专利名称：从分化细胞制备自体造血干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，属基因技术领域。
背景技术：
干细胞是一种功能未特定的细胞，具有两个特性即具有无限的自我更新能力，能够分化为一种以上的高度分化子细胞的能力，实际上包括了从胚胎发育到成人生长发育过程中各种未分化成熟细胞。既包括生命起源细胞，组织器官发育的原始细胞，也包括成体组织更新换代、损伤修复的种子细胞。因此，干细胞具有多种潜在的用途，包括细胞治疗、用于制造可供移植的组织和器官、基因治疗以及药物筛选等。成体干细胞是一类功能未特定分化的或未分化的细胞，其存在于多种成体组织中。成体干细胞能够分化成为所属组织中的几乎所有细胞类型，而且可以跨胚层分化，具有多向分化能力。成体干细胞常见于骨髓、血液、脑、角膜、牙齿、肝脏、皮肤等。胎盘中具有大量造血干细胞，可以用来移植给患有严重白血病等血液系统疾病的病人来治疗血液疾病，具有非常重要的临床应用。但具有两个缺点，一是细胞量相对较少， 儿童用量可以，但对成人使用则量严重不足，不能用于成人移植；第二，最重要的是，胎盘造血干细胞具有自己的白细胞抗原(HLA)，虽然免疫原性较小，但也存在免疫抑制反应。既然造血干细胞具有重要的用途，能不能构建具有自己的HLA的患者的造血干细胞，解决免疫抑制危险呢？因此存在制备自体造血干细胞的需求。
发明内容
本发明基于这样的认识，即已有的胚胎干细胞的胞质能使分化的细胞发生重编程，成为多能干细胞，那么多能干细胞的胞质是不是也具有这样的功能呢？而且，如果发生重编程，得到的杂种细胞是否与供者细胞具有相同的HLA，即具有免疫相容性，新产生的多能干细胞能否分化形成与所供细胞来源相同的白细胞抗原，由此可以避免在患者体内产生的免疫排斥反应。因此，本发明旨在解决上面提到的解决免疫排斥反应和干细胞来源问题， 提供一种从分化细胞制备自体造血干细胞的方法。本发明的技术方案是一种从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，包括以下步骤
a、从胎盘中获取造血干细胞；
b、将造血干细胞去核，获取胞质；
C、将所获胞质与分化细胞进行融合，以产生胞质杂种细胞； d、培养所述胞质杂种细胞以产生造血干细胞。另外，在d步骤前，还可以添加将所述胞质杂种细胞转移至饲养层上扩增的步骤， 所述的饲养层可以为胎盘贴壁细胞饲养层。上述分化细胞包括皮肤成纤维细胞、毛囊细胞、毛囊干细胞等分化细胞。本发明利用胞质互作原理，将脐血造血干细胞分离纯化，密度梯度离心去核，造血干细胞胞质可以和成纤维细胞核相互作用，对细胞核重编程，产生融合造血干细胞，可以构建与患者HLA配型一致的融合杂合造血干细胞，经过筛选扩增，可以作为临床移植造血干细胞的一个新的来源，其来源广泛，并且没有免疫排斥反应。本发明方法简单，经济方便，为白血病等疾病的治疗提供了新的基础资料和理论依据，更为临床产生患者自体造血干细胞提供了一个新的方式。下面结合附图及实施例对本发明进行详细地说明，虽然本发明允许有多种不同形式的实施方式，但本发明将详细说明至少一种实施方式和其他可能的替代方法，同时，本发明公开的内容应该被认为是在举例说明本发明的方法和原则，而不是将本发明限制在所描述的具体实施方式
中。
图1是融合后造血干细胞⑶34+细胞体外培养的各阶段形态学特征。
具体实施例方式本发明产生自体造血干细胞的主要思想是将来自胎盘的造血干细胞与分化细胞融合而产生胞质杂种细胞，其是多能干细胞，所产生的胞质杂种细胞表达供体细胞来源的主要组织相容性抗原(MHC)，特别是表达与所述细胞相同的白细胞抗原(HLA)。本发明使用的分化细胞可以是皮肤成纤维细胞、毛囊细胞、毛囊干细胞等，而不使用淋巴细胞。这是由于皮肤成纤维细胞相对其他细胞来源来说比较简单，伤害性较小。而且胞质较少，因此使用皮肤成纤维细胞与造血干细胞的胞质进行融合是比较合适的。一、从脐带血和胎盘中获取造血干细胞 1、脐带血(UCB)的采集
用60ml的注射器吸入2ml肝素，装上16 口径的针头，从脐带静脉中收集UCB，立即颠倒几次进行混勻，防止血液凝固。2、MNC的制备和培养
(1)向每个50ml离心管中加入15mlUCB，用20mlPBS进行稀释。(2)加入15mlFicoll，用导管将Ficoll置于UCB的底部，使之形成一个清晰的界(3)离心 740g，室温 30min。(4)离心后，MNC在上部的黄色血清层和底部的FIcoll之间形成一层淡黄色的雾状悬浮层，用吸头放在淡黄色的悬浮层上，轻轻吸出MNC，然后将MNC转入装有培养基的离心管中。(5)将MNC在室温以515g离心lOmin，弃去上清。将沉淀的细胞团轻轻吹散，重悬细胞。(6)重复步骤5—次。 (7)将MNC悬液混勻，取30ul细胞，胎盘兰染色，计数。
3、磁性分选造血干细胞(⑶34+细胞)
(1)用PBS调整MNCs浓度为2X 108/ml，转移细胞悬液至5ml的聚丙烯i^alcon管内；
(2)加入Easykp Human CD34 Positive Selection Cocktail 10μ1，轻轻混勻后室温下作用15min ；
(3)加入EasyS印MagneticNanoparticles 5 μ 1，轻轻混勻后室温下作用IOmin ；加 PBS补足至2. 5ml，混勻；
(4)将!^alcon管置于fesykpMagnet磁场中，室温静置5min，倾去液体；PBS反复洗涤4次，适量PBS混勻细胞，计数。二、将造血干细胞去核，获取胞质
1、将造血干细胞(⑶34+细胞)先在无钙镁PBS( —)溶液中孵育5min之后，再经0. 25% 胰蛋白酶+0. 04% EDTA溶液消化成单个细胞。2、加入DMEM中和消化作用，1500r/min离心5min，弃掉上清液，再向离心管中加入 Iml含细胞松弛素B和0. 5% DMSO的DMEM培养液，重新制成细胞悬液，密度调节至1 X 10 个/ ml，置培养箱培养lh，后再移至已准备好的梯度管上部。3、将含有⑶34+细胞悬液的Ficoll密度梯度离心管置提前温育至30°C的高速离心机离心，转速为25000r/min，离心50min。4、离心结束后，将离心管中的溶液全部倾入小烧杯，再加入20ml DMEM培养液，离心1500r/min，5min，弃上清液后加入Iml DMEM培养液，将此细胞片段悬液移入四孔板，置
培养才苜培养。三、将所获细胞胞质与分化细胞进行融合，产生胞质杂种细胞 1、分化细胞(成纤维细胞)的获取
(1)手术切取患者腹部或下肢的皮肤2-3cm2，置于含有100IU/ml氨苄青霉素和IOOmg/ ml硫酸链霉素的PBS中，反复几次PBS漂洗后，剪弃脂肪和结缔组织。将皮肤剪成Imm3左右大小的小块，加入含有胶原酶、透明质酸酶的DMEM中，放置4度冰箱过夜。(2)加入含有0. 25%胰酶和0. 02%EDTA的消化液，37°C消化20min，加入含血清培养液终止。1200rpm离心IOmin收集细胞。用含有15%胎牛血清的DMEM进行培养，接种细胞密度2 X 105，细胞接种，37°C，5%C02，CO2培养箱条件下培养。(3)皮肤成纤维细胞的传代培养，当培养的皮肤成纤维细胞长成单层后，用无钙镁离子的PBS漂洗几次，加入含有0. 25%胰酶和0. 02%EDTA的消化液消化，2-5min。 加入含有胎牛血清的DMEM培养基吹打终止消化，以1 3的比例传代，置于37°C，5%C02, CO2培养箱条件下培养。2、胞质与分化细胞融合
(1)取出分离好的胞质，与培养好的成纤维细胞，再用无血清的DMEM洗两次，分别离心并计数。在室温条件下，按10 1在离心管中混合两种细胞，然后离心lOmin，1000转 /min ο(2)去上清液，轻轻扣振离心管，使细胞沉渣散开，用吸管滴入融合剂(50%聚乙二醇PEG溶液)，0. 5ml，旋转离心管或用吸管尖轻轻搅拌，尽可能增加细胞暴露、接触PEG的机石。(3)连续滴加10次无血清培养液后(融合过程不超过6 7 min)，离心去上清，再加 IOml含10%FCS的DMEM培养液悬浮，离心lOmin。(4)去上清的细胞沉渣，用含10%FCS的DMEM培养液洗两次后，再悬浮。并在37°C、 5%C02、饱和湿度的0)2培养箱中培养。倒置显微镜逐日观察细胞形态和生长概况。并记录拍照。四、培养所获上述杂质细胞以产生造血干细胞。在上述(四)步骤前，还可以采用如下步骤将所述胞质杂种细胞转移至饲养层上扩增，饲养层可以为胎盘贴壁细胞饲养层。一、胎盘贴壁细胞饲养层的制作
1、无菌条件下分离健康足月产新生儿新鲜胎儿胎盘绒毛膜小叶组织，用D-Hank’s液反复冲洗，将绒毛膜组织剪碎，胰酶-EDTA 4°C消化过夜；
2、将组织块置于含有15%血清、2mM/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素，10(^g/ml链霉素的α -MEM培养基中，在5% CO2、饱和湿度、37 °C条件下培养。3、每隔3 4 d换液一次，待细胞融合达70 80%时，常规消化后按1 2传代，培养皿底部放置玻片并用明胶包被，取传代3次以上的细胞进行免疫检测及诱导分化鉴定，丝裂霉素处理待用。二、杂质细胞在胎盘贴壁细胞饲养层上的扩增
将杂质细胞置于上述饲养层上，接种于培养瓶中。培养液内含IOml IMDM，在37°C， 5%C02，饱和湿度下培养扩增。实验结果参考图1所示。图1是融合后造血干细胞⑶34+细胞体外培养的各阶段形态学特征，其中 A 造血干细胞⑶34+细胞体外培养2d，可见细胞分裂GOO X)；
B 造血干细胞⑶34+细胞体外培养3d，可见细胞簇形成GOO X)；
C、D 造血干细胞⑶34+细胞体外培养6d，可见致密细胞集落形成QOO X)；
E、F 造血干细胞⑶；34+细胞体外培养10d，可见CFU-GEMM形成(100X)。
权利要求
1.一种从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，包括以下步骤a、从胎盘中获取造血干细胞；b、将造血干细胞去核，获取胞质；C、将所获胞质与分化细胞进行融合，以产生胞质杂种细胞； d、培养所述胞质杂种细胞以产生造血干细胞。
2.根据权利要求1所述的从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，其特征是，包括在d 步骤前将所述胞质杂种细胞转移至饲养层上扩增的步骤。
3.根据权利要求2所述的从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，其特征是，所述饲养层为胎盘贴壁细胞饲养层。
4.根据权利要求1所述的从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，其特征是，所述分化细胞包括皮肤成纤维细胞、毛囊细胞、毛囊干细胞。
全文摘要
本发明公开了一种从分化细胞制备自体造血干细胞的方法，包括a、从胎盘中获取造血干细胞，b、将造血干细胞去核获取胞质，c、将所获胞质与分化细胞进行融合，以产生胞质杂种细胞，d、培养所述胞质杂种细胞以产生造血干细胞等步骤，本发明利用了胞质互作原理，将造血干细胞分离心去核后和成纤维细胞核相互作用，对细胞核重编程，产生融合造血干细胞，可以构建与患者HLA配型一致的融合杂合造血干细胞，可以作为临床移植造血干细胞的一个新的来源，本发明方法简单、经济方便，为白血病等疾病的治疗提供了新的基础资料和理论依据，更为临床产生患者自体造血干细胞提供了一个新的方式。
文档编号C12N15/07GK102321571SQ20111028111
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者王跃嗣 申请人:王跃嗣