专利名称：芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法。
背景技术：
当代，发展可持续农业已成为全人类的共识。然而，长期以来化学农业、畜牧业和工业的发展已引起严重的环境污染，其中有机磷是重要的污染源之一。农业生产中有机磷农药、畜牧排泄物中的植酸磷及工业废水和生活污水中的多种有机磷等给环境造成巨大的负荷，制约了农业和水产等行业的发展。因此，消除有机磷污染成为世界各国关注的课题。
微生物降解是消除有机磷污染的重要途径。自然界中有机磷的分解很大程度上取决于微生物的作用，土壤中另一类主要的磷——难溶性无机磷也必须在微生物的作用下才解离并为作物吸收利用，因此微生物在土壤磷污染的清除和磷营养的有效化中起重要作用。但自然条件下，微生物的作用极其缓慢。利用现代技术对微生物进行改造，构建解磷工程菌，增强或诱导有机磷和无机磷的分解能力，消除磷污染，同时为作物提供磷营养，这是目前解决磷污染和磷营养的理想手段。改造微生物菌种，构建工程菌总体上讲有两种途径，即诱变和杂交。
1.构建微生物工程菌的原理和方法微生物现代育种主要原理是杂交和突变，由此产生二种微生物工程菌构建方法诱变育种和杂交育种。各分述如下诱变育种 其理论基础是诱发突变。常用的诱变剂有物理诱变剂(如射线、激光)、化学诱变剂(如HNO2、5-溴嘧啶)及生物诱变剂(如增变基因和转位子)等，它们大多通过改变DNA碱基配对情况或插入、缺失一段碱基而导致基因结构的改变，从而改变生物性状。诱变育种又可分为体内诱变和体外诱变。体外诱变也叫定位突变，指在体外使基因的特定区域有效地产生突变。突变株通过选育可获得多种工程菌。
体内诱变育种突变率较高，性能改良的幅度较大，而且应用方便、迅速、经济，所以被广泛采用，目前很多优良菌株都是用此法得到的。但是它需要强烈的物理化学因素作用，很容易严重损坏菌株的遗传背景，且定向性几乎没有，盲目性较大，有时也会对人体造成一定的伤害。体外诱变却具有极好的定向性，而且突变率高达百分之几，易于人为控制，所以目前已频频应用于工业生产。由此可见，随着生物技术的飞速发展和对育种要求的日益提高，体外诱变技术将进一步得到育种工作者们的青睐。
杂交育种 杂交育种的理论基础是杂交技术。目前常用的几种杂交育种方法有(1)原生质体融合主要用于自然状况下不能或很难进行杂交的细胞，可以突破种的界限。
(2)细胞杂交这是一种自然条件下就可进行的杂交方式。
(3)基因工程即DNA重组技术，是分子水平的杂交育种。其过程是，在体外将不同来源的DNA分子进行重组，再转入合适的宿主中表达。
杂交育种可以将不同来源的优良性状组合在一起，取长补短，更趋完美。其中原生质体融合技术可克服性和种的障碍，重组频率很高，重组子具有形形色色的种类，同时还可与其它育种方法配合使用。但此法操作过程较繁琐，难度较大，故非直接、有效的方法。细胞杂交技术较方便，但方向性和人为控制性尚不够理想，且无法克服性和种的障碍，所以也不是理想的途径。现代基因工程技术不但完全突破种和亲缘关系的约束，还可进行定向诱变，甚至开创全新的物种，获得各种基因工程菌。但基因工程技术用于育种，其前提是菌株的遗传背景必须清楚，因此对于大多生产菌，由于遗传背景复杂，基因工程技术在原有生产菌改良上应用并不多。对于微生物肥料，因为是将活的菌体直接施入土壤和环境中，因此在我国的菌肥标准中明确限制基因工程菌的应用。
以上各种诱变育种途径可获得多种工程菌。比较二种育种途径，诱变育种仍是构建工程菌的主要方式。射线(β、γ射线)、核辐射、化学诱变等是目前普遍使用的育种手段，但长期使用同一种诱变剂，菌种往往产生抗性，要想获得更大的变异就必须采用新的诱变源。离子束、激光、航空是最近发展起来的物种诱变方法，其中离子束是我国独创的构建工程菌株的新技术。2.离子束作用的原理和主要特点离子束注入生物效应是我国科技人员于80年代发现，并迅速投入育种应用领域，至今已发展为一种全新的育种技术。
离子束作用的原理在离子源中，气体(或蒸汽)放电产生等离子体，等离子体通过质量分析器分离获得相应的相同电荷离子，再经加速器获得不同能量的离子束，即载能离子束。目前，已经有N+、Ar+、He+、H+等多种离子束用于育种。载能离子束在靶室内(靶室必须为真空，以避免载能离子与空气的气体分子碰撞而发生能量损失或散射)作用于生物体，即可诱导变异。
载能离子诱发变异要经历多个过程。首先，荷能离子进入生物体后，与其中的多种原子和电子相互作用，逐渐将动能传给靶原子和电子，直至离子的动能完全散失并停止，这一过程称为离子的“慢化”，这是入射离子发生能量传递和沉积过程。靶原子如果在碰撞中获得足够能量将越过势垒而离开原来的位置，发生移位。慢化离子、移位原子可产生空位、填隙杂质原子和替代杂质原子，空位、移位原子、慢化离子与靶原子的重排和复合，可形成新的分子和基团，产生丰富的突变体。其次，电荷交换效应，入射离子在靶中慢化后，与靶原子的每一次碰撞都会失去一定的电子或从靶中俘获电子，从而发生电荷交换。电荷交换常引起生物体表面电离基团数量、离解常数和拓扑学排列的变化，导致细胞与细胞之间的作用，Ca2+与细胞膜的相互作用和细胞膜离子通透性的改变，从而引起一系列生理变化。此外，离子注入还可引发自由基损伤。荷能离子注入生物体时，由于靶分子的激发、电离，在碰撞范围将产生自由基。活泼的自由基容易与靶分子发生加成、抽氢和电子转移等反应，从而引起生物体发生结构和功能改变，引起突变。可见，离子(H+、N+、Ar+等)注入细胞后，通过电、能、质的共同作用，不仅影响细胞的生理生化功能，更重要的是使细胞中的染色体畸变、DNA和RNA链损伤、断裂，引起酶的突变或激活，产生多种突变，从而为工程菌的获得提供了基础。
离子束作用的主要特点 由于质、能、荷三因子的协同作用，离子束注入引起大量受体原子移位、重组和生物分子的变异，形成新的分子结构和基团，产生丰富的基因突变，因而离子束注入可以在损伤轻的情况下获得较高的突变率。具体地，离子束诱变具有如下特点首先，与射线诱变类似，离子束注入具有能量沉积引起的诱变效应；与射线诱变不同，离子束注入还存在动量交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子移位、重排或基因缺失，产生基因突变；其次，类似化学诱变，离子束注入产生的慢化离子、移位原子与本底元素复合可造成化学变异；此外，离子束注入过程的电荷交换可引起生物分子电子转移和自由基反应，引发生物诱变。可见，离子束注入兼具物理、化学和生物诱变的特性，这种复合诱变显著提高了诱变频率和效率，如在相同存活率下，离子束注入伤寒类沙门菌，其营养缺陷型突变频率和诱变效率比γ射线分别提高14～45％和16～35％。总之，离子束诱变具有多种优越性，表现为高激发性、计量集中和可控性，细胞损伤轻、突变率高、突变谱广，可进行定向诱变，已成为当代种质改良和育种的重要新手段。
离子束应用现状 离子束在遗传改良上应用最早的是诱变育种，其中主要是植物种质的改良。在工业微生物菌种改良上，应用离子束注入也构建不少高效工程菌，并在工业生产中发挥了重要作用。现有的生产菌株对以往常用的物理化学诱变方法往往表现不同程度的抗性，而离子束作为一种新的诱变源，表现出很好的应用效果。中国科学院等离子体物理研究所与国内数十个单位合作，以生产使用的高产菌株为出发菌，大幅度提高了多种工业微生物发酵产物的产量，已投入生产的微生物菌种有3个。通过离子束诱变，浙江农业科学研究院将糖化酶生产菌的酶活从1.5万发酵单位提高到2万单位；姚建铭等将利福霉素菌株的发酵水平提高了40％；许安等用此法获得的维生素C生产菌创国内外二步法发酵糖酸转化率新高，摩尔转化率最高达97.5％。可见，离子束对微生物的诱变效果极为显著。
尽管离子束诱变在工业微生物育种上获得了许多高产工程菌，但在农业和环境微生物方面几乎还没有涉入。将离子束注入诱变技术应用于农业和环境微生物工程菌的构建，可望有效地突破现有菌株的性状，获得全新的生物工程菌，提高微生物改善土壤供肥和清除环境污染的能力，从而开创农业和环境微生物菌株改良和育种的新途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法。
构建芽孢杆菌解磷工程菌株的方法的步骤为1)在斜面上活化培养芽孢杆菌，所用培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，活化后的细菌，直接用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱成菌悬液；2)将菌悬液离心，收集孢子，用生理盐水或磷酸缓冲液将孢子稀释并涂布于无菌的空白平皿或载玻片上，干燥0.5～2h；3)将N+、H+、Ar+或He+离子束注入芽孢杆菌，所注入的离子能量为10～30KeV、剂量为5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、无菌条件下进行间歇脉冲式注入，每次脉冲间隔50～100秒；4)用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱孢子，并稀释至一定浓度，在NBRIY培养基上进行筛选，然后经过鉴定，获得高效分解有机磷的工程菌株。
另一种构建芽孢杆菌解磷工程菌株的方法的步骤为1)在无氮培养基斜面上活化培养芽孢杆菌，活化后的细菌，接种于产无荚膜芽孢的液体培养基中，25～30℃、150～250rpm/min培养36～72h，离心收集孢子；
2)将孢子用生理盐水或磷酸缓冲液稀释并涂布于无菌的空白平皿或载玻片上，干燥0.5～2h；3)将N+、H+、Ar+或He+离子束注入芽孢杆菌，所注入的离子能量为10～30KeV、剂量为5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、无菌条件下进行间歇脉冲式注入，每次脉冲间隔50～100秒；4)用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱孢子，并稀释至一定浓度，在NBRIY培养基上经过筛选后，在NBRIP培养基上进行复筛，最后通过鉴定，获得高效分解有机磷、无机磷或无机钾的工程菌株。
本发明的优点是针对目前有机磷污染严重的问题，应用诱变效率高、突变幅度大的新型诱变技术——离子束注入构建工程菌，增强芽孢杆菌分解有机磷和无机磷的能力，实现土壤自净和营养自给的双重功能。硅酸盐细菌是目前普遍应用于微生物钾肥生产的芽孢杆菌，通过离子束注入，构建新的工程菌株，可增强其对土壤磷的分解，提高该菌提供有效磷和钾的功效。通过离子束注入所构建的工程菌株对有机磷或无机磷的分解能力分别提高15～45％和10％～25％。
附图是芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法的流程图。
具体实施例方式
离子束诱变是目前国际上先进的诱变技术，利用该技术对芽孢杆菌进行改造，构建可分解有机磷或无机磷的工程菌，为生产可高效分解有机磷或无机磷的新型微生物磷肥或磷钾复合肥提供优良种子，促进微生物磷肥或磷钾复合肥的品质提高及其推广应用，加速生态农业发展进程，同时为微生物肥料生产菌的改良和育种提供新方法。
诱变育种有两个技术关键其一，创造大量有效的突变子其二，建立快速、准确而方便的高效筛选子。本发明通过特定的离子束注入进行诱变，获得大量高突变率的变异株，然后通过有效的筛选培养基进行筛选，获得工程菌株。具体步骤如下1、细菌孢子的培养及前处理荚膜的存在严重影响诱变效果。不产荚膜的芽孢杆菌的孢子直接在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养获得。产荚膜的芽孢杆菌如硅酸盐细菌则须在特定的培养基上培养。
1.1不产荚膜的芽孢杆菌的孢子培养
1)牛肉膏蛋自胨培养基牛肉膏5.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 5.0g；琼脂粉18～20g；蒸馏水1000；pH7.0～7.5。
2)在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上接种芽孢杆菌，25～30℃培养24～48h；3)用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱斜面上的菌落，5000～8000rpm/min离心3～5min，收集孢子，用生理盐水洗1～3次，稀释孢子至一定浓度；取该孢子悬液0.3～0.5mL涂布于无菌的空平皿上，充分涂匀后，在超净工作台上通风干燥0.5～1h，立即进行离子束注入处理。
1.2芽孢杆菌的孢子培养1)菌种活化 在无氮培养基上接种种子菌，28～30℃培养24～36h；无氮培养基硅酸铝钾1.2～2.0g；蔗糖5.0～10g；Na2HPO41.0～2.0g；FeCl30.003～0.005g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；琼脂18～20g；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。
2)生产芽孢 无荚膜芽孢的液体生产培养基，500ml三角瓶装培养液50ml，接种斜面洗脱的种子菌液，28～30℃振摇培养，转速200～250转/min，培养48～72h；无荚膜芽孢的生产培养基淀粉10～20g；(NH4)2SO41.0～2.0g；MgSO4·7H2O 0.5～1.0g；K2HPO40.5～1.0g；FeCl30.005～0.008g；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。
3)前处理5000～8000rpm/min离心3～5min，收集孢子，用生理盐水洗1～3次，稀释孢子至一定浓度；取该孢子悬液0.3～0.5mL涂布于无菌的空平皿上，充分涂匀后，在超净工作台上通风干燥0.5～1h，立即进行离子束注入处理；2、离子束注入1)离子束种类、注入剂量、出发菌株的特性都会影响诱变效率，因此必须根据具体的离子束类型、菌株种类确定最佳离子注入剂量。离子束可选择N+、H+、Ar+或He+等离子作为注入离子，注入离子的能量为10～30KeV，剂量为5～300×1014ions/cm2。离子注入仓真空度为1×10-2～4.2×10-3Pa；间歇脉冲式注入，每次脉冲间隔55～90秒。
2)在上述注入条件下，采用系列剂量对芽孢杆菌进行离子注入处理，用生理盐水洗脱处理过的孢子，在牛肉膏蛋白胨或无氮培养基上测定细胞活性，进行回归分析，制作细胞存活力/剂量回归曲线；3)根据细胞存活力/剂量回归曲线，以55～95％致死率的相应剂量为诱变注入剂量，在无菌条件下进行离子注入处理；4)诱变后的孢子立即用生理盐水洗脱，并稀释至一定浓度；3、筛选方法1)筛选对诱变的芽孢杆菌接种于NBRIY筛选培养基上，25～30℃培养48～72h，有机磷降解菌将有机磷降解产生不透明圈或透明圈，因此根据不透明圈或透明圈的有无和大小就可确定菌株分解有机磷的能力。选择不透明圈或透明圈较大的菌落作为目标菌株。
NBRIY培养基配方为葡萄糖10.0～20.0g；卵磷脂或植酸磷2.0～5.0g或有机磷农药100～1000mg；(NH4)2SO40.5～2.0g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；KCl 0.2～0.3g；NaCl 0.2～0.3g；MnSO4·7H2O 0.003～0.005g；FeSO4·7H2O0.003～0.005g；CaCO32.0～5.0g；琼脂18.0～20.0g；蒸馏水1000mL；pH7.0～7.5。
2)复筛芽孢杆菌经上述NBRIY培养基上筛选后，将目标菌落转接至NBRIP培养基上复筛，该培养基是经改良的无机磷和钾分解菌的筛选培养基，其中溴酚蓝或甲基红作为酸碱指示剂，指示菌落产酸能力，产酸菌株出现黄色晕圈。晕圈越大，产酸能力越强，分解难溶性无机磷和钾的能力就越强。黄色晕圈较大的菌落为目标菌落。
NBRIP培养基配方为葡萄糖10.0～20.0g；磷矿粉2.0～5.0g；(NH4)2SO40.1～0.5g；MgCl2·6H2O 2.0～5.0g；MgSO4·7H2O 0.25～0.5g；琼脂18.0～20.0g；溴酚蓝或甲基红0.002～0.010g；蒸馏水1000mLpH7.0～7.5；3、菌株鉴定1)磷分解能力测定 对以上筛选得到的目标菌落分别进行液体培养，培养96～120h后，分别测定游离磷、生物量磷和总磷含量，即可计算分离菌株分解有机磷或无机磷的能力。磷的检测用钼锑抗比色法。有机磷或无机磷的分解能力显著增强的菌株为工程菌株。
2)遗传稳定性鉴定对工程菌株在NBRIY固体培养基上连续转接3～7代，对第3～7代菌株分别测定分解有机磷和无机磷的能力，在3～7代以内能够保持优良性状的菌株表明具有较好的遗传稳定性，可作为生产菌株。
在无氮培养基上活化KNP414，28～30℃培养30～36h后，接种至无荚膜芽孢的液体培养基中，28～30℃、200～250转/min培养48～56h，离心收集孢子，稀释并涂布于无菌的空平皿上，自然干燥0.5～1h；用能量为15～25KeV、剂量为60～200×1014ions/cm2的H+在真空(真空度为3×10-2～5×10-3pa)、无菌条件下间歇脉冲式注入；然后用生理盐水洗脱孢子，在NBRIY培养基(含卵磷脂)上进行筛选，随即在NBRIP培养基上复筛，经过鉴定，获得2株高效分解无机钾、无机磷和有机磷的工程菌株KNP41401和KNP41402。KNP41401分解无机钾、无机磷和有机磷的能力分别提高15～20％、18～25％和20～40％，KNP41402分别提高18～20％、20～25％和25～45％。
权利要求
1.一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于它的步骤为1)在斜面上活化培养芽孢杆菌，所用培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，活化后的芽孢杆菌，直接用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱成菌悬液；2)将菌悬液离心，收集孢子，用生理盐水或磷酸缓冲液稀释孢子并涂布于无菌的空白平皿或载玻片上，干燥0.5～2h；3)将N+、H+、Ar+或He+离子束注入芽孢杆菌，所注入的离子能量为10～30KeV、剂量为5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、无菌条件下进行间歇脉冲式注入，每次脉冲间隔50～100秒；4)用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱经离子束注入处理过的孢子，并稀释至一定浓度，在NBRIY培养基上进行筛选，然后经过鉴定，获得高效分解有机磷的工程菌株。
2.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的离子束注入的前处理方法为首先用生理盐水或磷酸缓冲液清洗孢子1～3次，离心，再用生理盐水或磷酸缓冲液悬浮，并稀释至103～106个·L-1，然后涂布于直径为9cm的空白平板或载玻片上，在超净台上通风干燥0.5～2h。
3.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的工程菌株的筛选方法步骤为1)制备筛选培养基，其配方为葡萄糖10～20g；卵磷脂或植酸磷2.0～5.0g或有机磷农药100～1000mg；(NH4)2SO40.5～2.0g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；KCl 0.1～0.3g；NaCl 0.1～0.3g；MnSO4·7H2O 0.001～0.005g；FeSO4·7H2O0.001～0.005g；CaCO31.0～5.0g；琼脂粉18～20g；蒸馏水1000mL；pH7.0～7.5。2)将经离子束注入处理过的孢子接种于筛选培养基上，25～30℃培养48～96h。出现不透明晕圈或透明圈并且圈较大的菌落为目标菌落。
4.根据权利要求1所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的鉴定方法的步骤为1)将筛选获得的单菌落接种于NBRIY液体培养基中，25～30℃、150～250转/min，培养96～120h，离心，分别测定游离磷、生物量磷和总磷含量，有机磷的降解能力增强5～15％或以上的菌株为工程菌株。2)对以上工程菌株在NBRIY固体培养基上连续转接3～7代，对第3～7代菌株测定分解有机磷的能力，能够保持较高的有机磷降解能力的菌株表明具有较好的遗传稳定性，可作为生产菌株。
5.一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于它的步骤为1)在无氮培养基斜面上活化培养芽孢杆菌，活化后的细菌，接种于产无荚膜芽孢的液体培养基中，25～30℃、150～250转/min培养36～72h，离心收集孢子；2)将孢子用生理盐水或磷酸缓冲液稀释并涂布于无菌的空白平皿或载玻片上，干燥0.5～2h；3)将N+、H+、Ar+或He+离子束注入芽孢杆菌，所注入的离子能量为10～30KeV、剂量为5～300×1014ions/cm2，在2×10-2～6×10-3Pa真空、无菌条件下进行间歇脉冲式注入，每次脉冲间隔50～100秒；4)用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱孢子，并稀释至一定浓度，在NBRIY培养基上经过筛选后，在NBRIP培养基上进行复筛，最后通过鉴定，获得高效分解有机磷、无机磷和钾的工程菌株。
6.根据权利要求5所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的无氮培养基和产无荚膜芽孢的液体培养基配方分别为无氮培养基硅酸铝钾1.2～2.0g；蔗糖5.0～10g；Na2HPO41.0～2.0g；FeCl30.003～0.005g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；琼脂18～20g；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。无荚膜芽孢的液体培养基淀粉10～20g；(NH4)2SO40.5～2.0g；MgSO4·7H2O0.3～1.0g；K2HPO40.5～20g；FeCl30.005～0.010g；琼脂粉18～20g；水1000ml；pH7.0～7.5。
7.根据权利要求5所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的离子束注入的前处理方法为首先用生理盐水或磷酸缓冲液清洗孢子1～3次，离心，再用生理盐水或磷酸缓冲液悬浮，并稀释至103～106个·L-1，然后涂布于直径为9cm的空白平板或载玻片上，在超净台上通风干燥0.5～2h。
8.根据权利要求5所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的工程菌株的筛选方法步骤为1)制备筛选培养基，其配方为葡萄糖10～20g；卵磷脂或植酸磷2.0～5.0g或有机磷农药100～1000mg；(NH4)28O40.5～2.0g；MgSO4·7H2O 0.3～0.5g；KCl 0.1～0.3g；NaCl 0.1～0.3g；MnSO4·7H2O 0.001～0.005g；FeSO4·7H2O0.001～0.005g；CaCO31.0～5.0g；琼脂粉18～20g；蒸馏水1000mL；pH7.0～7.5。2)将经过离子束注入处理过的孢子接种于筛选培养基上，25～30℃培养48～96h。出现不透明晕圈或透明圈并且圈较大的菌落为目标菌落。
9.根据权利要求5所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的复筛方法的步骤为1)制备复筛培养基，其配方为葡萄糖10～20g；钾矿粉、磷矿粉或Ca3(PO4)22.0～5.0g；(NH4)2SO40.1～1.0g；MgCl2·6H2O 2.0～5.0g；MgSO4·7H2O0.25～0.5g；琼脂粉18～20.0g；溴酚蓝或甲基红指示剂0.002～0.005g·L-1；蒸馏水1000mLpH7.0～7.5。2)将以上筛选培养基筛选获得的菌落接种于复筛培养基上，28～30℃培养48～96h。出现黄色晕圈并且晕圈较大的菌落为目标菌落。
10.根据权利要求5所述的一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法，其特征在于所说的鉴定方法的步骤为1)将复筛获得的单菌落接种于NBRIY液体培养基中，25～30℃、150～250转/min，培养96～120h，离心，分别测定游离磷、生物量磷和总磷含量，有机磷的降解能力增强5～15％或以上的菌株为工程菌株。2)将以上鉴定获得的菌株接种于NBRIP液体培养基中，25～30℃、150～250转/min培养96～120h，离心，分别检测分解无机磷和钾的能力，无机磷和钾的分解能力较出发菌株分别增加5～15％或以上的菌株为工程菌株。3)对以上工程菌株分别在NBRIP和NBRIY固体培养基上连续转接3～7代，对第3～7代菌株分别测定分解无机钾、无机磷和有机磷的能力，能够保持较高的无机磷、无机钾和有机磷分解能力的菌株表明具有较好的遗传稳定性，可作为生产菌株。
全文摘要
本发明公开了一种芽孢杆菌解磷工程菌株的构建方法。构建芽孢杆菌解磷工程菌株的方法的步骤为1)在斜面上活化培养芽孢杆菌，所用培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，活化后的细菌，直接用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱成菌悬液；2)将菌悬液离心，收集孢子，用生理盐水或磷酸缓冲液将孢子稀释并涂布于无菌的空白平皿或载玻片上，干燥；3)在真空、无菌条件下将离子束注入芽孢杆菌；4)用生理盐水或磷酸缓冲液洗脱孢子，获得高效分解有机磷的工程菌株。本发明应用诱变效率高、突变幅度大的新型诱变技术——离子束注入构建工程菌，增强芽孢杆菌分解有机磷和无机磷的能力，实现土壤自净和营养自给的双重功能。
文档编号C12N13/00GK1410528SQ02145369
公开日2003年4月16日 申请日期2002年11月21日 优先权日2002年11月21日
发明者陈集双, 胡秀芳, 唐爱菊, 唐骏, 陈益锦 申请人:浙江大学