子，因而生物素过程的效率对于捕获无关紧要，因为生物素/链霉亲和素相互作用的强度太强，以致只有一个生物素与PMP接触即可足以捕获逆转录病毒。
有效的生物素琥珀酰亚胺酯/PMP介导的FLYRD18和A13捕获伴刀豆球蛋白A介导的FLYRD18和FLYA13捕获没有获得预期的成功。因此，发明者决定研究生物素SE捕获是否有效捕获这些包装细胞产生的逆转录病毒。图11显示测定生物素介导的FLYRD18(图11)和FLYA13(图11)磁性浓缩效率的实验结果。再次检测单独的载体和生物素修饰对起始滴度的影响，对于FLYRD18(图11)，对照滴度(4.6×104±8.7×103cfu/ml)与DMSO载体(4.7×104±1.2×104cfu/ml)或生物素修饰(5.4×104±3×103cfu/ml)没有差异。单独载体(DMSO)处理细胞在体积减少125倍后不能引起逆转录病毒浓缩，DMSO浓缩4.3×104±7×103cfu/ml。FLYRD18的生物素化导致在体积减少125倍后浓缩物的滴度为1×108±1.8×107cfu/ml，比起始物高2000倍，这是接近PG13的效率。也确定了本发明的第四方面也能有效浓缩FLYA13细胞。
对照和浓缩PG13产生的逆转录病毒的冻融稳定性为了独立进行所需的安全性测试，逆转录病毒制品必须预先制备，因此确定浓缩对于冷冻后传染性保持的意义如何至关重要。图12显示逆转录病毒浓缩物实际上比冷冻的对照上清液更加稳定。对照在第一次冻融后均丢失80％以上的滴度，在第二次冻融后丢失94％以上。对于浓缩物，在第一次融化后大多数活性丢失(可达60％)，但随后传染性基本不丢失。因此，PG13衍生的浓缩物能比纯净的上清液更有效地贮存(对于ConA和BS-IB4，-20℃下6周多以后)。如下文所述，浓缩物以加入3倍体积的10％DMSO、20％FCS所达到的7.5％DMSO的终浓度冷冻(因此考虑这一稀释度调节融化的浓缩物的滴度)。由于为了滴定浓缩物需要较大的稀释度，DMSO的影响不是问题，也能使用PMP磁性浓缩器在融化后进一步洗涤逆转录病毒制品。然而，对照上清液不适于DMSO存在下冷冻，因为甚至将融化的逆转录病毒稀释10倍仍将含有显著的DMSO污染。
PMP/逆转录病毒偶联物能用于感染的体外定位现在能生产有效的“传染性、顺磁性逆转录病毒载体颗粒”，然后能磁性吸引到希望的感染位置。图13显示体外磁性定位的一个例子，是对该方法的原理的证实。从磁片上切下的模型(d)，置于HeLa细胞亚铺满培养物之下，能吸引并保留逆转录病毒，主要感染存在磁体的区域。此处使用的特殊设计旨在显示这一导向不是搅动过程中使逆转录病毒载体在平皿中涡旋的流体动力学的结果。另外，该实验表明，在连续存在磁场的情况下能发生感染，逆转录病毒在培养中仍能被顺磁颗粒捕获。这种磁片尽管较弱，但在体外引导逆转录病毒感染中极其有效，然而有效的体内导向是一个三维问题，将需要更强的磁场。对于体内环境，在易接近的部位使用小的永磁体，而体外产生的电磁场能一次集中于一个特定部位。对于所有导向，未导向的部位的感染抑制不是主要问题，因此如上所述的逆转录病毒载体的可逆灭活是令人激动和值得称赞的进展(28)。可逆灭活的逆转录病毒载体局限于特异组织、器官和转移，以及随后感染的局部复活，可使体内导向进一步复杂化。
总之，链霉亲和素PMP技术结合正确选择配体能捕获PG13和FLY包装细胞产生的逆转录病毒。该研究只检测了三种包装细胞型和两种导向细胞系，因此每种靶细胞型的其它优化可能将进一步提高浓缩物的传染性，这可能是依赖于靶细胞型和逆转录病毒受体的优选捕获方法。例如，对于通过α-甘露糖修饰的受体进入的逆转录病毒，伴刀豆球蛋白A不是最佳选择(25-27)。PMP上多余的生物素结合能力也可用来偶联其它蛋白质，实现迄今只能通过配体(31-34)或者逆转录病毒包膜基因的单链Fv修饰(35-38)达到的这种导向。发明者意识到，配体与没有遗传修饰的传染性制剂偶联将使逆转录病毒导向有更大的灵活性，可能不需要假型(pseudotyping)(31，33，37)和靶细胞特异的包装细胞设计(32，34，35，38)。在不含其它配体的情况下，顺磁逆转录病毒载体也是向相同细胞背景内的少数细胞体内导向感染的一种有效策略。
优化逆转录病毒/PMP比，降低聚阳离子增强剂依赖性(39)，捕获当前的慢病毒载体构建体(40)的改进PMP/逆转录病毒技术，提高了体内逆转录病毒感染的可能性，用于PMP浓缩，并且通过磁场保留于或针对需要的部位。
材料与方法细胞系人骨髓悬液(K562)和HeLa附着上皮细胞在RPMI+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(均为Sigma，Poole，UK)中常规生长。悬浮细胞保持于1×105-1×106/ml，而HeLa细胞通过胰蛋白酶消化传代，并保持低于7×106/90mm组织培养皿。
PG13 GaLv假型包装细胞3(CRL-10686，获自ATCC，Rockville，MD，USA)在DMEM+10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素中常规培养。细胞保存于90mm组织培养皿中，通过胰蛋白酶消化传代，保持于5×105-7×106/90mm组织培养皿。
试剂链霉亲和素磁球顺磁颗粒，1mg/ml(5×108颗粒/ml)1μm直径的顺磁颗粒在PBS中4℃贮存。多克隆I兔抗小鼠纤连蛋白，10.8mg/ml于PBS中，4℃贮存(Biogenesis，Poole，UK，4470-4339)。标记的蛋白A-生物素(Sigma，Poole，UK，P-2165)从分泌蛋白A的金黄色葡萄球菌株培养基中纯化(2mg/ml，于pH8.0的PBS中，-20℃贮存)。生物素标记的琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(Sigma，Poole，UK，L0767)以1mg/ml在pH8.0的PBS中-20℃贮存。来自Bandeiraea Simplicifolia的BS-I生物素标记的同工凝集素B4(BS-IB4)以1mg/ml在pH8.0的PBS(Sigma，Poole，UK，L2140)中-20℃贮存。生物素酰胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma，Poole，UK，B2643)用DMSO重建为366mM并贮存于-20℃，自此称为BSE。亲和素-FITC(Sigma，Poole，UK，A-2901)贮存于-20℃，在pH8.0的PBS中重建为1mg/ml。嘌呤霉素(Sigma，Poole，UK，P-8833)过滤除菌，在-20℃下以5mg/ml贮存于水中。
生产细胞的产生和培养PG13包装细胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接种；4小时后，吸出培养基，更换为10ml过滤(0.45μM)的含4μg/mlpolybrene的GP+E-86上清液。这些磷酸钙转染的GP+E-86混合细胞群体产生赋予嘌呤霉素抗性的pBabe.puro载体。24小时后重复感染，细胞再培养48小时，在含5μg/ml嘌呤霉素的DMEM+10％FCS中筛选4周，冻存抗性细胞的混合群体。
FLYRD18和FLYA13包装细胞以7.5×105/90mm平皿的密度开始，过夜培养后吸出培养基，更换为10ml过滤(0.45μm)的含8μg/mlpolybrene的PG13.pBabe.puro。72小时后吸出培养基，更换为含5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。细胞再培养7天，此时所有对照培养物均死亡，冻存存活细胞的混合群体。
逆转录病毒的产生PG13生产细胞用胰蛋白酶消化，以1×106/90mm平皿的密度接种；72小时后更换培养基；24小时后吸出培养基，通过0.45μm滤器过滤，进一步处理。FLYRD18和FLYA13以2×106/90mm平皿的密度接种，48小时和72小时后肿出培养基，更换为新鲜培养基。再过24小时后，吸出含有可使逆转录病毒失能的培养基，通过0.45μm滤器过滤，进一步处理。
生物素标记的逆转录病毒的产生细胞的生物素化基本如上所述，具有对附着细胞的改进67，68。简言之，培养72小时后，完全吸出培养基，用含0.75mM CaCl2和0.48mMMgCl2的PBS(pH8.0)洗涤，更换为10ml新鲜稀释的生物素SE(500μM于PBS pH8.0+Ca2+、Mg2+中)。细胞在室温下温育30分钟，之后完全吸出试剂，更换为新鲜的生长培养基，细胞放回3℃下培养。再过3-4小时后，培养基再次更换为新鲜培养基，并放回继续培养18小时，之后吸出逆转录病毒上清液。在所有情况中，单独用载体(DMSO)标记的对照都平行处理。
免疫荧光生物素化的包装细胞培养过夜。收获逆转录病毒后，在凡尔生存在下通过轻轻移液从底层取出细胞，置于DMEM+10％FCS中。总共1×106个细胞在含或不含10μg/ml亲和素-FITC的100μl HBSS+1％FCS中标记。细胞在室温下温育，洗涤，通过流式细胞分析术分析。
顺磁颗粒的制备对于5ml逆转录病毒上清液，将2.5ml顺磁颗粒(PMP)(5×108/ml)置于15ml聚丙烯试管中，放到Dynal MPC-6磁性颗粒浓缩器中，吸出上清液，PMP重悬浮于1ml过滤除菌的PBS+0.1％BSA中，并转移到无菌1.5ml eppendorf管中。然后将PMP加到Dynal MPC-E磁性颗粒浓缩器中，吸出上清液，将PMP重悬浮于0.4ml过滤除菌的PBS+0.1％BSA中，加到MPC-E中，吸出上清液。
对于抗体偶联PMP重悬浮于50μl PBS+0.1％BSA和50μl2mg/ml蛋白A-生物素中。在室温下温育30分钟后，PMP利用MPC-E在PBS+0.1％BSA中洗涤三次，重悬浮于含5mg/ml多克隆Ig兔抗小鼠纤连蛋白的250ml PBS+0.1％BSA中。
对于凝集素偶联PMP重悬浮于100μl 1mg/ml生物素琥珀酰-伴刀豆球蛋白A或100μl 500μg/ml生物素标记的同工凝集素B4(BS-IB4)中。对于生物素琥珀酰亚胺酯浓缩和对照未偶联的PMPPMP重悬浮于100μl PBS+0.1％BSA中。
在室温下温育30分钟后(定期搅拌)，利用MPC-E在500μlPBS+0.1％BSA中洗涤所有PMP偶联物三次。最后一次洗涤后，将PMP重悬浮于希望体积的逆转录病毒上清液中。
PMP的制备和浓缩逆转录病毒复合物常规制备的1.25×109PMP重悬浮于无菌聚丙烯管中的5ml逆转录病毒上清液中，混合物在恒速搅拌下4℃温育(Stuart Scientific SRT1倾斜旋转混合器)。2.5小时后，将混合物加到Dynal MPC-6上，吸出上清液，将PMP重悬浮于1ml PBS+0.1％BSA或RPMI+0.1％FCS中(凝集素浓缩)。然后用MPC-E再洗涤PMP三次，PMP重悬浮于最小体积的RPMI+10％FCS中。堆积体积1.25×109PMP可重悬浮于20μl RPMI+10％FCS中，产生40μl的终体积(5ml40μl，125倍体积)，然后进一步处理。
cfu/ml滴度的测定计数K562细胞悬液，用含有4.4μg/ml polybrene的RPMI+10％FCS调节为4×105/ml。然后将细胞以1ml等份接种于24孔细胞培养板中，在37℃/5％CO2下温育1-3小时。逆转录病毒制品用RPMI+10％FCS 1∶10连续稀释，将100μl加入一式三份孔中充分混合。18-24小时后，0.9ml细胞与3.8ml RPMI+24％FCS+1.3mM丙酮酸钠混合，保持于37℃下，随后加入0.3ml高压灭菌的5％纯净琼脂(终浓度为0.3％)，保持于60℃。细胞然后接种于60mm组织培养皿中，使琼脂凝固后，置于37℃/5％下。再过48小时后，小心加入5ml RPMI+20％FCS+1mM丙酮酸钠(含有10μg/ml嘌呤霉素)，使软琼脂选择浓度为5μg/ml嘌呤霉素。平皿再放回培养2-3周，之后测量软琼脂集落数。cfu/ml浓度计算为每个平皿的集落数/孔乘以稀释倍数。在所有cfu/ml测定中进行倍数稀释，尽管大多数是没有价值，含有太少或太多的集落而无法精确计数(即多于300/60mm平皿)。
附着的HeLa细胞用胰蛋白酶消化，计数，并调节为1×105/ml(需要时用RPMI+10％FCS或DMEM+10％FCS)，然后以0.5ml等份接种于24孔细胞培养板中。温育18小时后(37℃/5％)，感染1-3小时前，加入另外0.5ml含polybrene的培养基，使终浓度为4.4μg/ml。
逆转录病毒在RPMI+10％FCS中进行1∶10连续稀释，向靶细胞中一式三份加入100μl等份的适当稀释液，并混合。感染48小时后，将培养基更换为含有5μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。每3-4天更换一次培养基，持续2周，之后吸出培养基，培养板用2ml考马斯蓝染液染色(5.35％wt/vol溶于45％甲醇∶10％乙酸)，用自来水洗涤，计数集落，测定滴度。
冻融逆转录病毒制品未浓缩的对照逆转录病毒以2-5ml等份置于-20℃下冷冻。通过加入3倍体积的标准冷冻混合物(10％DMSO，20％FCS，终DMSO浓度为7.5％)并置于-20℃下，冷冻浓缩的PMP捕获的逆转录病毒。尽可能快地融化逆转录病毒制品，取出一等份进行检测，剩余的放回-20℃下。
逆转录病毒感染的磁性增强HeLa细胞以2×106细胞/90mm平皿的密度接种，并在37℃下培养过夜。在感染之前，需要的磁性模型(从Bisiflex II片上切下)放置到(tap to)培养皿下面，培养基也调节为4μg/mlpolybrene，2-4小时后在5ml新鲜培养基中加入生物素化PG13产生的逆转录病毒载有的7.5×106磁性颗粒。然后在室温下搅拌(40圈/分钟)培养物30分钟(the Belly Dancer，Stovall Life Sciences Inc，Greenboro，NC，USA)，之后将培养物置于37℃。24小时后取出磁体，更换培养基，并将培养物放回37℃。总共感染48小时后，将培养基调节为5μg/ml嘌呤霉素，每日更换培养基后(保持药物筛选)，培养物用考马斯蓝染液(5.35％wt/vol溶于45％甲醇∶10％乙酸)染色(开始选择72小时后)。
参考文献1 Miller AD，Rosman GJ. Biotechniques 1989；8980-990.
2 Riviere I，Brose K，Mulligan RC.Proc.Natl.Acad. Sci.USA 1995 926733-6737.
3 Miller AD et al.J.Virol.1991；652220-2224.
4 Ory DS，Neugeboren BA，Mulligan RC.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996；9311400-11406.
5 Cosset F-L et al.J.Virol.1995；697430-7436.
6 Burns JC et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993；908033-8037.
7 Kozak SL，Kabat D.J.Virol.1990；643500-35088 Parente MK，Wolfe JH.Gene Therapy 1996；3756-760.
9 Kotani H et al.Hum.Gene Ther.1994；519-2810 Bunnell BA et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995；927739-7743.
11 Olsen JC，Sechelski J.Hum.Gene Ther.1995；61195-1202.
12 Manning JS，Hackett AJ，Darby-Jr NB.Appl.Microbiol.1971；221162-1163.
13 Toyoshima K，Vogt PK.Virology 1969；38414-426
14 Porter CD et al.J.Virol.1998；724832-4840.
15 Chuck AS，Clarke MF，Palson BO.Hum.Gene Ther.1996；71527-1534.
16 Hanenberg H et al.Nature Med.1996；2876-882.
17 Paul RW et al.Hum.Gene Ther.1993；4609-615.
18 Miller DL，Meikle PJ，Anson DS.Nucl.Acids Res.1996241576-1577.
19 Chu T-HT，Dornburg R.J.Virol.1997；71720-725.
20 Olsen JC，Johnson LG，Yankaskas JR.InRobbins P(ed).Gene Therapy Protocols.Humana PressNew Jersey，1997，pp153-16821 Morling FJ，Russell SJ.Gene Therapy 1995；2504-508.
22 LeDoux JM，Morgan JR，Snow RG，Yarmush ML.J.Virol.1996；706468-6473.
23 Russell SJ.InCollins MKL(ed).Methods in MolecularBiologyVol 8 Practical Molecular Virology.HumanaPressNew Jersey，1991，pp29-4824 Bowles NE et al.Hum.Gene Ther.1996；71735-1742.
25 Seppen J，Kimmel RJ，Osborne WRA.Biotechniques.1997；23788-790.
26 McNeish IA et al.Gene Therapy 1998；51061-1069.
27 Liu M-L，Winther BL，Kay MA.J.Virol.1996；702497-2502.
28 Palson B，Andreadis S.Exp.Haem.1997；2594-102.
29 Morgan JR et al.J.Virol.1995；696994-7000.
30 Gken J et al.(submitted for publication)31 Dardalhon V et al.Hum.Gene Therap.1999；105-1432 Signas C et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1989；86699-703.
33 Jonsson K et al.Eur.J.Biochem.1991；2021041-1048.
34 Shantz EM.PANSORBIN，Calbiochem1994.
35 Freeman GT et al.J.Immunol.1989；1432714-2722.
36 Spear GT et al.J.Immunol.1995；1554376-4381.
37 Balliet JW，Bates P.J.Virol.1998；72671-676.
38 Izumi M et al.Exp.Cell Res.1991；197229-23339 Markowitz D，Goff S，Bank A.Virology 1988；167400-406.
40 Miller AD，Buttimore C.Mol.Cell Biol.1986；62895-290241 Markowitz D，Goff S，Bank A.J.Virol.1988；621120-1124.
42 Kayman SC et al.J.Virol.1999；731802-1808.
43 Daley GQ，Baltimore D.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1988；859312-9316.
44 Vercellotti GM et al.Am.J.Path.1985；12013-21.
45 Jordan-Sciutto KL et al.Exp.Cell Res.1997；236527-536.
46 Dean DC，Newby RF，Bourgeois S.J.Cell Biol 1988；1062159-2170.
47 Gerin PA et al.Hum.Gene Therap.1999 101965-197448 Touhami M，Bourge J-F，Legrand C.Brit.J.Haem.1999；104706-714.
49 Bansal SC et al.Cancer 1978；421-18.
50 Cowan FM.Toxicol.Meth.1997；79-15.
51 Steele G，Ankerst J，Sjogren HO.Int.J.Cancer 1974；1483-92.
52 Fennelly DW et al.Cancer 1995；752099-2102.
53 Messerschmidt GL et al.Semin.Haem.1989；26(suppl1)19-24.
54 Engelman RW，Good RA，Day NK.Cancer Detect.Prev.1987；10435-444.
55 Snyder HW，Reed DE，Jones FR.Semin.Haem.1989；26(suppl 1)25-30.
56 Darling，D.，Hughes，C.Galea-Laun，J.Gken，J.Trayner，ID.，Kuiper，M and Farzaneh F.2000 Gene.Therapy (in press).
57 Takeuchi，Y.，Porter，C.D.，Strahan，K.M.Preece，A.F.，Gustafsson，K.Cosset，F-L.et al.Nature，1996，37985-88.
58 Larsen，R.D.，et al 1990，J.Biol.Chem，2657055-7061.
59 Chuck AS，Clarke MF，Palson BO.Hum.Gene Ther.1996；71527-1534.
60 Galili，U.and Swanson，K.1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.887401-7404.
61 Wood，et al Arch.Biochem.Biophys.1979，vol 198 pl62 Reeke G.N.Ann NY Acad Sci vol.234，369 197463 Animashshaun，T.et al 1993，Antivir.Che.Chemotherap.4145-15364 Gilbert，M.1993.J.Virol.Meth 421-1265 Hayakawa，T.et al 1998.J.Med.Virol.56327-33166 Cosset，F.L.et al 1995，J.Virol.697430-743667 Yu，H.et al 1998 Virology 243415-42268 Spies C.P.and Compans R.W.1993 J.Virol.676535-654权利要求
1.一种提高含病毒颗粒样品的病毒滴度的方法，该方法包括使样品接触能与病毒颗粒结合形成复合物的结合成员；并浓缩该复合物。
2.根据权利要求1的方法，其中通过离心浓缩所述复合物。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其进一步包括测定病毒滴度的步骤。
4.根据前述任一权利要求的方法，其中所述病毒颗粒是逆转录病毒颗粒。
5.根据前述任一权利要求的方法，其中所述结合成员是一种颗粒性稠密底物。
6.根据权利要求3的方法，其中这种颗粒性稠密底物是pansorbin。
7.根据权利要求1-4任一项的方法，其中该方法还包括加入能捕获该复合物的捕获剂。
8.根据权利要求7的方法，其中所述捕获剂是顺磁颗粒。
9.根据权利要求7或权利要求8的方法，其中结合成员是一种针对可与病毒颗粒结合的蛋白质的抗体，该抗体可与第一种偶联配偶体结合，该配偶体能偶联可与捕获剂结合的第二种偶联配偶体。
10.根据权利要求7或权利要求8的方法，其中结合成员是能与病毒颗粒表面上的糖基化蛋白质结合的凝集素，该凝集素可与第一种偶联配偶体结合，该配偶体能偶联可与捕获剂结合的第二种偶联配偶体。
11.根据权利要求10的方法，其中凝集素是同工凝集素B4或琥珀酰-伴刀豆球蛋白A。
12.根据权利要求9-11任一项的方法，其中偶联配偶体选自生物素/生物胞素-亲和素/链霉亲和素、受体-配体和抗体-抗原。
13.一种修饰病毒颗粒，以便于从含有这种修饰病毒颗粒的样品中捕获，以提高其滴度的方法，该方法包括在病毒包装细胞表面上添加偶联配偶体的步骤，使包装细胞产生的病毒颗粒在其表面上展示这种偶联配偶体。
14.根据权利要求13的方法，其中所述偶联配偶体是与包装细胞表面上的蛋白质共价偶联的生物素。
15.根据权利要求14的方法，其中利用琥珀酰亚胺酯将所述生物素与蛋白质共价偶联。
16.根据权利要求13-15任一项的方法，其进一步包括下列步骤使用捕获剂浓缩修饰的病毒颗粒，该捕获剂包含能与添加到病毒颗粒表面上的偶联配偶体偶联形成复合物的第二种偶联配偶体；和浓缩该复合物。
17.根据权利要求1-12和权利要求16任一项的方法，其中分离该复合物，用于制备医学治疗用药物。
18.一种复合物，其含有病毒颗粒和通过第一种和第二种偶联配偶体偶联在一起的顺磁颗粒，用于体内导向。
19.根据权利要求18的复合物在制备用于体内导向的药物中的应用。
20.一种将根据权利要求18的复合物导向人体或动物体内组织的方法，该方法包括对人体或动物体施用该复合物，和利用磁场将复合物吸引到组织的步骤。
21.根据权利要求20的方法，其中所述病毒是一种逆转录病毒。
22.根据权利要求20或权利要求21的方法，其中所述病毒含有用于在靶向组织中表达的外源核酸序列。
23.一种利用根据权利要求13-15任一项的方法生产的修饰病毒颗粒，用于导向组织，该修饰病毒颗粒还包含对该组织特异的抗体或抗体结合域，该抗体或抗体结合域通过病毒颗粒表面的偶联配偶体与颗粒偶联。
24.根据权利要求23的修饰的病毒颗粒，它是一种逆转录病毒颗粒。
25.一种从样品中分离病毒的方法，该方法包括使样品接触一种能特异结合该病毒的结合成员，使该病毒和结合成员形成复合物；使该复合物接触一种能捕获该复合物的捕获剂；和从样品中分离该复合物和捕获剂。
26.根据权利要求25的方法，其中该结合成员与第一种偶联配偶体结合，该配偶体能偶联与捕获剂结合的第二种偶联配偶体。
27.根据权利要求26的方法，其中偶联配偶体是生物素和链霉亲和素。
28.根据权利要求26或权利要求27的方法，其中结合成员是一种抗体，捕获剂是一种顺磁颗粒。
29.根据权利要求28的方法，其中利用磁场从样品中分离复合物和捕获剂。
30.根据权利要求26或权利要求27的方法，其中捕获剂位于一种固体载体上，样品在该载体上通过，使复合物和捕获剂在该固体载体上分离。
31.根据权利要求25-27任一项的方法，其中结合成员是一种凝集素。
32.根据权利要求25-31任一项的方法，其中样品是血液、尿、血清或精液。
33.根据权利要求25-32任一项的方法，其中病毒是HIV。
34.一种用于实施根据权利要求1-12任一项方法的试剂盒，包含(i)能与病毒结合形成复合物的结合成员；和任选地(ii)能通过偶联配偶体捕获该复合物的捕获剂。
全文摘要
本发明提供提高样品中病毒滴度的方法。该方法使用特异结合成员(如凝集素和抗体)结合病毒颗粒，使它们能够浓缩。本发明还提供从样品(例如血液)中分离病毒颗粒的方法。也提供利用抗体或顺磁颗粒将病毒颗粒导向特定组织的材料与方法。
文档编号C12N7/00GK1516733SQ01809108
公开日2004年7月28日 申请日期2001年3月22日 优先权日2000年4月18日
发明者D·达灵, F·法赞尼, C·P·休吉斯, D 达灵, 休吉斯, 弈 申请人:癌症研究技术有限公司