专利名称：通过Cre-LoxP定点打靶体细胞克隆家畜作为乳腺生物反应器的研制的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程、胚胎工程与家畜繁殖工程等生物学领域。具体地，本发明涉及将含有LoxP-标记基因定点整合的转基因克隆家畜的胎儿成纤维细胞和克隆家畜，及其制备方法和用途。
背景技术：
转基因动物(包括家畜)在生命科学的基础研究、生物制药、以及异种器官移植研究中具有广泛的应用前景，尤其是生物制药业利用转基因动物生物反应器来生产具有生物活性的医用蛋白，将会在生物制药业中产生巨大的商业利润。制备转基因动物的方法有多种，如显微注射法、脂质体介导法、精子介导等，其中显微注射法是一种经典的方法，但在家畜中转基因的整合率仅为2-3％，且转基因的整合是随机的，其表达水平受到整合位置的影响，尤其是该方法不能对内源基因进行遗传修饰等，因此限制了该方法在家畜中的应用。
小鼠胚胎干细胞(ES)系的建立在研究基因功能方面起了重要作用。利用基因打靶技术把外源基因导入ES细胞，经囊胚腔注射法制备嵌合体小鼠，再通过繁育从后代中筛选获得转基因小鼠。由于在家畜中至今未能获得ES细胞株，并且尚需多一个世代方能获得转基因动物，限制了在家畜中的应用。
自1952年美国科学家Briggs和King首先在两栖动物中进行细胞核移植实验以来，家畜的胚胎细胞核移植也相继在绵羊、家兔、牛、山羊获得成功。1997年Willmut等人报道了绵羊乳腺上皮体细胞克隆的研究。
克隆羊多利的诞生，为利用体细胞转基因进而通过核移植制备转基因动物开辟了新的思路，一是将外源基因转染到传代的胎儿成纤维细胞，然后采用克隆技术获得转基因克隆动物，这已在绵羊、山羊和牛中得以证实。该方法产生的转基因动物可达100％，但外源基因的整合位点是随机的，其表达水平仍受到位置效应的影响。第二，就是应用基因Knock-out或Knock-in技术，先将体外培养的体细胞进行基因定点整合，再将定点整合的单克隆细胞进行核移植，获得定点整合的转基因克隆动物。应用该方法制备转基因动物，不仅可极大地缩短育种周期，降低成本，而且外源基因定点整合，其表达不受位置效应的影响，尽管核移植的效率不高，但对制备转基因动物乳腺生物反应器来讲和前述任何方法相比是一种理想的方法，目前已在绵羊上得到证实[McCreath KJHowcroft J，Campbell KHS，et a1.，Production of gene-targeted sheep by nucleartransfer from cultured somatic cells.Nature 2000，4051066-1070]。
然而，到目前为止，本领域还缺乏高效快速地制备定点整合的、且乳腺特异性表达的转基因克隆动物的技术。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效快速地制备定点整合的、且乳腺特异性表达的转基因克隆动物的方法，该方法利用含有LoxP-标记基因定点整合的通用的转基因克隆家畜的胎儿成纤维细胞来制备转基因动物。
本发明的另一目的提供用于该方法的基因构建物以及用该方法获得的转基因动物。
在本发明的第一方面，提供了一种定点打靶体细胞克隆家畜乳腺生物应器的制备方法，包括步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物从5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因、和3′同源臂序列；(b)筛选得到LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞；(c)将打靶载体与Cre表达质粒/Cre蛋白，共转染LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞，所述的打靶载体从5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二标记基因、LoxP序列，并筛选得到定点整合有外源基因的成纤维细胞；(d)将步骤(c)的成纤维细胞的细胞核，移植入家畜去核卵母细胞，再生成克隆动物。
在本发明的优选例中，在步骤(b)和(c)之间，还包括以下步骤(i)将步骤(b)的成纤维细胞的细胞核，核移植入家畜去核卵母细胞，再生成克隆动物；以及(ii)从步骤(i)的克隆动物获取LoxP序列定点整合的克隆家畜胎儿成纤维细胞。
在另一优选例中，所述的家畜选自下组牛、羊、猪、兔。
在另一优选例中，所述的标记基因选白下组neo基因、hygro基因。
在另一优选例中，在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游(即同源臂序列的外侧)还含有负筛选标记基因。
在另一优选例中，所述的5′和3′同源臂序列选自下组β-乳球蛋白基因组序列、αsl-酪蛋白基因组序列、β-酪蛋白基因组序列。
在另一优选例中，各同源臂序列的长度为2-10kb，较佳地为2.5-8kb，更佳地为2-6kb。
在另一优选例中，所述的5′同源臂序列含有乳腺特异性表达基因的5′非翻译区和/启动子，或者所述的外源基因带有乳腺特异性表达调控序列。
在本发明的第二方面，提供了一种家畜胎儿成纤维细胞，在所述细胞的基因组中定点插入有一构建物，其中插入位点是选自下组的基因区域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述构建物基本上由LoxP序列和标记基因构成，或者所述的构建物基本上由LoxP序列、外源基因和标记基因构成。
在本发明的第三方面，提供了一种制备家畜成纤维细胞的方法，所述的成纤维细胞的β-酪蛋白基因位点定点插入LoxP序列，该方法包括步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物含有从5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因和3′同源臂序列；(b)筛选得到LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种转基因的非人哺乳动物，在该动物的细胞基因组中定点插入有一构建物，其中插入位点是选自下组的基因区域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述构建物基本上由LoxP序列和标记基因构成，或者所述的构建物基本上由LoxP序列、外源基因和标记基因构成。
在本发明的第五方面，提供了用于基因打靶的构建物，构建物从5′→3′依次含有以下元件5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因、和3′同源臂序列；或者，从5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二标记基因、和LoxP序列。较佳地，所述的构建物在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游还含有负筛选标记基因。
图1显示了本发明方法的技术路线。
图2A显示了pBC-LoxP打靶载体基因元件构成示意图。
图2B显示了pBC-LoxP打靶载体基因元件构建过程。
图2C显示了pLoxP-HLF.Hyg载体基因元件构成示意图。
图2D显示了pLoxP-HLF.Hyg打靶载体基因元件构建过程。
图3A和3B是不含有目的基因的基因打靶构件以及含目的基因的基因打靶构件的重组示意图。
图4是贴壁生长的经基因打靶的单克隆山羊胎儿成纤维细胞。
图5A是定点整合检测鉴定的PCR图。其中泳道1-3分别为45#样品、对照、51#样品。
图5B显示了PCR测序片段的位置示意图。
图6是应用单克隆细胞制备的包理在琼脂内的发育至囊胚的NT胚胎。
图7是获得的基因打靶的单克隆体细胞克隆羊。
具体实施例方式
本发明经过深入而广泛的研究，发现利用LoxP序列可以方便而高效地将外源基因定点导入细胞，从而获得乳腺特异性表达的转基因动物。在此基础上完成了本发明。
简而言之，本发明的技术路线是，通过Knock-out的方法，乳腺特异打靶载体转染家畜胎儿成纤维细胞，定点敲除乳腺特异位点序列，建立一个通用的基因敲除细胞系(LoxP序列定点整合细胞)。再导入含有功能基因的打靶载体，获得功能基因定点整合的细胞株。利用核移植技术，获得含有定点整合的转基因克隆家畜，培育成年后检测乳腺中的表达产物。
基因打靶的构建物本发明用于引入LoxP序列的基因打靶的构建物从5′→3′依次含有以下元件5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因、和3′同源臂序列。各元件的作用如下5′同源臂序列和3′同源臂序列用于将位于其间的序列通过同源重组整合入染色体；LoxP序列整合入染色体后，利用LoxP序列可在其之间插入功能基因。
第一标记基因用于筛选发生重组的转化子。产生重组的转化子因含有标记基因而被选出。
在优选例中，所述构建物在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游还含有负筛选标记基因，其作用是排除非同源重组型的转化子。发生同源重组时，位于同源臂外侧的负筛选标记基因将不会整合入染色体；而发生非同源的重组时，位于同源臂外侧的负筛选标记基因可能会整合入染色体。通过筛选不含负筛选标记基因的转化子，就获得了发生预定的定点同源重组的转化子。可用于本发明的负筛选标记基因包括(但并不限于)自杀基因，如TK基因等。
本发明的用于引物外源功能基因的构建物从5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二标记基因、和LoxP序列。各元件的作用如下
LoxP序列用于将位于其间的序列(外源基因和第二标记基因)通过同源重组整合入染色体上的LoxP；外源基因编码所需的蛋白。
第二标记基因用于筛选发生重组的转化子。产生重组的转化子因含有第二标记基因而被选出。
制备方法具体而言，本发明的技术路线如图1所示，它包括以下二个阶段。
第一，获得含LoxP序列定点整合细胞用含LoxP序列的打靶载体，对山羊胎儿成纤维细胞进行打靶，得到转染基因的成纤维细胞。所述的LoxP序列打靶载体(构建物)，从5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因、3′同源臂序列和(任选的)负筛选标记基因。通过选择对应于乳腺特异性表达的基因(如β-乳球蛋白基因组序列、αsl-酪蛋白基因组序列、β-酪蛋白基因组序列等)的同源臂序列，使该构建物定点地在这些乳腺特异性表达基因处发生重组。如果对第一标记基因(如新霉素Neo抗性基因等)和负筛选标记基因(如TK抗性基因等)的筛选，可以获得抗性细胞。该细胞的获得建立了一个通用的基因敲除细胞系。因为该细胞在乳腺特异性表达位点处含有LoxP序列，因而可以方便地利用该LoxP序列将需要表达的外源基因定点引入。
该LoxP序列定点整合细胞可以直接用作受体细胞，用含待表达的外源基因的打靶载体进行打靶，也可冷存。
此外，还可用核移植技术将LoxP序列定点整合细胞的细胞核，引入另一卵母细胞，从而得到妊娠的受体。并从该妊娠受体获得LoxP序列定点整合细胞，或者获得不含功能基因的定点整合克隆羊。经过核移植后获得的LoxP序列定点整合细胞，不仅数量大大提高，而且活力也大幅提高。
第二、将待表达的外源基因引入LoxP序列定点整合细胞。
将含外源基因的打靶载体与Cre表达质粒和/或Cre蛋白，共转染LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞。其中所述的打靶载体从5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二标记基因、LoxP序列。在Cre表达质粒和/或Cre蛋白的协助下，含外源基因的打靶载体会在LoxP序列处发生定点重组，通过筛选(例如根据第二标记基因)，就得到定点整合有外源基因的成纤维细胞；然后，将定点整合有外源基因的成纤维细胞的细胞核，移植入家畜去核卵母细胞，再生成克隆动物。
本发明除了LoxP打靶载体和含外源基因的打靶载体的结构不同于现有技术之外，其他的技术，如转染技术、筛选技术、杂交方法、PCR方法、核移植方法等技术都可以采用本领域的各种常规技术。因此，对于这些技术不再重复描述。
本发明技术的优点在于建立的基因剔除的细胞(仅含LoxP)是一个通用性的细胞系，利用LoxP序列可在其之间插入功能基因，就可获得不同功能基因的定点整合细胞系，再应用核移植技术就可制备出带有不同功能基因定点整合的克隆动物。技术平台的建立，尤其是基因剔除的细胞系的建立为制备定点整合转基因克隆动物，提供了较为快捷的方法，并且对乳腺功能和对功能基因以及对调控元件与功能基因的组合的一些基础研究具有重要价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 定点打靶载体的构建(A)pBC-LoxP打靶载体的制备pBC-LoxP打靶载体的示意如图2A所示，其中各元件的具体序列如SEQ IDNO1-5所示。
1.各部分元件的来源1)本地山羊β-酪蛋白同源臂根据GENBANK gi15425979报道的序列设计并合成如下引物BCZ5’sTTCACGCAAAGATGGGCAC(SEQ ID NO6)和BC-PcGTCTTGGATTGCTTAGAAAACCC(SEQ ID NO7)。以抽提的山羊基因组DNA为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃3min，30个循环)扩增β-酪蛋白5’同源臂前半部分序列。PCR产物并克隆于pGEM-Teasy载体(购自Promega公司)，得质粒pnBC51。
根据GENBANK gi15425979报道的序列设计并合成如下引物BC-Pl’GGAAGCTCTTAGGTAACATTGC(SEQ ID NO8)和BC5’a.B.S.XCCT AGG CCC GGG CTCGAG TCC TGT GAA TGG GAA GAT GAG(SEQ ID NO9)。以抽提的山羊基因组DNA为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃ 45s；72℃ 3min，30个循环)扩增β-酪蛋白5’同源臂后半部分序列。PCR产物并克隆于pGEM-Teasy载体，得质粒pnBC52。
根据GENBANK gi15425979报道的序列设计并合成如下引物BCZ3’-s.B.BamHICCT AGG CGG ATC CAG GAA CAA CAG CAA ACA GAG G(SEQ ID NO10)和BCZ3’-aGCC ATA TTT CCA GTC GCA G(SEQ ID NO11)。以抽提的山羊基因组DNA为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃3min，30个循环)扩增β-酪蛋白3’同源臂前半部分序列。PCR产物并克隆于pGEM-Teasy载体，得质粒pnBC3人工合成两条单链核苷酸NBCTK.MCS1GGCCTGTCGACCTCGAGCCGCGGCAGCTGGGTACCAGCGGCCGCG(SEQ ID NO12)和NBCTK.MCS2TCGACGCGGCCGCTGGTACCCAGCTGCCGCGGCTCGAGGTCGACA(SEQ ID NO13)高温变性、退火后将其连入用SalI和NotI双酶切的pBCl载体(购自Invitrogen公司)的原核部分，得质粒pH79-MCS。
以HindIII和Sac I双酶切pnBC52，回收β-酪蛋白5’同源臂后半部分片段(约3200bp)。将该片段连于pnBC51的HindIII和SacI双酶切位点，得质粒pBC5’。
以BlnII和SacII双酶切pnBC3’，回收pnBC3’片段(约3.1Kb)。将该片段连于pBC5’的BlnII和SacII双酶切位点，得质粒pBC-T。
2)LoxP基因根据相关文献报道，人工合成两端带有XhoI位点的两条单链核苷酸CTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATC(SEQ ID NO14)和TCGAGATAACTTCGTATACGTATGTATATACGAAGTTATC(SEQ ID NO15)3)TK基因合成两条PCR引物TK.KpnIGGGGTACCCTGCTTCATCCCCGTGGCCC(SEQ IDNO34)；TK.NotIATAAGAATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCC(SEQ ID NO35)。以pNTKV1906质粒(购自Stratagen公司)为模板，常规PCR扩增TK基因。PCR产物用NotI和KpnI双酶切后，被克隆到得到pBSK载体(购自Stratagen公司)NotI和KpnI双酶切位点中，得pBSK-TK质粒。TK基因片段包含TK基因自身的启动子、编码序列和PolyA序列。
4)Neo抗性基因以SalI和XhoI双酶切pCDNA3(购自Invitrogen公司)，回收Neo基因片段(约2.2Kb)。该片段包括一个PolyA序列和Neo抗性基因的启动子、编码序列和PolyA序列。
2.pBC-LoxP打靶载体的构建构建过程如图2B所示。以KpnI和NotI双酶切pBSK-TK质粒，回收TK基因片段(约2100bp)将该片段连于pH79-MCS的KpnI和NotI双酶切位点得pH79-TK；以SacI和SacII双酶切pBC-T回收β-酪蛋白同源臂片段(约9.2Kb)将该片段连于pH79-TK的SacI和SacII双酶切位点得质粒pBC-TK，以SalI和XhoI双酶切pCDNA3回收Neo基因片段(约2.2Kb)将该片段连于pBC-TK的SacI和XhoI双酶切位点得质粒pBC-Neo.TK，将人工合成两端带有XhoI位点的两条单链核苷酸变性、退火形成LoxP基因并将基因片段(约40bp)连于pBC-Neo.TK的XhoI酶切位点得最终的打靶载体PBC-LoxP。
3.在pBC-LoxP打靶载体中各部分接头及其临近序列如下1)5’臂-LoxP-Neo接头5’臂 接头 LoxPTCATACGCTGTTTCCTCATCTTCCCATTCACAGGACCTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAG接头 NEOTTATCCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTG(SEQ ID NO16)2)Neo-3’臂接头Neo-3’ 接头 3’臂ATGTCTGTATACCGTCGAGCCCGGGCCTAGGGCGGATCCAGGAACAACAGCAAACA(SEQ ID NO17)3)3’臂-TK接头3’臂 接头TKGACTGGAAATATGGCAATCGAATTCCCGCGGTGGCGGCCTCGACTGCTTCATCCC(SEQ ID NO18)(B)pLoxP-HLF.Hyg载体的制备pLoxP-HLF.Hyg打靶载体的示意如图2C所示，其中各元件的具体序列如SEQ ID NO19-20所示。
1.各部分元件的来源
1)LoxP-HLF(cDNA)基因根据GENBANK AY137470报道的序列，设计并合成如下引物gggagctctcgagataactt cgtatagcat acattatacg aagttatcat gaaacttgtc ttcctcgtcctgc(SEQ ID NO21)和ccggtacctc gagataactt cgtatacgta tgtatatacgaagttatctt acttcctgag gaattcacag g(SEQ ID NO22)以人乳房组织cDNA反转录产物为模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃3min，30个循环)扩增LoxP-HLF基因。PCR产物用以KpnI和SacI双酶切并克隆于pBSK载体(购自Stratagen公司)KpnI和SacI双酶切位点，得质粒pLoxP HLF。
2)Hgy抗性基因来自pIRESHyg质粒(购自Clontech公司)，以NruI和XhoI双酶切回收Hyg基因片段(约3.2Kb)包括一段IRES序列和Neo抗性基因的启动子、编码序列和PolyA序列。
2.pLoxP-HLF.Hyg载体的构建构建过程如图2D所示。以KpnI和SacI双酶切质粒pIRESHyg，回收Hyg基因片段(约3200bp)。将该片段连于pLoxP-HLF的KpnI和SacI双酶切位点，得pLoxP-HLF.Hyg载体。
3.在pLoxP-HLF.Hyg载体中各部分接头及其临近序列如下1)LoxP-HLF接头LoxP起始密码子 HLFCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCATGAAACTTGTCTTCCTCGTCCT(SEQ ID NO23)2)HLF-Hyg接头HLF 接头 HygCCCCTCCTGGAAGCCTGTGAATTCCTCAGGAAGTAAGTCGACGACGATGTACGGGCCAGATATAC(SEQ IDNO24)3)Hyg-LoxP接头Hyg 接头 LoxPTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCGATCGACTCGAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACG实施例2 定点打靶载体的细胞转染筛选与鉴定1.萨能奶山羊胎儿成纤维细胞萨能奶山羊胎儿成纤维细胞按照常规方法培养获得。即从怀孕35天母山羊经手术采集胎儿，去头、四肢以及内脏后，将其剪成泥状，加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin/1mM EDTA)，37℃，消化20min，接着加入含10％FCS的DMEM培养液终止消化，500g离心15min。弃去上清，将细胞重悬于培养液内，接种至培养瓶中，置于培养箱中，37℃、5％CO2培养与冷冻。
2.山羊纤维母细胞(GEF)的复苏和扩增将冻存的雌性山羊纤维母细胞(GEF)复苏，用15％胎牛血清的DMEM/F12培养液置于37℃含有5％C02培养箱内培养2-3天，待细胞长满后，再扩增传代。一般一次转染需要1×107细胞。
3.电穿孔转染在转染前确认细胞的生长处于良好状态。
将长满细胞的培养瓶从CO2培养箱取出后，用胰酶消化5-10分钟。当细胞全部分散成单个细胞后，加入少量含有15％胎牛血清的DMEM/F12培养液终止反应。调整细胞浓度为1×107/ml。
在电穿孔杯内加入细胞悬液和实施例1中制备的构件DNA，在电穿孔仪上通电电击。电击完毕后取出电穿孔杯，室温静置10分钟。
将细胞转移到含有15％胎牛血清的DMEM/F12培养液的无菌60mm平皿中，每个平皿约(1×106细胞)，置于CO2培养箱内培养。
4.正负筛选转染细胞培养48小时后，培养液中加入G418和Ganc进行正负筛选。当出现细胞集落时，将细胞集落挑出，转移到96孔板内。待细胞长满后依次转移到48孔、24孔、12孔、6孔及60mm平皿中，其中部分细胞抽提DNA，用于PCR和Southern杂交检测外源基因的整合情况，部分细胞冷冻保存。
图3A和3B显示了不含有目的基因的基因打靶构件以及含目的基因的基因打靶构件的重组示意图。图4显示了贴壁生长的经基因打靶的单克隆山羊胎儿成纤维细胞。
5.乳铁蛋白基因定点整合的检测(1)检测同源重组的PCR试验1)PCR引物的设计构件设计时，取β-酪蛋白3’端的3.2kb序列(11711-14950)作为同源臂连接到构件上。当同源重组时，tk基因丢失，同源臂与基因组上β-酪蛋白3’序列发生重组。
为了检测细胞内是否发生同源重组，设计了如下两对引物。第一对上游引物自neor基因起(P1)，下游引物自构件外β-酪蛋白3’序列起(P1’)。第二对引物设计在第一对引物的内侧(P2、P2’)。
P1Neo69CTGGGCACAACGGACAATCGG(SEQ ID NO26)
P2Neop3 CTC TGA TGC CGC CGT GTT CC (SEQ ID NO27)P2’BC13553a GGCTAAGGGTTAATTTATTGAAATGACTGG(SEQ ID NO28)P1’BC13988a GCTCCTTCTAGTTGTAACACTAGTCC (SEQ ID NO29)2)PCR扩增条件。常规PCR扩增条件。
3)结果PCR结果如图5A所示，第45和51号有4.4kb大小片段。
此外，对PCR产物进行了分离和测序，PCR产物测序结果与预计的片段序列完全一致，证实发生了同源重组。图5B显示了各片段的位置示意图。
(2)检测同源重组的Southern杂交1)特异性探针的选择因neor基因在哺乳动物体内不存在，选择neor基因片段作为探针。用Smal在构件1122bp和2294bp处各有一个位点，片段长1.2kb。用Smal酶切后回收1.2kb作为探针。
2)限制性内切酶的选择选Sacl和Hpal双酶切后做Southern杂交。因构件外β-酪蛋白3’序列有Hpal位点，同源重组后双酶切片段长5.8kb；而随机整合因tk基因没有Hpal位点，双酶切后片段大于7.4kb。
3)结果Southern杂交显示有预计的5.8kb条带。
上述各实验证实了，本实施例获得了定点打靶的单克隆成纤维细胞株。
实施例3 定点打靶单克隆细胞的克隆动物制备1材料与方法1.1. 试剂 均为胚胎级试剂，除另有说明外均为Sigma产品。
1.2 方法1.2.1 供质卵母细胞采集 奶山羊应用FSH按常规进行超数排卵，在注射LRH后29-30小时，采用手术回收卵母细胞，用含5％小牛血清(FCS，Gibco)的F-10(Gibco)培养液冲洗输卵管。收集卵母细胞，透明质酸酶去除附着的颗粒细胞。收集的卵母细胞置于M16液中，37.5℃，5％的二氧化碳培养箱中培养。
1.2.2 供核细胞的饥饿处理 将获得定点整合的单克隆细胞株，0.5％FCS饥饿72h后，一部分细胞冻存于-80℃冰箱，使用前四天复苏(记为P1，再传代记为P2，类推)，培养2-5天，再饥饿48小时，丰度在70-85％时用作供核细胞。
1.2.3 重构卵的构建及其激活1.2.3.1 重构卵的构建卵母细胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB7.5μg/ml)液中洗涤3次，在M16-Hepes中处理10min；同时将培养的细胞用胰酶消化、分散成单个细胞后立即加入小牛血清以终止消化，经500g离心2min后，去除上清，加入20μl M16-Hepes液。将卵母细胞与供核体细胞同时移入M16-Hepes中，在显微镜下将卵母细胞核去除后随即将供核细胞移入卵周隙。移入供核细胞的卵在M16培养液中洗涤3次，置于M16液中，37℃培养30min后，进行电融合(0.3mM甘露醇、0.05mM CaCl2、0.1mM MgSO4、5％BSA)，融合条件为DC、140-160V/cm，脉冲持续时间为80μs，连续刺激二次。刺激后的卵置于M16培养液中培养20-30min观察是否融合，融合卵为重构卵；未融合的重复一次。
1.2.3.2 重构卵的激活 重构卵在M16液中，37℃、5％CO2培养箱中培养5小时后，用含5μM离子霉素、7.5μg/ml细胞松弛素B(CB)、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes液处理5min，再在2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、7.5μg/ml CB、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes培养液中培养4-5小时。激活后的重构胚置于M16培养液中作短暂培养。
1.2.4 重构胚体内培 养应用手术的方法，将激活后的NT胚胎用1％的低熔点琼脂糖包理后，吸入移卵管内，从输卵管喇叭口处插入将卵移进输卵管内，随后在输卵管与子宫连接部用缝线结扎。在体内培养6天后(不同种的动物培养的时间不同)，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎，观察胚胎发育情况。
1.2.5 重构胚的移植 将发育至桑椹与囊胚期的重构胚移植到自然发情后第六天的受体羊子宫内(有黄体侧)，共移植2-3枚。
1.2.6 受体羊妊娠检查与产羔移植后的受体在1至2月龄时用B超进行妊娠检查，出现孕囊的判定为怀孕。妊娠到期后，采用自然分娩或剖腹产术产羔、记录羊羔的初生体重、性别及其它表型特征。
1.2.7 克隆羔羊的基因型鉴定羔羊的鉴定采用微卫星DNA-PCR扩增片段长度多态性(VNTR-PCR)方法分析。供检样品分别取自所有出生的定点整合克隆山羊、供核细胞、受体羊，其基因组DNA按照常规方法提取，浓度为200ng/μl。
山羊微卫星DNA引物选择具有多态性的山羊微卫星DNA引物21对SRCRSP10，ILSTS 005、006、008、019、029、030、049、052、065、076、078、104，BM1258，ETH10，INRADERN172、175、192，INRA005、040、063(参见Vaiman D.，D，Mercier，K.Moazami-Goudarzi，A.Eggen，R.Ciampolini，A.Lepingle，R.Velmala，J.Kaukinen，S.L.Varvio，P.Martin，1994，A set of 99 cattlemicrosatellitescharacterization，synteny mapping，and polymophism，Mammalian Genome，5288-297等文献)。PCR反应条件94℃ 5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35℃ 30s，共35个循环，72℃ 10min，最后4℃保存。PCR产物用8％聚丙烯酰胺120V电泳，90min，0.5g/NIEB染色，照相。
1.2.8 克隆羔羊的外源基因的鉴定克隆羊的外源基因鉴定，通过检测NEO基因进行。取克隆羔羊的耳组织，经蛋白酶K消化后，用通常的酚氯仿方法进行抽提，其DNA用水溶解，浓度为200ng/μl。
采用PCR反应的方法进行检测，其设计如下引物GB4895’GAG GAG AAG GCT GCT GTT GC3’(SEQ ID NO30)GB8185’ATT TCC AAA GGA GTT CAG CAC3’(SEQ ID NO31)NE0935’CTC TGA TGC CGC CGT GTT CC3’(SEQ ID NO32)NE03315’CGG CAG GAG CAA GGT GAG ATG3’(SEQ ID NO33)引物浓度均为20μM。NE093，NE0331是在NEO基因上设计的引物。GB489，GB818是在山羊球蛋白基因上设计的引物，这一对引物作为内参。
反应条件95℃预热5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，进行30个循环，然后72℃延伸10min。
PCR产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳。NEO基因扩增片段长度为238bp，球蛋白基因扩增片段长度为329bp，含有NEO基因的样品能同时扩增出NEO基因片段(238bp)和球蛋白基因片段(329bp)，而不含NEO基因的样品只能扩增出球蛋白基因片段(329bp)。
2.结果本次试验供投入羊数105头，其中供质羊数84头，寄母羊21头；平均每只供体羊经超数排卵后获9.3(785/84)枚，将卵细胞去核后再移入供核细胞，其移核率为92.3％(724/785)；移核卵经电刺激后融合率为78.67％(426/541)；将融合卵经琼脂包埋后移入寄母输卵管内培养6天再回收，其回收率为86.69％(469/541)；回收卵发育至桑椹与囊胚期的比率为56.29％(264/469)(图6)；将发育的桑椹与囊胚期胚胎移入受体羊的子宫内，共移124头植受体，至35日龄时，受体羊的妊娠率为38.7％。在妊娠35-40日龄时，取3只胎儿，性别均为雄性，并制备了胎儿成纤维细胞，冻存供进一步试验。到2002年10月14日，妊娠到期产21只克隆羊，性别均为雄性，其中存活16只(图7)。详见表1。
存活的6只隆羊经外源基因检测，均含有NEO基因。
表1、定点整合体细胞克隆试验结果
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>通过Cre-LoxP定点打靶体细胞克隆家畜作为乳腺生物反应器的研制<130>026308<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>6080<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(6080)<223>酪蛋白5’同源臂<400>1cgcgaattca ctagtgattt tcacgcaaag atgggcacaa taaaggacag aaattttatg 60gaggagttgc tgatggagag ggaggcctgg cgcgctgcga ttcatggggt cgcaaagagt120cggacacaac tgagcgactg aattgaactg aactgaactg gacaaagcag aagatattaa180gaagaggtgg taagaataca cagaagaaca atataaaaaa gatcttcatg acccagataa240ccacgatgat gtgatcactc acctagagcc agacaccctg gaatgcaaag tcaagcggcc300ttagaaagcc tcactatgaa caaagctagt ggaggtgatg gaattccagt tgagctattt360caaatcttaa aaggtgatgc tgtgaaagtg ctgcactcaa tatgtcagca aatttggaaa420actcagcagt ggccacagga ctgccacaat cccaaagaaa agcaatgaca aagaatgttc480aaacacccac atgattgcac tcatctcaca tgctagcaaa ataactctca aaattctcca540agccaggctt caacagtacg tggaccatga acttccagat gttcaagctg gatttagaaa600aggcagagga accagagatc aaattgccaa catccattgg atcatcaaaa aagcacgaga660gttccagaaa aacatctgct ttattgacta cgctaaagcc tttgattgtg tggatcacaa720taaactgtgg aaaattcttc aagagatggg aataccagac cactttacct gcctcctgag780aaatctgtat gcaggtccag aagcagcagt tagaactgga catggaacaa cagactggtt840ccaaactgcg aaaggggtac atcaaggaat attcattgga aggattgatg ctgaagctga900aactcctata ctttggccac ctaatgtgaa gatctgactc attggaaaag actccaatgc960tgggaaagat tgaaggcagg agaagaggat gacagaggat gagatggttg gatgggatca 1020ctgactcaat ggacatgagt ttgagtaagc tccaggggtt ggtggtggac aggaaagcct 1080ggcgtgctgc agtccacaag gtcacaaaga ttcggacatg actgagtgac tgaactgata 1140ctgatgtgct caacaaatgt atcttgaact tgtgtgaagt tctatggtca catgtaaagg 1200aagaataatc aggattagct gtgtgtctta ggaatcaggg ttctgagttt tatgtgttca 1260tagtatctgc tggttcacaa aacatttttc ttattctctg gttcttgatt tactttataa 1320agtaatctta atagttatac ttcacataga taggaaatta ttatatttgg ataatctcat 1380ggaaaggatt aaatactcca tctatatgag taatgctgaa ctatctactc ctacctaata 1440atttgtcaga attcactaat tctgtgttat attgtttcta aatctgaatc attatatgaa 1500tcctcagtat tttgttttcc ttcctctata ttttggaatt tattaaacag tgcttcaaat 1560aatttttagg aaactgaagt ttttagtaac agctctatct ctaaatagct ttagtatctt 1620gaaaaagtaa tacaaattct cacatcctta atttcctctt ctctaaaata tctttaaaat 1680attctatgaa tgatatctct taatatttat ttttttggca atccaacaca gcttatggga 1740tcttagttcc ccagtggggg attatatcca tgccaactgc agtgaaagta caaaatccta 1800aactggactc accggggatt tcccaatatc tcctctagtt cttatttctg aatatttttg 1860gtccctttat tgtactcttc atccaacttt tctattgatt tctttcttga ggatattatt 1920tacttggttt cagctagaaa tatatgcaaa tctcaggact gcatattcca gattcattgg 1980ccaatatggg aaaaaacctt tggctgaaca aatcatgctt ataaaaaata gtactagagc 2040atcttacttt gactatatct tgctcctcat tcagggttat ctaatacaat ttccccatat 2100
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<221>misc_feature<222>(1)..(3234)<223>酪蛋白3’同源臂<400>4ggaacaacag caaacagagg taatttgttc actatgagta tattttgaga agtattatga 60aacataacac ataaaaagat ttataataat tatgttcagt ctaagaatgg taatataaat120gtcagtgtaa gaaatgaaaa ctttgacaaa atgaaaatat tttaaagata gaaacacatt180tttaaacaca taatcaaatt tcagagtata gaataaatac ccaagaataa ctactggtat240attcatttta ctaatggtat acctggtttt aataaatgca tattagtagg aacaattcca300gactagggac tgtgatcccc ttattctaat gatggatatg ctaatgaaag acagtagggt360gacagtgtgg cactaatcct catttgatca tttatcagct gtataacctt ggctccatgt420ttctctgtac atcattttct tcacctgtaa attgagaata ttcataatta cccagagttg480atgaactggc acacagtgac tattcaatgg ttttatatta tatttgatag ttttatactc540acatttatga atgtgtggag ttctaaaaag tatttccatt acccagatga gagaagtgag600gtacaaaaca attgagtata caaatgtgtg accataccac atagttatta attagcagaa660cttgcttaaa aataaggatt tggggacagc ataaaattct ttcattatat tactcttgtg720gtaacatatt tatctaattg tgatatttaa gctttcctgt tttagaattg aagattgatt780gtttggcact taggccaaat attttctaag tcaaaatgaa tttacaactt gatgccttta840aagactcaag attaccacct tctaccaaga gaagtagtgc tagaagctgg ccattgttaa900ggaactcctt gaattaaaaa aacacatatt aagacttaat ttccattaaa acaaacaaaa960ataaacctca gagtaacttt ttaagtcttt ttaaaataga tctttctttg ttatatgaaa 1020tcagtttgga ctattatcca aagtatgtag ctaccactct gcaggcaact caggaagagg 1080tggaataagt gttgaaatct ccaaaccctg atttcacttg actctctgat ttcacttgtg 1140aaggaagttg ggttaatgag aaatccttca gcgagcattt tactcattag tcttcatatg 1200accccaaaca atttcttaac taaaccaaat ggaagatttt ctttctctct cttcactgaa 1260ttatgtttta aaaagaggag gataattcat catgaataac aattataact ggattatgga 1320ctcaaagatt ttttttcctt ctttccagga tgaactccag gataaaatcc acccctttgc 1380ccaggcacag tctctagtct atcccttcac tgggcccatc cctaacagcc tcccacaaaa 1440catcctgcct cttactcaaa cccctgtggt ggtgccgcct ttccttcagc ctgaaataat 1500gggagtcccc aaagtgaagg agactatggt tcctaagcac aaagaaatgc ccttccctaa 1560
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<221>misc_feature<222>(1)..(2096)<223>TK基因序列<400>5gtggcggcct cgactgcttc atccccgtgg cccgttgctc gcgtttgctg gcggtgtccc 60cggaagaaat atatttgcat gtctttagtt ctatgatgac acaaaccccg cccagcgtct120tgtcattggc gaattcgaac acgcagatgc agtcggggcg gcgcggtccc aggtccactt180cgcatattaa ggtgacgcgt gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta240acagcgtcaa cagcgtgccg cagatcttgg tggcgtgaaa ctcccgcacc tcttcggcaa300gcgccttgta gaagcgcgta tggcttcgta cccctgccat caacacgcgt ctgcgttcga360ccaggctgcg cgttctcgcg gccatagcaa ccgacgtacg gcgttgcgcc ctcgccggca420gcaagaagcc acggaagtcc gcctggagca gaaaatgccc acgctactgc gggtttatat480agacggtcct cacgggatgg ggaaaaccac caccacgcaa ctgctggtgg ccctgggttc540gcgcgacgat atcgtctacg tacccgagcc gatgacttac tggcaggtgc tgggggcttc600cgagacaatc gcgaacatct acaccacaca acaccgcctc gaccagggtg agatatcggc660cggggacgcg gcggtggtaa tgacaagcgc ccagataaca atgggcatgc cttatgccgt720gaccgacgcc gttctggctc ctcatatcgg gggggaggct gggagctcac atgccccgcc780cccggccctc accctcatct tcgaccgcca tcccatcgcc gccctcctgt gctacccggc840cgcgcgatac cttatgggca gcatgacccc ccaggccgtg ctggcgttcg tggccctcat900cccgccgacc ttgcccggca caaacatcgt gttgggggcc cttccggagg acagacacat960cgaccgcctg gccaaacgcc agcgccccgg cgagcggctt gacctggcta tgctggccgc 1020
gattcgccgc gtttacgggc tgcttgccaa tacggtgcgg tatctgcagg gcggcgggtc 1080gtggcgggag gattggggac agctttcggg gacggccgtg ccgccccagg gtgccgagcc 1140ccagagcaac gcgggcccac gaccccatat cggggacacg ttatttaccc tgtttcgggc 1200ccccgagttg ctggccccca acggcgacct gtacaacgtg tttgcctggg ccttggacgt 1260cttggccaaa cgcctccgtc ccatgcacgt ctttatcctg gattacgacc aatcgcccgc 1320cggctgccgg gacgccctgc tgcaacttac ctccgggatg gtccagaccc acgtcaccac 1380ccccggctcc ataccgacga tctgcgacct ggcgcgcacg tttgcccggg agatggggga 1440ggctaactga aacacggaag gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa 1500aaagacagaa taaaacgcac gggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg ggttcggtcc 1560cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt ggggccaata cgcccgcgtt 1620tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac 1680gtcggggcgg caagccctgc catagccacg ggccccgtgg gttagggacg gggtccccca 1740tggggaatgg tttatggttc gtgggggtta ttattttggg cgttgcgtgg ggtcaggtcc 1800acgactggac tgagcagaca gacccatggt ttttggatgg cctgggcatg gaccgcatgt 1860actggcgcga cacgaacacc gggcgtctgt ggctgccaaa cacccccgac ccccaaaaac 1920caccgcgcgg atttctggcg ccgccggacg aactaaacct gactacggca tctctgcccc 1980ttcttcgctg gtacgaggag cgcttttgtt ttgtattggt caccggtatc gataagctag 2040cataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatggtac cagcggccgc gtcgac 2096<210>6<211>19<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6ttcacgcaaa gatgggcac 19<210>7<211>23<212>DNA<213>寡核苷酸<400>7gtcttggatt gcttagaaaa ccc 23<210>8<211>22<212>DNA<213>寡核苷酸<400>8ggaagctctt aggtaacatt gc 22<210>9<211>39<212>DNA<213>寡核苷酸<400>9cctaggcccg ggctcgagtc ctgtgaatgg gaagatgag39<210>10<211>34<212>DNA<213>寡核苷酸<400>10cctaggcgga tccaggaaca acagcaaaca gagg 34<210>11<211>19
<212>DNA<213>寡核苷酸<400>11gccatatttc cagtcgcag 19<210>12<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸<400>12ggcctgtcga cctcgagccg cggcagctgg gtaccagcgg ccgcg 45<210>13<211>45<212>DNA<213>寡核苷酸<400>13tcgacgcggc cgctggtacc cagctgccgc ggctcgaggt cgaca 45<210>14<211>41<212>DNA<213>寡核苷酸<400>14ctcgagataa cttcgtatag catacattat acgaagttat c 41<210>15<211>40<212>DNA<213>寡核苷酸<400>15tcgagataac ttcgtatacg tatgtatata cgaagttatc 40<210>16<211>113<212>DNA<213>寡核苷酸<400>16tcatacgctg tttcctcatc ttcccattca caggacctcg agataacttc gtatagcata 60cattatacga agttatcctc gagcatgcat ctagagggcc ctattctata gtg 113<210>17<211>56<212>DNA<213>寡核苷酸<400>17atgtctgtat accgtcgagc ccgggcctag ggcggatcca ggaacaacag caaaca 56<210>18<211>55<212>DNA<213>寡核苷酸<400>18gactggaaat atggcaatcg aattcccgcg gtggcggcct cgactgcttc atccc 55<210>19
<211>2182<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(2182)<223>LoxP-HLF基因序列<400>19gagctctcga gataacttcg tatagcatac attatacgaa gttatcatga aacttgtctt 60cctcgtcctg ctgttcctcg gggccctcgg actgtgtctg gctggccgta ggagaaggag120tgttcagtgg tgcaccgtat cccaacccga ggccacaaaa tgcttccaat ggcaaaggaa180tatgagaaga gtgcgtggcc ctcctgtcag ctgcataaag agagactccc ccatccagtg240tatccaggcc attgcggaaa acagggccga tgctgtgacc cttgatggtg gtttcatata300cgaggcaggc ctggccccct acaaactgcg acctgtagcg gcggaagtct acgggaccga360aagacagcca cgaactcact attatgccgt ggctgtggtg aagaagggcg gcagctttca420gctgaacgaa ctgcaaggtc tgaagtcctg ccacacaggc cttcgcagga ccgctggatg480gaatgtgcct atagggacac ttcgtccatt cttgaattgg acgggtccac ctgagcccat540tgaggcagct gtggccaggt tcttctcagc cagctgtgtt cccggtgcag ataaaggaca600gttccccaac ctgtgtcgcc tgtgtgcggg gacaggggaa aacaaatgtg ccttctcctc660ccaggaaccg tacttcagct actctggtgc cttcaagtgt ctgagagacg gggctggaga720cgtggctttt atcagagaga gcacagtgtt tgaggacctg tcagacgagg ctgaaaggga780cgagtatgag ttactctgcc cagacaacac tcggaagcca gtggacaagt tcaaagactg840ccatctggcc cgggtccctt ctcatgccgt tgtggcacga agtgtgaatg gcaaggagga900tgccatctgg aatcttctcc gccaggcaca ggaaaagttt ggaaaggaca agtcaccgaa960attccagctc tttggctccc ctagtgggca gaaagatctg ctgttcaagg actctgccat 1020tgggttttcg agggtgcccc cgaggataga ttctgggctg taccttggct ccggctactt 1080cactgccatc cagaacttga ggaaaagtga ggaggaagtg gctgcccggc gtgcgcgggt 1140cgtgtggtgt gcggtgggcg agcaggagct gcgcaagtgt aaccagtgga gtggcttgag 1200cgaaggcagc gtgacctgct cctcggcctc caccacagag gactgcatcg ccctggtgct 1260gaaaggagaa gctgatgcca tgagtttgga tggaggatat gtgtacactg caggcaaatg 1320tggtttggtg cctgtcctgg cagagaacta caaatcccaa caaagcagtg accctgatcc 1380taactgtgtg gatagacctg tggaaggata tcttgctgtg gcggtggtta ggagatcaga 1440cactagcctt acctggaact ctgtgaaagg caagaagtcc tgccacaccg ccgtggacag 1500gactgcaggc tggaatatcc ccatgggcct gctcttcaac cagacgggct cctgcaaatt 1560tgatgaatat ttcagtcaaa gctgtgcccc tgggtctgac ccgagatcta atctctgtgc 1620tctgtgtatt ggcgacgagc agggtgagaa taagtgcgtg cccaacagca atgagagata 1680ctacggctac actggggctt tccggtgcct ggctgagaat gctggagacg ttgcatttgt 1740gaaagatgtc actgtcttgc agaacactga tggaaataac aatgaggcat gggctaagga 1800tttgaagctg gcagactttg cgctgctgtg cctcgatggc aaacggaagc ctgtgactga 1860ggctagaagc tgccatcttg ccatggcccc gaatcatgcc gtggtgtctc ggatggataa 1920ggtggaacgc ctgaaacagg tgctgctcca ccaacaggct aaatttggga gaaatggatc 1980tgactgcccg gacaagtttt gcttattcca gtctgaaacc aaaaaccttc tgttcaatga 2040caacactgag tgtctggcca gactccatgg caaaacaaca tatgaaaaat atttgggacc 2100acagtatgtc gcaggcatta ctaatctgaa aaagtgctca acctcccccc tcctggaagc 2160ctgtgaattc ctcaggaagt aa2182<210>20<211>3301<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(3301)<223>Hyg-LoxP基因序列
<400>20cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt120aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta180tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg240gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga300cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt360tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg420gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc480cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg540taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat600aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac660gactcactat agggagaccc aagcttggta ccgagctcgg atccactagt aacggccgcc720agtgtgctgg aattaattcg ctgtctgcga gggccagctg ttggggtgag tactccctct780caaaagcggg catgacttct gcgctaagat tgtcagtttc caaaaacgag gaggatttga840tattcacctg gcccgcggtg atgcctttga gggtggccgc gtccatctgg tcagaaaaga900caatcttttt gttgtcaagc ttgaggtgtg gcaggcttga gatctggcca tacacttgag960tgacaatgac atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagg tccaactgca 1020ggtcgagcat gcatctaggg cggccgcact agaggaattc cgcccctctc cctccccccc 1080ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgtgtttg tctatatgtg 1140attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 1200cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 1260tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 1320cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 1380tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 1440tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtagtcaac aaggggctga aggatgccca 1500gaaggtaccc cattgtatgg gaatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg 1560tttagtcgag gttaaaaaaa cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt 1620gaaaaacacg atgataagct tgccacaacc cgtaccaaag atggatagat ccggaaagcc 1680tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga 1740cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg 1800tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta 1860tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag 1920cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc 1980tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcaccg gtcgcggagg ccatggatgc gatcgctgcg 2040gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat cggtcaatac 2100actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca ctggcaaact 2160gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct gatgctttgg 2220gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc caacaatgtc 2280ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat gttcggggat 2340tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg tatggagcag 2400cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg gctccgggcg 2460tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg caatttcgat 2520gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc cgggactgtc 2580gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg tgtagaagta 2640ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtccga gggcaaagga atagagtaga 2700tgccgaccga acaagagctg atttcgagaa cgcctcagcc agcaactcgc gcgagcctag 2760caaggcaaat gcgagagaac ggccttacgc ttggtggcac agttctcgtc cacagttcgc 2820taagctcgct cggctgggtc gcgggagggc cggtcgcagt gattcaggcc cttctggatt 2880gtgttggtcc ccagggcacg attgtcatgc ccacgcactc gggtgatctg actgatcccg 2940cagattggag atcgccgccc gtgcctgccg attgggtgca gatctagagc tcgctgatca 3000gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 3060ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 3120cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 3180gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 3240
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<210>28<211>30<212>DNA<213>寡核苷酸<400>28ggctaagggt taatttattg aaatgactgg 30<210>29<211>26<212>DNA<213>寡核苷酸<400>29gctccttcta gttgtaacac tagtcc 26<210>30<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>30gaggagaagg ctgctgttgc20<210>31<211>21<212>DNA<213>寡核苷酸<400>31atttccaaag gagttcagca c 21<210>32<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>32ctctgatgcc gccgtgttcc20<210>33<211>21<212>DNA<213>寡核苷酸<400>33cggcaggagc aaggtgagat g 21<210>34<211>28<212>DNA<213>寡核苷酸<400>34ggggtaccct gcttcatccc cgtggccc 28<210>35<211>36<212>DNA<213>寡核苷酸<400>35ataagaatgc ggccgctcta gaactagtgg atcccc 3权利要求
1.一种定点打靶体细胞克隆家畜乳腺生物应器的制备方法，其特征在于，包括步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物从5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因、和3′同源臂序列；(b)筛选得到LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞；(c)将打靶载体与Cre表达质粒/Cre蛋白，共转染LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞，所述的打靶载体从5′→3′依次含有LoxP序列、外源基因、第二标记基因、LoxP序列，并筛选得到定点整合有外源基因的成纤维细胞；(d)将步骤(c)的成纤维细胞的细胞核，移植入家畜去核卵母细胞，再生成克隆动物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)和(c)之间，还包括以下步骤(i)将步骤(b)的成纤维细胞的细胞核，核移植入家畜去核卵母细胞，再生成克隆动物；以及(ii)从步骤(i)的克隆动物获取LoxP序列定点整合的克隆家畜胎儿成纤维细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家畜选自下组牛、羊、猪、兔。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记基因选自下组neo基因、hygro基因，并且在5′同源臂序列的上游或3′同源臂序列的下游还含有负筛选标记基因。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5′和3′同源臂序列选自下组β-乳球蛋白基因组序列、αsl-酪蛋白基因组序列、β-酪蛋白基因组序列。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，各同源臂序列的长度为2-10kb。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5′同源臂序列含有乳腺特异性表达基因的5′非翻译区和/启动子，或者所述的外源基因带有乳腺特异性表达调控序列。
8.一种家畜胎儿成纤维细胞，其特征在于，在所述细胞的基因组中定点插入有一构建物，其中插入位点是选自下组的基因区域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述构建物基本上由LoxP序列和标记基因构成，或者所述的构建物基本上由LoxP序列、外源基因和标记基因构成。
9.一种制备家畜成纤维细胞的方法，所述的成纤维细胞的β-酪蛋白基因位点定点插入LoxP序列，其特征在于，该方法包括步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物含有从5′→3′依次含有5′同源臂序列、LoxP序列、第一标记基因和3′同源臂序列；(b)筛选得到LoxP序列定点整合的家畜胎儿成纤维细胞。
10.一种转基因的非人哺乳动物，其特征在于，在该动物的细胞基因组中定点插入有一构建物，其中插入位点是选自下组的基因区域β-乳球蛋白、αsl-酪蛋白基因，而且，所述构建物基本上由LoxP序列和标记基因构成，或者所述的构建物基本上由LoxP序列、外源基因和标记基因构成。
全文摘要
本发明公开了一种通过Cre－LoxP定点打靶体细胞克隆家畜来制备作为乳腺生物反应器的方法。它包括(a)将含LoxP序列的构建物定点引入成纤维细胞；(b)筛选LoxP序列定点整合的细胞；(c)将含外源基因的打靶载体与Cre表达质粒/Cre蛋白，共转染LoxP序列定点整合的细胞，从而筛选得到定点整合外源基因的细胞；(d)再生成克隆动物。本发明还提供了相应的构建物和克隆细胞。本发明方法可高效地制备定点整合外源基因的乳腺生物反应器。
文档编号C12N15/87GK1502694SQ0214543
公开日2004年6月9日 申请日期2002年11月20日 优先权日2002年11月20日
发明者成国祥, 陈建泉, 吴国祥, 汤家铭, 赵建阳 申请人:上海杰隆生物工程股份有限公司