专利名称：生化需氧量生物传感微生物固定化膜的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于生化需氧量微生物传感器传感探头中的微生物固定化膜。
(2)背景技术生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand，BOD)作为国际上最常用、最重要的水质有机污染指标和监测参数之一，其传统测定方法一五日生化需氧量(BOD5)标准稀释法，仍是目前国内外比较普遍采用的分析检测方法，但该标准方法需要5天分析周期，操作过程繁琐，因而给污水处理及环境监测带来了许多不便。在环境分析高度发展的今天，一种被称之为BOD微生物传感器的仪器逐渐发展起来，其原理基于微生物对有机物的耗氧代谢，测定BOD只涉及到初始氧化速率，因而可在10～15min内完成一个样品的测定，大大缩短了测定所需的时间。
BOD微生物传感器的传感探头主要由用于检测溶解氧变化的氧传感探头和固定在氧探头表面的微生物固定化膜组成。微生物固定化膜的制备是BOD微生物传感器研究的关键技术之一，微生物的固定化效果直接影响到BOD测定的灵敏度、稳定性和使用寿命。一种好的微生物固定方法必需满足简单、快速、固定的微生物不发生流失且能长期保持其生物活性。目前国内外报道的最常见的BOD微生物传感膜的固定方法为采用商品化微孔膜的物理夹层包裹法，如聚四氟乙烯膜(Liu et a1.Biosensors & Bioelectronics 2000，14883～893；Kim et a1.Biosensors & Bioelectronics 1999，141～7；Tammeveski et al.Sensorsand Actuators B，1998，4721～29；张先恩等，环境科学学报，1986，2184～192)，醋酸纤维素膜(Yoshida et al.Journal of Biotechnology 2001，88269～275；魏恩棋等，城市环境与城市生态，1998，446～49；硝酸纤维素膜(Chee et al.Analytica ChimicaActa，1999，379185～191；Chee et al.Analytica Chimica Acta，1999，39465～71；Cheeet al.Biosensors & Bioelectronics，2001，15371～376)，聚碳酸酯纤维膜(Tan etal.Sensors and Actuators B，1997，4065～70；Tan et al.Sensors and Actuators B，1999，54252～260)等，该方法虽然操作简单，但膜的稳定性较差，菌种易于流失，使用寿命较短；另外，以海藻酸钙凝胶包埋的菌体(Sohn et al.Analytica ChimicaActa，1995，313221～227；张悦等，海洋环境科学，2001，151～54)在磷酸盐缓冲空白测试中会逐渐发生溶解流失，同时不耐酸碱，不耐渗透压，具有逐渐吸水胀大的现象；采用化学健合的方法如紫外活化交联树脂键合(Yang et al.Appl Microbiol Biotechnol，1996，4610～14)、戊二醛-牛血清蛋白交联(刘宝红等，环境科学，1994，68～11)等制备微生物膜也见报道，但这些方法固定微生物较复杂和费时，有时由于被固定的微生物与基质之间较强的化学键合作用使被固定微生物的活性降低。因此，探索微生物的有效包埋方法，制备响应灵敏、稳定和活性保持高的BOD生物传感微生物固定化膜，仍有待于进一步研究。
已有的一些有关BOD生物传感器的专利主要侧重于整体测定仪的设计和测定装置的改进，大都使用三电极系统的电化学方法测定溶解氧，微生物的固定采用简便的夹层法，未能从根本上解决BOD微生物膜稳定性差的缺点。
(3)发明内容本发明的目的在于提供一种采用溶胶-凝胶杂化聚乙烯醇(PVA)包埋菌体制作BOD生物传感微生物固定化膜的方法，通过优化微生物膜的制作条件，获得了响应迅速、稳定、使用寿命长、线性范围宽的BOD微生物膜，为实现BOD微生物传感器的商品化奠定基础。
BOD生物传感微生物固定化膜的制造方法是四甲氧基硅烷(TMOS)与二甲基二甲氧基硅烷(DiMe-DMOS)按1∶(0.5～1.8)体积比混匀；再加入pH为1～6的HCl水溶液；将混合液于水浴下敞口搅拌水解，混合液呈乳白状后静置；移去上层清液，留下层凝胶液备用；配制8％(W/V)的PVA-124水溶液，后同磷酸缓冲液保存的菌悬液按1∶1体积比混合，再加入等体积的上述凝胶液，即可在所需基质(体)表面铺成所需厚度的微生物固定化膜，干燥成型。
与已有的采用夹层法、聚乙烯醇凝胶包埋等BOD生物传感微生物固定化膜相比，采用溶胶-凝胶杂化PVA制备的微生物膜，具有如下优点1)通过改进溶胶-凝胶过程，以凝胶液掺杂PVA对菌体进行包埋，成功解决了单纯使用PVA包埋存在的微生物膜溶涨性问题，微生物膜同玻璃、光纤等载基具有良好的粘合作用，长期浸泡于水中未发现微生物膜有脱落和溶解、溶涨现象；2)微生物被物理地包裹在凝胶液与PVA杂化的多孔基质中，不易发生微生物的流失，而大多数有机物和溶解氧能够扩散进入微生物膜，扩散阻力小；3)溶胶-凝胶杂化基质中含有足够的水，生物分子处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，在冰箱中能够长期保存。
(4)具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明。
实施例1将四甲氧基硅烷(TMOS)与二甲基二甲氧基硅烷(DiMe-DMOS)按1∶1.2体积比加入小瓶中，充分振荡均匀后，再搅拌逐滴加入与TMOS同体积的0.01mol/L的HCl水溶液，pH为3，将混合液于60℃水浴下敞口搅拌水解2h，混合液呈乳白状，静置30min，留下层凝胶液备用；配制8％(W/V)的PVA-124水溶液，待冷却后同0.067mol/L磷酸缓冲液(pH为7.2)保存的菌悬液按1∶1体积比混合均匀后，再加入等体积的上述凝胶液，充分混合均匀，可在玻璃基质、氧化感探头等表面铺成不同厚度的微生物膜。
上述制备过程主要具有以下几个特点1)起始反应液中不加入醇，用水解生成的醇作互溶剂，同时反应结束后敞口搅拌冷却水解产物，使所产生的醇在菌体加入前已基本挥发；2)前驱体采用含甲氧基的硅氧烷，其水解、聚合产生的甲醇比其它高级醇对细胞的危害小；3)利用DiMe-DMOS有机杂化TMOS水解聚合制备凝胶液，通过调整适当的DiMe-DMOS与TMOS两者的比例，可以控制产物的极性，从而使所获得的凝胶液与PVA水溶液的极性相匹配，解决了溶胶-凝胶杂化PVA的关键性问题；4)菌体采用磷酸缓冲液悬浮保存，加入凝胶液中时此缓冲液起到了很好的缓冲混合液酸度的效果，以维持体系的酸度在细胞适应的范围内。
实施例2以异常汉逊氏酵母(Hansennula anomala)为工作菌种，采用上述制备方法制备微生物固定化膜，TMOS∶DiMe-DMOS按1∶0.5体积比，与HCl水溶液(pH为6)的混合液于50℃水浴下敞口搅拌水解2.5h，混合液呈乳白状后在室温下静置，混合液分为上下两层，移去上层清液。PVA-124水溶液的配制可采用温水，并将制成的微生物膜直接固化于氧传感膜表面，利用氧传感膜进行二次传感检测溶解氧浓度的变化，从而考察用该方法制备的微生物固定化膜的响应特性。所使用的氧传感膜以4，7-二苯基-1，10-邻菲咯啉钌为荧光探针，以有机改性硅酸盐凝胶为基质，基于荧光猝灭原理检测溶解氧。
实施例3所说的TMOS∶DiMe-DMOS按1∶1.8体积比配置，制成的微生物膜可置于4℃冰箱中约2d后干燥成型。可加入BOD值100mg/L的葡萄糖-谷氨酸(GGA)液继续在冰箱中4℃保存。通过实验发现，以上述方法制备的微生物固定化膜对葡萄糖-谷氨酸(GGA)标准溶液具有响应灵敏、快速的特点，通常完成一个GGA标准溶液测定的时间在10min之内。通过改变微生物膜中菌体包埋量，可以获得不同BOD值浓度的线性范围，在相同的条件下连续6次测定BOD值为100mg/L的GGA溶液的重现性，荧光强度变化速率最大值的相对偏差为2.85％，在BOD5分析要求的重现性范围内。另外，实验考察了微生物膜储存于4℃冰箱中2个月后响应性的差异，发现微生物固定化膜适于冰箱中长期储存备用，其对有机物的响应活性在实验测定误差内基本保持不变。实验同时发现微生物膜在1个月的频繁使用中，具有良好的响应活性，对BOD值为100mg/L的GGA溶液响应值波动范围在±10％之内。以上结果都表明了以本方法制备的BOD微生物固定化膜具有较长的使用寿命和良好的稳定性。
权利要求
1.生化需氧量生物传感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于将四甲氧基硅烷与二甲基二甲氧基硅烷按1∶(0.5～1.8)体积比混匀；再加入pH为1～6的HCl水溶液；将混合液于水浴下敞口搅拌水解，混合液呈乳白状后静置；移去上层清液，留下层凝胶液备用；配制8％(W/V)的PVA-124水溶液，后同磷酸缓冲液保存的菌悬液按1∶1体积比混合，再加入等体积的上述凝胶液，即可在所需基质表面铺成所需厚度的微生物固定化膜，干燥成型。
2.如权利要求1所述的生化需氧量生物传感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于将四甲氧基硅烷与二甲基二甲氧基硅烷按1∶1.2体积比加入小瓶中。
3.如权利要求1所述的生化需氧量生物传感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于所说的HCl水溶液为与TMOS同体积的0.01mol/L的HCl水溶液。
4.如权利要求1所述的生化需氧量生物传感微生物固定化膜的制造方法，其特征在于所说的混合液于50～60℃水浴下敞口搅拌水解。
全文摘要
涉及一种可用于生化需氧量微生物传感器传感探头中的微生物固定化膜。将四甲氧基硅烷与二甲基二甲氧基硅烷混匀；再加入HCl水溶液；将混合液于水浴下敞口搅拌水解，混合液呈乳白状；留下层凝胶液备用；配制8％(W/V)的PVA－124水溶液，后同磷酸缓冲液保存的菌悬液按1∶1体积比混合，再加入等体积的上述凝胶液。以凝胶液掺杂PVA对菌体进行包埋，成功解决了单纯使用PVA包埋存在的微生物膜溶涨性问题；微生物被物理地包裹在凝胶液与PVA杂化的多孔基质中，不易发生微生物的流失；溶胶－凝胶杂化基质中含有足够的水，生物分子处于水溶液的微环境中，保持了它的活性和稳定性，在冰箱中能够长期保存。
文档编号C12M1/34GK1396264SQ0212845
公开日2003年2月12日 申请日期2002年8月1日 优先权日2002年8月1日
发明者陈曦, 钟振明, 戴媛静, 王小如 申请人:厦门大学