分析核酸分子长度的方法

专利名称：分析核酸分子长度的方法
技术领域：
本发明涉及测定核酸序列长度和可任选地测定解链温度的方法，并将其应用于例如确定所述序列中GC含量百分比，及其应用于该方法的设备。本发明的方法可以应用于多种诊断，分析或研究中。
出于多种原因，人们需要了解DNA序列的长度。在遗传诊断或分析中例如，由于插入，缺失，截短或复制所引起的遗传缺陷将影响特定生物基因组中特定基因总的长度。
在研究方面，经常要进行遗传连锁分析以确定基因组中特定基因之间的关系。在这种情况下，特定基因之间的距离可能对确定特定基因的功能和性质有用。
已经进行了许多有关端粒的研究，所谓的端粒是位于基因组末端的DNA，每次细胞复制都使得端粒变短，故其与成熟过程相关。因此特定的样品中端粒DNA的长度可以指示从中获取样品的宿主的年龄。
可以改变基因组中特定区域的DNA总的长度的其它因素包括，转座子的存在和病毒感染，即病毒将自身整合到宿主的基因组中。因此检测这些实体的存在对诊断和遗传分析是有用的。微卫星区域的长度形成了目前应用于法医学中的DNA指纹技术的基础。在重组DNA技术中，克隆实验经常需要使核酸序列在宿主生物如细菌，或细胞中表达之前先整合到其他序列，如载体或质粒中。成功的克隆通常通过构建体中所包括的筛选标记，例如抗生素抗性，进行判断，所述的筛选标记提供了一种鉴定被成功转化的宿主的方法。
偶尔，克隆过程也会有错误，出现串联，即所包含的序列出现多于一个拷贝(一种通过产生平末端构建体的限制性内切酶形成克隆时所出现的特定问题)。另外，可能出现同源重组导致部分或全部靶序列的缺失。
此外，当使用RT-PCR时，供选择的mRNA剪接变异体的出现可以改变整个扩增序列的长度。
目前一般是用凝胶电泳进行核酸长度分析，可任选地在扩增后从样品中获得DNA，在凝胶上进行电泳。这一过程需要花费一定的时间，而且需将样品从反应容器中去除，这存在引起污染或交叉污染的危险，使在一次所检测的不止是单一的样品。
核酸扩增反应如聚合酶链式反应是本领域所熟知的。PCR是用于产生大量特定DNA序列的过程，其是基于DNA的碱基配对和互补DNA链的精确复制的特性。典型的PCR包括三个基本步骤的循环过程。
变性将包含PCR试剂的混合物(包括待扩增的DNA，单独的核苷酸碱基(A，T，G，C)，合适的引物和聚合酶)升温到预定温度使靶DNA解链。
退火使上述混合物的温度降低到另一个预定温度使所述引物定位到上述DNA链中与该引物互补的序列处，并与之结合。
延伸再次将混合物升温到下一预定温度。所述的聚合酶(作为催化剂)将单独的核苷酸碱基加到引物的末端以形成与靶DNA序列互补的新链，两条链处于结合状态。
这种过程广泛应用于诊断，法医和研究之中。
本申请人已发现利用这种方法迅速地确定或检测核酸序列中某区域长度的方法，需要时也用于鉴定所述序列中的％GC。
依照本发明，提供一种分析核酸中特定区域长度的方法，所述方法包括a)将所述核酸样品进行多重扩增反应使上述区域得以扩增，其中每一个所述反应中延伸期的时间是不同的；b)监测所述的扩增反应过程；c)确定在每一反应混合物中扩增延伸期完全进行所需的最小时间，并将其与进行延伸的序列长度相联系。
此处所用的“完全进行”是指在每一循环中进行扩增反应以产生相应于全部所述区域的扩增子。一般，所述区域由正向和反向引物限定并包括引物，在“完全”扩增反应中获得全长扩增产物。
在本发明的方法中，任何方法都可以用于监测扩增过程。
监测扩增反应的技术和实验是本领域所公知的。许多这种实验，如聚合酶链式反应(PCR)中应用荧光检测技术。这些技术包括特异探针链和用于一些二代PCR热循环装置中的一般DNA间插(intercalator)技术。
一般的荧光PCR方法使用DNA间插(intercalating)染色技术，其与双链DNA相结合时表现出增强的荧光。由于扩增过程中大量DNA浓度升高所引起的荧光增强可用于监测反应过程和确定起始的靶分子的拷贝数。
这些一般荧光PCR方法监测大量核酸浓度升高，没有任何时间延滞。可以在每一反应的同一时间点进行单一荧光读数。端点熔解曲线分析可用于区别扩增子和人为假象，及用于辨别扩增子。在用琼脂糖凝胶电泳不可见的浓度下，可以观察到产物的峰值。
荧光PCR链特异性方法用附加的核酸反应组分监测扩增反应过程。这些方法可以用荧光能量转移(FET)作为检测的基础。用荧光分子标记一个或多个探针，其中一个可以作为能量的供体，另一个是能量受体分子。它们有时候分别作为报告分子和淬灭分子。所述的供体分子由特定波长的光所激发，对此其通常表现出某种荧光发射波长。所述的受体分子在这一发射波长下被激发，通过多种依赖距离的能量转移机制接受由供体分子所发射的能量。可能出现的荧光能量转移的一个特殊的例子是荧光共振能量转移或“FRET”。一般当受体分子与供体非常接近(如在同一个或临近的分子上)时，受体分子接受由供体分子所发射的能量。FET或FRET检测的基础是检测供体发射波长的变化。当受体分子也是荧光分子时，也可以检测受体发射波长。
有两种常用的FET或FRET探针类型，它们利用核酸探针的水解使供体和受体相分离，利用杂交改变供体和受体分子的空间联系。
一个监测扩增反应过程的特定实验是如美国专利5,538,848中所述的TaqManTM实验。
与TaqManTM探针一样，杂交探针是可商购的。它们由用供体或受体分子标记的DNA寡核苷酸组成。所述的探针设计成与PCR产物的一条链中的特定区域相结合。在PCR引物与这一条链退火后，Taq酶通过5′到3′聚合酶活性使该DNA链延伸。Taq酶也表现5′到3′外切酶活性。通过磷酸化作用将TaqManTM探针的3′端保护起来，以防止它们起始Taq延伸。如果TaqManTM探针与所述产物链杂交，延伸的Taq分子也可以水解该探针，将供体由受体上释放出来，以作为检测的基础。这种情况下的信号是累积的，游离的供体和受体分子的浓度随每一扩增反应循环而升高。但一般来说，在本发明的上下文中，依赖于水解的杂交方法如TAQMANTM实验不如那些利用杂交现象的实验优选。这是由于水解过程相对缓慢。因此，在确定延伸期是否已经进行完全了的时候，需要确定已估计到了由探针水解所引起的延迟。
杂交探针可有多种形式。分子标志(molecular beacons)是含有互补的5′和3′序列的寡核苷酸，其可形成发夹环。当发夹结构形成时末端的荧光标记处于非常接近的位置以使FRET发生。当分子标志(molecularbeacons)与互补序列杂交后，所述的荧光标记相分离，因此不发生FRET，由此构成了检测的基础。
也可以使用标记的寡核苷酸对。这些杂合物在PCR产物链上靠得很近，从而使供体和受体分子靠近，因此可以出现FRET。增强的FRET是检测的基础。这种类型的变异体包括利用标记的扩增引物与单一的临近探针。
在国际专利申请号为PCT/GB98/03560中描述了利用单一标记的探针与间插(intercalating)染色相结合的实验。
国际专利申请号为PCT/GB99/00504中描述了检测是否存在适合于对样品中靶序列进行定量的特定核苷酸序列的方法。在这一实验中，用一组核苷酸进行扩增反应，其中至少有一个核苷酸是用荧光标记的。这样扩增产物便具有整合在其中的荧光标记。所述反应在能与扩增产物杂交的探针存在下进行，且其包括能从荧光标记的核苷酸吸收荧光，或对所述的荧光标记核苷酸提供荧光能量的反应分子。上述反应可以通过测定所述样品中的荧光进行监测，样品中的荧光在反应过程中随着与探针杂交的产物的形成而发生变化，并引起它们之间的FET或FRET相互作用。
利用这些技术，不仅可以直接检测样品中是否存在特定的靶序列(因为发生了扩增)，还可以适当地利用所得的数据进行定量或确定扩增是否已进行完全。具体说来，用荧光对时间或循环数作图一般产生乙状图峰，其在扩增过程中样品中DNA的量增长时急剧上升，然后在扩增达到饱和后呈现稳定水平。
在扩增反应的扩增期中聚合酶的活性是以“持续合成能力”为特性的。这与每秒掺入到产物中的碱基数相关。一般在延伸温度下，扩增反应混合物控制超过合成全部靶序列，即由引物所定义的区域，所需的最小时间。
通过进行依照本发明的多重反应，使延伸期得以进行的时间最终降低到产生全部序列所需的最短时间。
这将在相当大的程度上抑制扩增反应。不完全的扩增子产物的一条链将不再与扩增引物之一结合，因此在下一循环中不能再进行延伸。另外，通过这种方式产生的扩增子产物的长度将缩短，因此，将不能掺入那么多用于监测反应过程的标记物，如间插染料(intercalating dye)。当应用探针监测反应过程时，它们不能与短扩增子结合因而影响所产生的信号。
如果监测每一个反应，可以很快弄清在哪个时间反应的延伸期不够长。具体说来，所述的扩增不以合适的速率进行。如果靶物质的起始浓度或拷贝数是已知的，这就可以完全确定，但利用本发明的方法可通过与延伸期的时间足以产生全长产物的扩增相比较即可简单地确定哪个时间反应的延伸期不够长。
另外，由不完全延伸步骤所产生的短产物本身可以作为下面反应的引物。这一反应的效率比用短引物进行扩增的反应的效率低。通常依照下述方程进行PCR拷贝数检测Nc＝N(1+E)C其中N＝起始拷贝数/浓度C＝循环数E＝反应效率E＝100％＝(e0.6931)所以，用短产物作为二级引物的扩增反应表现复合双相动力学。通过连续监测延伸期的荧光，下述情况将立即变得很明显，即在反应的延伸期信号的正常增长，反应进行(参见下文中的图5)被扰乱，反应继续进行，以及产生了更多可以引导下面反应进行的短产物。
然后这将通过与在一定反应温度下应用的聚合酶活性相关联，从而与所研究的序列长度相联系。在扩增反应，如PCR的常规温度下在小于10秒钟的时间内典型的聚合酶可以掺入约500个碱基对。
合适的扩增反应包括聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，但特别是包括PCR反应。
在本发明的方法中适宜同时进行多重扩增反应。
到目前为止，如果每一容器需要不同的时间，还不可能同时进行多个不同的扩增反应。这是因为传统的实现热循环的程序加热器只能是利用相同的时间分布在同一时间对所有的多重反应孔进行加热。程序加热器需要对所有的孔加热到相似的温度。
但是，在本发明的特定优选实施方案中，用如WO98/24548中所描述并请求保护的装置可以实现扩增反应的多重性。
这种类型的装置利用导电聚合物对反应孔进行加热。导电聚合物是本领域已知的，并可以从Caliente Systems Inc.of Newark，USA获得。如美国专利5106540和美国专利5106538中公开了这种聚合物的其它实例。合适的导电聚合物可提供高达300℃的温度，因此非常适合应用于典型的温度范围在30℃到100℃的PCR反应中。
使电流通过这些聚合物可以很快将其加热。加热的速率依赖于这些所述聚合物的确切性质、聚合物的尺寸和所用的电流量。优选地，所述聚合物具有高电阻率，例如高于1000Ohm.cm-1。通过控制经过聚合物的电流量可迅速地控制聚合物的温度，使其可在所需时间内控制在所需的温度下。而且，例如在电子控制器的控制下通过递送合适的电流，在校准后也易于控制温度间的转换速率。
而且，由于所述聚合物具有低热质量也可以确保迅速冷却。
另外，与应用程序加热器相比，在反应容器中用聚合物作为加热元件可以使所述装置做成更紧凑的形式。这对于在野外条件，例如在户外，在河流上，在工厂甚至小车间进行化学反应是有用的。
反应容器可以采用盛试剂的容器，如玻璃，塑料或硅容器并在靠近所述容器处安置导电聚合物。在所述容器的一个实施方案中，所述的聚合物作为与所述反应容器在热接触中环绕适配的外鞘。所述的外鞘可以制成与反应容器紧密配合的具有一定形状的罩，也可以制成一条可以缠绕在反应容器周围并使其稳固的膜。
上述聚合物外鞘的安置是指使外鞘和反应容器之间可以获得紧密的热交换。这保证了所述容器可以很快达到所需温度，而没有由于通常加热器与容器之间的空气层所引起的延滞时间。而且可以使聚合物外鞘适合于用原先已存在容器的装置。具体说来，一条易变形的聚合物膜可缠绕在不同大小和形状的反应容器外。
应用外鞘有利于穿孔或形成某种网状形式。这可以提高聚合物的弹性，并且在聚合物本身不用于冷却时，使冷却介质更容易进入。
在另一实施方式中，所述的聚合物作为反应容器整体部分。所述的反应容器可由聚合物通过挤压，浇注成型或类似的技术形成。可任选地，所述的反应容器可以用复合材料制造，一层导电聚合物可以插入在制造所述容器所用的材料层中间，或者用上述聚合物包被所述容器的内表面或外表面，或者其中所述的容器基本上由用薄层状的适合于PCR的材料包被的聚合物制成。这样的容器可以用本领域已知的薄层和/或沉积如化学或电化学沉积技术生产。
包含聚合物作为整体部分的容器可以提供非常紧凑的结构。
在本发明中需要几种反应容器用于一定系列的反应，这些反应容器可以形成一个阵列。
通过调整对应用于容器的电流每一个或每一组反应容器有自己的加热/冷却/时间分布。这对应用聚合物的反应容器提供了一个优于固体程序加热器或紊乱空气加热器的重要的有益特征，即对单独的容器可以根据它们各自的热分布进行相互独立控制。这意味着虽然每一实验需要不同的操作条件，但可以用相对小的设备同时进行多重PCR实验。
这种安排特别优选地应用于本发明的方法中，因为虽然每种情况下每一容器在延伸温度下所控制的时间不同，但可以同时进行多重扩增反应。
在应用于本发明特别合适的设备中，所述的聚合物本身，例如通过注射成型形成孔，所述的孔整体构成一个盘。每一个孔附带一个电极，优选地设计成甚至可以对该孔进行加热。具体地说，所述的电极与每孔的底部区域相连。聚合物的厚度适合于尽可能的低，与结构上的刚性和完整性相一致。这可降低加热聚合物所花费的时间。
与每孔相关的电极可以与单独的电源相连，或与一组孔相连的电极可以与不同的，独立控制的电源相连。这种安排由于每个或每组孔有自己的加热元件，使需要不同记时温度阶段的不同反应同时进行。而且可以迅速地进行循环反应。
盘中可以包含任意数量的孔，但为与常规实践相一致，一个盘中可以设置96或384个孔。
当依照本发明使用这种设备时，每一扩增反应在一种多孔容器的一个孔中进行，通过向包含所述孔或安排来加热所述孔的导电聚合物通电对每孔加热。
合适的控制工具为电子仪表化操作，可使多种反应自动进行。
本发明的方法可以与应用多重扩增反应的其他实验方法结合使用。
例如，反应中使多种双螺旋形成和去稳定的温度高度依赖于序列中有关的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的含量。上述碱基间所形成的键比腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)之间形成的键强。因此，特定的双螺旋去稳定或“解链”的温度高度依赖于所述序列中的GC含量。而且，某生物体基因组中GC含量百分比是确定生物，如细菌特别是在属的水平亲缘关系的公认的分类学标志。
通过确定特定双链核酸的解链温度和长度即可计算出其GC百分含量。如上所述确定解链温度可以和确定长度同时进行。
为做到这一点，需使用合适的标记系统，该系统允许检测双螺旋在反应混合物中形成和去稳定的点，标记方法适当地在反应混合物中提供。所述的标记优选可指示所述双螺旋形成和去稳定的可见的标记，如上述的荧光标记。这样可以如本发明所提供的在应用合适的标记物的同时进行实验。为能同时收集两组数据所需要做的就是在扩增反应过程中监测由标记物发出的信号，反应温度，以及处理数据以便获得所有需要的信息。
在这种类型的结合实验中，用间插染料(intercalating dye)或杂交探针作为探针可以可见的方式选择双螺旋去稳定的点，因此它们均优于水解探针。
特别优选的标记工具是间插染料(intercalating dye)，如SYBRGoldTM或SYBRGreenTM或溴化乙锭。当在扩增反应中形成双螺旋时，染料结合在两条链之间发出增强的信号。这样当在反应混合物中形成双螺旋时信号增强，当双螺旋去稳定时信号降低。
通过监测反应容器中的温度和由染料发出的信号，即可确定双螺旋形成或去稳定的温度。这与反应中所扩增的特定序列的GC百分含量相关。
另外，若一部分序列是已知的，则可以如上所述使用荧光能量转移(FET)作为检测的基础。具体说来在这种情况下，所述的标记适合于包含在特定温度下与靶序列相结合的标记杂交探针上提供的供体或受体分子之一。其它的可以包括上述的间插染料(intercalating dye)。当探针与靶链相连接时，使间插染料(intercalating dye)与探针很接近发生FET。结果，记录下从供体和/或受体分子发出的荧光的改变，当探针从靶序列″解链″时情况相反。利用单一标记的探针和间插染料(intercalating dye)的系统在国际专利申请号PCT/GB 98/03560中已有描述并提出了相关权利要求。
另外，如国际专利申请号PCT/GB99/00504中所描述的，标记工具的供体或受体组分之一可以包含在用于扩增反应的核苷酸中。
杂交探针如双重标记的探针或″蝎(Scorpions)″或者一些分子标记也适合于长度/解链温度相结合的实验分析方法。
在特定的温度下特定探针与特定的靶序列相结合。这样在不同探针存在下通过进行一系列的扩增反应，测定这些探针与靶序列结合或解链的温度，将提供靶序列的样品中是否存在靶序列的信息。
可以应用于特定扩增反应系统的特定类型的探针系统取决于样品的性质、任何保守或靶序列的长度等等。然而在大多数的应用中，由于间插染料(intercalating dye)标记的应用提供了一种用于分析确定扩增子杂交和解链实验的简便且成本合算的方法，因此优选使用间插染料(intercalating dye)。
具体说来，扩增产物去稳定时产生信号是一种优选的测定，因为这提供了更清晰的信号。
需要时核酸样品可以用于多重不同的扩增反应。
在此处，所表达的″不同的扩增反应″是指扩增存在于特定样品中不同的序列或序列的不同部分。一般来说，这就意味这在每一反应中使用不同的扩增引物。所述的扩增引物经过适当地设计以扩增出已知在获取该样品的已知物种中保守的序列，对许多物种，如正进行分类学实验的细菌，真菌或植物。
结果，现在可以同时确定一个样品中多种核酸区域的长度和％GC含量。
这一手段在DNA绘图和分级分类中特别有用。
上述的设备提供了一种实施任何所述的结合实验的理想载体，不仅可以控制延伸时间，还可以调节整体的温度分布以保证在每一或每组孔中进行不同的扩增。控制方法适合于用自动控制方法，如利用电子仪器。通过使用与所述聚合物相连的可编程电子电路控制器可以用该设备预编定义加热方案，如需建立的整体预定时间间隔和闭锁时间的定义数量的预定温度阶段循环数，包括用同一设备在同一时间应用不同的温度和不同的时间分布。
控制方法包括温度监测设备，如温差电偶，其监测反应容器的温度并将上述信息反馈给控制系统以便所需的加热和/或冷却方案得以实施并得到证实。
另外，可以直接通过其电阻系数监测聚合物的温度，例如将聚合物加热元件作为在惠斯顿电桥电路排列的电阻进行布置。这避免了使用其它温度测量仪器如温差电偶。
可任选地，所述的设备可以进一步包括人工冷却手段，如一个或多个风扇。另外，也可以有用于检测双螺旋形成或去稳定的荧光检测设备如光度计。它们适合于安置在与孔很接近的位置以便检测其中的试剂所显示的信号。
在使用中，对含有样品的孔进行检测适合于在反应容器或盘的一个区域中进行，盛有用作参照的已知样品的孔设置在所述容器的不同区域。这样，所做的比较更直接也更迅速。
反应孔中的其它组分可以包括进行扩增反应所需的试剂。这些在本领域是已知的，可以包括扩增引物，核苷酸，缓冲液以及上述的标记物。
上述的方法对分级分类和物种鉴定特别有用。从生物体中抽提核酸，特别是DNA置于一系列的检测孔中。设定扩增反应条件和所用引物，以使得在每一孔中如果有已知的对于特定物种具有特异性的序列，或在几种生物体中保守的序列存在即可被扩增。依照上述若获得了有关所述序列长度和％GC的信息即可迅速进行分级分类。
类似地，在法医和遗传分析中，将由犯罪现场或样品中获得的核酸样品与由嫌疑犯或认为与主题相关的样品相比较。通过确定足够多的不同核酸序列的长度和/或％GC含量，即可确定是否样品核苷酸是来自相同的来源或与相比较的核苷酸相关。
本发明通过实施例并结合参考附图进行详细阐述，其中；

图1是用于本发明方法中的设备的略图；图2表示用本发明的方法所得结果的类型；图3表示对于给定序列长度，解链温度和％GC含量之间的比例；图4表示对一定范围的产物的解链温度对长度测量值图；和图5表示当扩增反应完全进行时，连续监测某一扩增反应的结果；在图1的设备中，在含有导电聚合物的盘(2)中有许多孔(1)，所述的含有导电聚合物的盘是通过例如注射，浇铸形成以包含所需数量的孔。每孔配有一个电极(3)，所述电极通过电流用预编的热循环对孔中的物质进行加热。所述孔中的循环手电子仪器控制(未示出)。
所述的电子仪器用于控制每一扩增反应处于延伸期的温度的时间。
可任选地，在用解链温度实验分析样品中％GC含量的同时，在一些孔中也可以用不同的引物序列进行不同的扩增反应。这样做时，优选设计盘(2)中的区域(4)作为样品区，分隔的区域作为比较区(5)。在样品区(4)和比较区(5)的孔中使用类似的扩增反应条件和引物。
在样品区(4)的每个孔中放置核酸样品，同时已知来源或序列的一个或多个单独置于比较区(5)。
如上所述将用于扩增反应的扩增引物，核苷酸，缓冲液或其它所需试剂与标记物，特别是间插染料(intercalating dye)一起加到反应孔中。
以可控制的方式对每一反应容器通电，使其以不同的延伸时间通过热循环进行扩增。监测每孔的发光以检测扩增反应过程，以确定所用的延伸时间是否可使扩增反应进行得足够长。
另外，可选择地，也可以收集与所形成的双螺旋解链温度相关的数据。
如果如图2所示将所述结果用时间对发光作图，则所述样品的扩增反应将绘制成乙状曲线，由于扩增反应正常进行且出现指数扩增，因此，其中许多(A，B)图形大体类似。但是，当延伸时间不足够长时(D)，仅呈现由原始模板的线性增长。对非典型的例子(C)可观察到扩增反应曲线图的显著降低。这是由于此时已成功地形成了一些产物，而其他还太短。这一时间可以用于计算序列长度。
如果同时进行解链实验，由于使用了不同的扩增反应，相应于在核酸样品中存在的不同序列的解链温度可以形成一系列的解链温度对荧光的曲线。正如上述所讨论的，解链温度是序列长度和GC含量的函数。因此结合图2的结果，可以确定序列的绝对GC含量。这是由于对于给定的序列长度在解链温度和％GC含量直接存在直接的比例关系(图3)。
这些结果可绘制成所述核酸样品结合的长度/解链温度曲线图，由此可推导出(在分类学上重要的)％GC含量。图4示出这种比较图的例子。由于序列长度与最小延伸时间直接成比例，用延伸时间结果作为x轴也可以获得类似的图形。
结果显然在区域(i)的结果是由具有相对高的％GC的短产物产生的，而区域(ii)中的结果是由低％GC的短产物衍生的。区域(iii)的结果是由长度相对长％GC高的产物衍生的，而(iv)的结果是由长度相对长而％GC低的产物衍生的。
当使用例如间插染料(intercalating dye)进行标记或作为信号系统的元件对扩增反应进行监测时，可以清楚地检测到反应管中双螺旋数量的改变。当双螺旋数量增长时，荧光强度也增长。如果对扩增反应如PCR的全过程进行连续地荧光监测，可以出现如图5a所示的特征图形。在反应的退火期，由于反应混合物中存在大量的双螺旋物质，所出现的荧光呈现出尖峰(i)。由于双螺旋去稳定和间插染料(intercalating dye)的释放，上述尖峰在解链期显著下降(ii)，但在延伸期双链扩增子增多，其又逐渐升高。在高效扩增反应中延伸期动力学相对简单，因此这一时期的检测曲线大致是线状(iii)。
但是对于不完全的反应，其中延伸期太短不足以制备全长的扩增子，不完全的产物开始作为随后循环中的引物。这种反应效率低于使用引物的反应。
结果荧光曲线的区域(iii)在反应过程中将发生形状和/或梯度变化。
这一信号作为哪一反应没有进行完全的可选择的或证实性的检测方式，也可以由此确定小于最佳反应时间。
权利要求
1.一种分析核酸中特定区域长度的方法，所述方法包括a)将所述核酸样品进行多重扩增反应使上述区域得以扩增，其中每一个所述反应中延伸期的时间是不同的；b)监测所述的扩增反应过程；c)确定在每一反应混合物中扩增延伸期完全进行所需的最小时间，并将其与进行延伸的序列长度相联系。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的扩增反应包含聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述的扩增反应是PCR反应。
4.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中，所述多重扩增反应是同时进行的。
5.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中，每一扩增反应在多孔容器的一个孔中进行，通过对包含所述孔或能够对所述的孔进行加热的导电聚合物通电流而对每个孔进行加热。
6.如权利要求6所述的方法，其中，每孔中的扩增反应中的延伸期时间是独立控制的。
7.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中，用反应中存在的荧光标记工具监测扩增反应进程。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述的标记工具包含间插染料。
9.如权利要求7所述的方法，其中，所述的标记工具包含标记探针。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的标记探针是杂交探针。
11.如权利要求9所述的方法，其中，所述的探针是水解探针。
12.如前述任何一项权利要求所述的方法，其中，在步骤(b)中对延伸期的进程实行连续监测。
13.如前述任何一项权利要求所述的方法，用于由多联体的存在筛选由重组DNA技术所得的克隆。
14.如权利要求1-13中任意一项中所述的方法，用于在遗传缺陷或病毒感染的诊断或DNA指纹鉴定。
15.如权利要求1-13中任意一项中所述的方法，用于连锁分析。
16.如权利要求1-13中任意一项中所述的方法，用于测定端粒长度以进行年龄分析。
17.如前述任意一项权利要求所述的方法，其中，记录所述样品中特定的反应产物形成双螺旋和双螺旋形式去稳定的温度，将这一信息与对序列长度的确定相结合用于计算序列的％GC含量。
18.应用于应用前述任何一项权利要求的方法的设备。
19.如权利要求17所述的设备，其包含大量的可通过导电聚合物方式加热的反应孔，和用于控制施加于聚合物的电流以单独加热每一孔或每组孔的控制工具，所述的控制工具被设置成可以改变不同的孔处于扩增反应中延伸温度的时间。
20.如权利要求19所述的设备，其中，所述的控制工具被设置成可以改变每一孔或每组孔中所进行的扩增反应各阶段的温度。
全文摘要
提供一种分析核酸中特定区域长度的方法，所述方法包括a)将所述核酸样品进行多重扩增反应使上述区域得以扩增，其中每一个所述反应中延伸期的时间是不同的；b)监测所述的扩增反应过程；c)确定在每一反应混合物中扩增延伸期完全发生所需的最小时间，并将其与进行延伸的序列长度相联系。将上述方法与解链温度实验相结合可用于确定序列中的GC百分含量。这种类型的长度分析可以用于诊断或实验或检测多联体存在的重组DNA技术，以及分级分类和法医中。也描述并请求保护该方法所用的设备。
文档编号C12Q1/68GK1427895SQ0180915
公开日2003年7月2日 申请日期2001年3月6日 优先权日2000年3月7日
发明者M·A·李 申请人:英国国防部