人类免疫缺陷病毒嵌合蛋白质的重组痘病毒的制作方法

专利名称：人类免疫缺陷病毒嵌合蛋白质的重组痘病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，特别涉及开发预防或治疗获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的疫苗。本发明公开了用于治疗和预防AIDS的嵌合基因及表达该基因的鸟痘病毒(Fowlpox Viruses)。
现有技术HIV是AIDS的病原(Popovic M，Sarngadharan M，Read G和Gallo RC.Science 1984，224497-500)。该病毒不仅感染CD4+T细胞(Klatzman D，Barre Sinoussi F，Nugeyre MT，Dauguet C，Vilmer E，Griscelli C，Brun-Vezinet F，Rouzioux C，Gluckman，JD，Chermannn JC和Montagnier L.Science 1984，22559-63)，而且感染其它细胞类型，例如巨噬细胞、树突状细胞、小胶质细胞和上皮细胞。
尽管在感染全过程中存在高水平抗体，HIV仍可逃脱宿主免疫应答。HIV引起宿主长期的严重免疫缺陷，使其对机会感染的侵袭极为敏感。
超过3千6百万人正忍受HIV/AIDS，每天的16 000宗感染中，94％发生在发展中国家。(UNAIDS.Report on the global HIV/AIDSepidemic，June 2000)。由于这些惊人的数字，并且由于该病缺少有效、可负担得起的治疗，急需开发HIV疫苗。
HIV的若干特性使此项工作很困难，其中最重要的或许是其抗原的高度遗传变异性，特别是包膜糖蛋白(gp160)，涉及感染过程以及中和抗体所靶向的主要结构域位于其中。
基于中和抗体的候选疫苗已经能够保护黑猩猩防止HIV(BermanPW，Gregory TJ，Lavon R，Nakamura GR，Champe MA，Porter JP，Wurm FM，Hershberg RD，Cobb GK和Eichberg JW.Nature 1990，345622-625；Girard M，Kieny MP，Pinter A；Barre-SinoussiF，Nara P，Kolbe H，Kusumi K，Chaput A，Rainhart T，Muchmore E，Ronco J，Kaczorek M，Gomard E，Gluckman JC和Fultz PN，PNAS 1991，88542-546)。然而，这些实验是在近乎理想的条件下进行的，病毒攻击的剂量、途径和计时与自然感染相差悬殊。此外，那些免疫原不能防止趋异的HIV分离物，并且产生的抗体不能中和主要的HIV分离物。
各种候选疫苗已经进行了I期和II期临床试验评价(JohnstonMI.AIDS vaccine developmentstatus and future directions.1999.XII Colloque des Cent Gardes.Ed.Girard M and DodetB.161-163)。其中大多基于包膜蛋白质gp160和gp120。只有一种基于重组gp120的疫苗，目前在泰国和美国进行III期效能评价。先前的试验结果表明，如果有的话，只能期望该疫苗非常有限的保护。
这些严重限制了可防止各种HIV分离物和亚型的体液应答的产生，最近几年，研究人员的努力主要转向开发能主要刺激免疫系统细胞途径、特别是针对HIV抗原的细胞毒T细胞的候选疫苗。
强烈提示抗HIV CT1临床相关性的实验发现有给予已接种猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)的猕猴抗CD8单克隆抗体，可显著提高病毒血症的水平(Matano T，Shibata R，Simeón C，Connors M，Lane C，Martín M，Administration of an Anti-CD8 monoclonal antibodyinterferes with the clearance of chimeric Simian/HumanImmunodeficiency virus during primary infections of rhesusmacaques，J Virol，1998，72，1164-169)；在HIV感染的个体(Borrow，P.，H.Lewicki，X.Wei，M.S.Horwitz，N.Peffer，H.Meyers，J.A.Nelson，J.E.Gairin，B.H.Hahn，M.B.A.Oldstone，and G.M.Shaw.1997.Antiviral pressure exertedby HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes(CTLs)duringprimary infection demonstrated by rapid selection of CTLescape virus.Nature Med.3205-211.)和SIV感染的猕猴中(Allen，T.M.，O.C.DH，P.Jing，J.L.Dzuris，B.R.Mothe，T.U.Vogel，E.Dunphy，M.E.Liebl，C.Emerson，N.Wilson，K.J.Kunstman，X.Wang，D.B.Allison，A.L.Hughes，R.C.Desrosiers，J.D.Altman，S.M.Wolinsky，A.Sette，和D.I.Watkins.2000.Tat-specific cytotoxic T lymphocytes selectfor SIV escape variants during resolution of primaryviraemia.Nature.407386-90)中，均选择到能够逃避CD8+T细胞识别的病毒变体；定居注入HIV-1重组痘苗病毒(VV)的自愿者PBMC的SCID小鼠，可以在没有中和抗体的情况下防止攻击(VanKuyk R，Torbett B，Gulizia R等人，Human CTL specific forthe nef protein of HIV protect hu-PBL-SCID mice from HIVinfection.AIDS Res Hum Retroviruses，1993；9(suppl 1S77)；较高比例的接触而未感染人员呈现特意性针对HIV蛋白质的细胞免疫应答，非洲的性工作者(Rowland-Jones SL，J Sotton，KAriyoshi，T Dong，F Gotch，s McAdams，D Whitby，S Sabally，A Gallimore，T Corrah，M Takiguchi，T Schltz，A McMichael，H Whittle.1995.HIV-specific cytotoxic T cells in HIV-exposed but uninfected Gambian women.Nature Medicine，159-64)以及血清反应阳性的母亲所生孩子就是如此(Rowland-JonesSL，DF Nixon，MC Aldhous，F Gotch，K Aroyoshi，N Hallam，JSKroll，K Froebel，A McMichael.HIV specific cytotoxic T-cell activity in an HIV-exposed but uninfected infant.Lancet，1993，341860-861).另外长期未发病者(nonprogressor)显示出强CTL应答(Cao，Y，Qin L，Zhang I，SafritJ和Ho DD，New Engl J Med，1995，332201-208；Riviere Y，McChesney MB，Porrot E等人，AIDS Res Hum Retroviruses，11903-990)；以及I类HLA与HIV-1感染个体的发病率有关(Carrington，M.，G.W.Nelson，M.P.Martin，T.Kissner，D.Vlahov，J.J.Goedert，R.Kaslow，S.Buchbinder，K.Hoots和O.B.SJ.1999.HLA and HIV-1heterozygote advantageand B*35-Cw*04 disadvantage.Science.2831748-52)。在自然感染中，CTL应答先于中和抗体，并与急性感染的病毒血症的控制有关(Koup RA，Safrit JT，Cao Y等人，Temporal association ofcellular immune responses with the initial control ofviremia in primary human immunodeficiency syndrome，J Virol，1994；684650-4655)，AIDS发展与CTL活性的损伤密切相关。(Harrer T，Harrer E，Kalams S，Elbeik T，Staprans S，Feinberg MB，Cao Y，Ho DD，Yilma T，Caliendo A，Jonson RP，Buchbinder S和Walker B.HIV-specific CTL-response inhealthy long-term asymptomatic HIV infection.AIDS Res HumRetroviruses，1996，12，7585-592)。最后，在HIV感染的SIV模型中，诱导病毒特异性CD8+T细胞应答的疫苗可以有利影响感染结果(Barouch，D.H.，S.Santra，J.E.Schmitz，M.J.Kuroda，T.M.Fu，W.Wagner，M.Bilska，A.Craiu，X.X.Zheng，G.R.Krivulka，K.Beaudry，M.A.Lifton，C.E.Nickerson，W.L.Trigona，K.Punt，D.C.Freed，L.Guan，S.Dubey，D.Casimiro，A.Simon，M.E.Davies，M.Chastain，T.B.Strom，R.S.Gelman，D.C.Montefiori，M.G.Lewis，E.A.Emini，J.W.Shiver和N.L.Letvin.2000.Control of viremia andprevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokine-augmented DNA vaccination.Science.290486-92；Gallimore，A.，M.Cranage，N.Cook，N.Almond，J.Bootman，E.Rud，P.Silvera，M.Dennis，T.Corcoran，J.Stott，A.McMichael，and F.Gotch.1995.Early suppression of SIV replication byCD8+nef-specific cytotoxic T cells in vaccinated macaques.Nature Med.11167-1173.)
所有这组实验发现强烈提示，治疗和预防策略的至少一个目标应该包括诱导/保持/恢复该免疫应答途径。
已经开发了在动物或人中产生CTLs的方法。重组活载体迄今最为有效。该方法利用无害病毒或细菌，将选择的病原体基因转运到受者细胞中，以在此产生该选择抗原。将基因转入细胞的方法可以最大限度加工CTL表位并由MHC-I分子呈递，以及随后在宿主中有效刺激CTL克隆。
痘病毒(痘病毒科家族，Poxvirdae family)已经较为成功地用作载体。该家族的著名成员为痘苗病毒(Vaccinia Virus，VV)，在人类消灭天花运动中广泛使用。
已经利用HIV蛋白质的VV重组体进行了若干临床试验(Corey L，McElrath J，Weihold K，Matthewa T，Stablein D，Grahm B，Keefer M，Schwartz D，Gorse G.Cytotoxic T Cell andNeutralizing Antibody Responses to Human ImmunodeficiencyVirus Type 1 Envelope with a combination vaccine regimen.JInfectious Dis，1998，177301-9；Graham BS，Matthews TJ，Belshe R，Clements ML，Dolin R，Wright PF，Gorse GJ，Schwartz DH，Keefer MC，Bolognesi DP，Corey L，Stablein D，Esterlitz JR，Hu SL，Smith GE，Fast P，Koff W，J InfectiousDis，1993，167533-7)。然而，VV对于人类使用具有两个主要限制(1)少量接种人员显示较强的副作用，对缺乏免疫力的个体可以致死。(2)先前接种过VV的人员对异源抗原的应答差。
已经利用禽痘病毒(Avipoxvirus)代替VV解决这些缺点。禽痘病毒是痘病毒家族成员，但其复制限于禽类细胞，不能在人类细胞中进行复制循环。为此目的，已经使用了两种禽痘病毒金丝雀痘病毒(Canarypox Virus，CPV)和鸟痘病毒(FPV)。
许多人类肿瘤相关抗原病原体的禽痘病毒重组体在动物中诱导CTL应答(Limbach KJ和E Paoletti.1996.Non-replicatingexpression vectorsapplications in vaccines developmentand gene therapy.Epidemiol.Infect.116241-256)。使用重组禽痘病毒进行疫苗开发已经在美国取得专利(Paoletti E.y cols1992 US5174993，Paoletti E.等人1993，US5505941)，特别是在欧洲递交了使用慢病毒属抗原的重组禽痘病毒的专利申请。(PaolettiE等人，EP0956360)已经在健康自愿者中进行了HIV-1 gag、pol和env的CPV重组体的I和II期试验评价(Clements-Mann ML，K Weinhold，TJMatthews，BS Graham，GL Gorse，MC Keefer，MJ McElrath，R-HHsieh，J Mestecky，S Zolla-Pazner，J Mascola，D Schwartz，RSiliciano，L Corey，PF Wright，R Belshe，R Dolin，S Jackson，S Xu，P Fast，MC Walker，D Stablein，J-L Excler，JTartaglia，A-M Duliege，F Sinangil，E Paoletti.1998.Immune responses to Human Immunodeficiency Virus(HIV)Type1 induced by Canarypox expressing HIV-1MN gp120，HIV-1SF2recombinant gp120，or both vaccines in seronegative adults.J Infect Dis 1771230-1246；Egan MA，WA Pavlat，JTartaglia，E Paoletti，KJ Weinhold，ML Clements，RFSiliciano.1995.Induction of Human Immunodeficiency VirusType 1(HIV-1)-specific cytolytic T lymphocyte responsesin seronegative adults by a nonreplicating，host-range-restricted canarypox vector(ALVAC)carrying the HIV-1MNenv gene.J Infect Dis 1711623-1627)。据报道在鸟干达，针对至少一种HIV抗原的CTLs占I期试验接种的50％、II期的30％、最后的I期试验少于10％。该rCPV(vCP205)是通过在基因组不同的三个非必需区插入HIV基因制成的，以实现针对一种以上HIV靶的CTL应答。
另一方面，也已经使用FPV与DNA免疫共同诱导猕猴针对HIV抗原的CTL应答。(Robinson HL，DC Montefiori，RP Johnson，KHManson，ML Kalish，JD Lifson，TA Rizvi，S Lu，S-L Hu，GPMazzara，DL Panicali，JG Herndon，R Glickmanm，MA Candido，SL Lydy，MS Wyand和HM McClure.1999.Nature Medicine，5526-534)。在豚尾猴(Macaca nemestrina)HIV-1感染模型中，该免疫原组合提供了一定水平的防护。(Kent SJ，A Zhao，SJ Best，JDChandler，DB Boyle，IA Ramshaw.Enhanced T-Cellimmunogenicity and protective efficacy of a humanimmunodeficiency virus type 1 vaccine regime consisting ofa consecutive priming with DNA and boosting withrecombinant fowlpox virus.1998.J Virol，7210180-10188)。然而，由于豚尾猴的HIV感染效率低并难以重现，该动物模型存在严重局限。
还有报道由若干病原体的一连串精确CTL表位组成的微基因(minigene)产生CTL应答(Whitton，L，Sheng N，Oldstone MB和McKee T.A“string of beads”vaccine，comprising linkedminigenes，confers protection from lethal-dose viruschallenge，J Virol，1993，67，1348-352；A multivalentminigene vaccine，containing B-cell，cytotoxic T-Lymphocyteand Th epitopes from several microbes，induces appropriateresponses in vivo and confers protection against more thanone pathogen.J Virol，71，32292-2302)。
gag的微基因以及完整gag基因的Modified Vaccinia Ankara(MVA)重组体已经用于诱导小鼠CTL应答(Hanke T，RV Samuel，TJBlanchard，VC Neumann，TM Allen，JE Boyson，SA Sharpe，NCook，GL Smith，DI Watkins，MP Cranage，AJ McMichael.1999.Effective induction of simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T lymphocytes in macaques by using amultiepitope gene and DNA prime-Modified Vaccinia VirusAnkara boost vaccination regimen.J Virol，73，97524-7532)。这些微基因由gag的一连串分散的CTL表位组成。
微基因方法主要的局限在于，各CTL表位的组合仅涵盖了有限范围的HLA抗原，因此，所引发的CTL应答受到很多局限。
发明描述本发明的本质在于，构建由HIV蛋白质富含CTL表位的区域组成的嵌和基因，其中这些区域选自在病毒生活周期的即早期表达的内部保守蛋白质和调节蛋白质。
该方案优于所述HIV微基因，因为可以同时加工多个HLA等位基因呈递的重叠CTL表位。该方案较之若干HIV-1蛋白质的其它禽痘病毒重组体的另一优点在于，几种蛋白质的免疫相关区集中位于单个基因中，便于产生重组病毒，以及无需在同一重组病毒中使用几种抗生素抗性系统。另外，这便于在单个重组病毒中组合几种HIV亚型的表位。所选择区域属于最保守的病毒蛋白质以及早期表达的调节产物。这些富含CTL表位区与侧翼为两个赖氨酸的保守的T辅助细胞表位相连，便于细胞蛋白酶的加工。最后加入可由单克隆抗体识别的B细胞表位，便于利用免疫化学方法检测多肽。
连接不同的DNA片段，组装嵌和基因，其中一些片段由化学合成，其它片段以HIV基因为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。将DNA片段一同克隆于合适的质粒载体、测序，并转为痘病毒重组载体。
更具体而言，本发明涉及cr3基因，其包含HIV-1蛋白质gp120、gp41和Vpr的Th细胞表位，由Mab 2C4识别、位于gp120V3环的表位(Duarte CA，Pérez L，Vázquez J， M，Vilarubia OL，Navea L，Valdés R，Reyes O，Montero M，AyalaM和Gayilondo J.Epitope mapping，V region DNA sequence，and neutralizlng Fab fragments of two monoclonal antibodlesagainst the HIV-1 V3 loop.Immunotechnology 1996，211-20)以及蛋白质RT、Gag和Nef的富含CTL表位的区域。
将这些嵌和基因插入细菌或病毒活载体(即痘病毒、疱疹病毒、α病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、BCG、沙门氏茵)的基因组中，该载体优选痘病毒，再明确为禽痘病毒，更明确为FPV。这些重组活载体用于诱导动物或人针对HIV的TH1免疫应答和细胞毒性T细胞。
更具体而言，本发明涉及嵌和蛋白质的FPV重组体，特别涉及包含cr3嵌合基因的、命名为FPCR3和FPSCR3gpt的重组FPV菌株。一旦如上所述组装，将cr3克隆于痘病毒重组载体，特别是FPV重组载体。质粒pEFL29和pFP67xgpt在此特例中用作重组载体。pEFL29带有FPB基因组6kb BamHI末端片段的同源区，其侧翼接有转录单位，其中在VV 7.5K启动子的控制下插入异源基因，还包含位于FPV 4b启动子控制之下的报告基因和lacZ。pFP67xgpt利用11.2kb BamHI区的开放阅读框架6和7作为同源重组信号。这些区域侧翼接有转录单元，其中异源基因位于合成的痘病毒E/L启动子之下，也包含提供霉酚酸抗性的gpt基因，能选择重组病毒。
得到的质粒分别命名为pFPCR3和pFPSCR3gpt。利用现有技术可用的几种转染方法之一，将这些质粒转染原代培养的鸡胚成纤维细胞(CEF)。在此特例中，利用lipofectin(Sigma，USA)转染先前感染上FPV FP29株的CEF，但可以使用其它方法，例如电穿孔和DEAE葡聚糖等。通过质粒和FPV基因组相应非必需区之间的同源重组，就pFPCR3而言，重组病毒可以恢复表达B半乳糖苷酶，至于pFPSCR3gpt，则耐受霉酚酸。存在选择标志可以鉴别重组病毒噬斑，并可以通过CEF的若干传代而纯化。可以通过PCR在筛选的病毒上验证异源基因的存在，通过western印迹验证蛋白质表达。
本发明也涉及利用上述获得的重组FPV，单独或与选自现有技术的药学可接受的制剂共同诱导Balb/c小鼠具有CTL活性的TH1免疫应答。
本发明也涉及所述嵌和基因的重组FPV的治疗或预防组合，特别涉及FPCR3和FPSCR3gpt，连同免疫调节剂或佐剂，特别是细胞因子，例如IL2、IL12、IFNg、GMSCF、GSCF等，其优先刺激TH1免疫应答。
本发明特别涉及在动物或人中病毒FPCR3或FPSCR3gpt与每日102-107iu剂量IL2的组合。从给予FPV当天开始，或者以后每日给予Balb/c小鼠IL2，加强针对CR3的细胞免疫应答。
虽然特别涉及CR3，但本发明的本质在于还可以使用除CR3以外的富含CTL的片段，或者相当于CR3但来自其它HIV-1分离物的片段。
同样，虽然特别涉及FPV的FP9株，但本发明的本质在于，构建重组病毒可以使用其它FPV亲本株，以及另外的禽痘病毒(例如CPV)、其它痘病毒(例如VV或MVA)、或者其它病毒(例如疱疹病毒、α病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒)乃至细菌(例如BCG或沙门氏菌)。
本发明的另一实施方案中，基因可以克隆于供哺乳动物细胞表达的合适质粒载体，与药学可接受的载体共同注入哺乳动物，诱导TH1免疫应答和CTL活性。
本发明又一实施方案中，也包括上述重组质粒与免疫调节剂或佐剂(例如上述或其它的佐剂，如脂质体、多糖、脂肽、脂质、脂蛋白体或其组合)的治疗或预防组合。
本发明另一实施方案中，基因可以克隆于其它质粒，以供在细菌、酵母、真菌、昆虫或哺乳动物细胞、植物或转基因动物的乳汁中表达重组蛋白质。从该系统回收的蛋白质如果置于药学可接受的载体中，以适当方式给予动物或人，也可以用于在动物或人中诱导TH1免疫应答和CTL活性。
本发明又一实施方案中，CR3蛋白质与免疫调节剂或上述或其它佐剂(例如脂质体、多糖、脂质、脂蛋白体)、或现有技术可用的其它佐剂的治疗或预防组合，能够加强动物或人的TH1型免疫应答和CTL活性。
附图描述

图1.质粒pEFL-cr3，利用6Kb BamH1末端区的ORF-1为插入位点进行鸟痘同源重组。基因cr3位于VV p7.5K启动子控制之下，报告基因LacZ位于FPV 4b启动子之下。
图2.质粒pFP67xgpt，利用11.2kb BamHI片段ORF-6和ORF-7之间的DNA区为插入位点，进行FPV同源重组。基因cr3位于合成启动子E/L控制之下，Ecogpt基因位于VV 7.5K启动子控制之下。
图3.三个独立的cr3重组FPV的(A)PCR和(B)Western印迹(1)FPCR3.1；(2)FPCR3.2；(3)FPCR3.3；(4)FPL29；(5)DNA分子量标志。
图4.三个独立的cr3重组FPV的(A)cr3内部寡核苷酸PCR和(B)Western印迹(1)FPSCR3GPT.1；(2)FPSCR3GPT.2；(3)FPSCR3GPT.3；(4)亲代病毒；(5)分子量标志。
图5.Western印迹评价CR3表达的稳定性。泳道代表FPSCR3GPT病毒原液(1、2、3)或蔗糖垫(sucrose cushion)纯化的病毒(4、5、6)感染的三个独立FPV样本。泳道7代表亲代病毒感染的CEF。
图6.利用FPSCR3gpt以及带有肽32、或由CR3、Gag或Nef VV重组体感染的P815细胞免疫的小鼠脾细胞进行的两次独立ELISPOT实验的结果。结果表示为每106脾细胞中IFNγ分泌细胞的数目。已经减去相应的阴性对照值(单独或VV WR感染的P815)。
图7.利用FPCR3或FPSCR3gpt以及cr3基因稳定转染的P815免疫的小鼠脾细胞进行IFNγ ELISPOT实验。结果表示为每106脾细胞中IFNγ分泌细胞的数目。已经减去阴性对照值(亲本P815)。
图8.由AIDS患者的T淋巴细胞识别VVCR3感染的自体B细胞。IFNγ ELISPOT结果表示为每106外周血单核细胞中IFNγ分泌细胞的数目。
实施例实施例1.获得cr3。
cr3是由不同HIV基因片段组装成的嵌和基因。将其组装在与pTAB9基本相同的pTAB11质粒上(Gómez CE，Navea L，Lobaina L，Dubed M，Expósito N，Soto A和Duarte CA.he V3 loop basedMulti-Epitope Polypeptide TAB9 Adjuvated with MontanideISA720 is Highly Immunogenic in Nonhuman Primates andInduces Neutralizing Antibodies Against Five HIV-1 isolates.Vaccine 172311-2319，1999)，但在该基因5’最末端具有gp120的T1和T2 T辅助细胞表位，而不是编码P64K蛋白质N端部分的片段。将编码gp120的T2表位、MN株的V3表位以及gp41和vpr的T辅助细胞表位的186bp平端BamHI合成DNA片段，克隆于预先经EcoRV-BamHI消化的pTAB11。将编码两个连续赖氨酸的DNA序列插入各个表位之间，以便于细胞内加工。得到的质粒命名为pCR1。利用0.2660和0.2661引物(表1)，PCR扩增编码p66/p51(RT)蛋白质(HIV-1 SF2前病毒2663-3109位)的603bp片段。低熔点琼脂糖提取PCR片段，BglII-EcoRI消化，亚克隆于BglII-EcoRI切割的pCR1载体，得到编码CR2蛋白质的pCR2质粒。然后利用0.2662和0.2663引物，PCR扩增包含nef基因(HIV-1 LAI分离物8516-8818位)序列的324bp片段。最后，利用0.2664和0.2665引物(表1)，扩增gag基因(HIV-1 SF2 1451-1696位)267bp的另一片段。然后利用20pmol 0.2662和0.2666引物(表1)进行重叠PCR。在PCR缓冲液[KCl 50mM；Tris-HCl 10mM，(pH 8.3)，25℃；明胶0.001％]、MgCl22.5mM、每种dNTP 0.2mM以及4U Taq聚合酶中，混合等量的每条带(0.47pmol)，体积为50μL。混合物首先在92C加热2分钟，然后50C冷却，以促进条带通过0.2663和0.2664寡核苷酸9bp的互补末端退火。最后，温度升高到72℃ 5分钟，以延伸该退火片段。然后将10μL上述反应物加入包含2.5mMMgCl2、0.2mM dNTPs、20pmol 0.2662和20pmol 0.2666以及4 UVent pol.的PCR缓冲液混合物中，总体积为50μL。标准扩增条件为，92℃ 2分钟，然后92℃ 40秒、50℃ 1分钟及72℃ 1分钟，30个循环，最终72℃延伸5分钟。然后利用低熔点琼脂糖电泳纯化重叠的nef-p24扩增条带，XbaI消化。最后将前述XbaI平端条带克隆于预先经NruI-XbaI切割的pCR2载体，得到pCR3质粒。因此，cr3编码嵌和蛋白质，其中包括由各种HLA抗原呈递的gp120、gp41、vpr、RT、nef和gag的T辅助细胞和CTL表位。
表1.用于PCR反应的寡核苷酸DNA序列寡核苷酸序列(5′-3′)0.2660 GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG0.2661 GGAATTCTCGCGATCCTACATACAAATCATC0.2662 GACATCACAAGTAGCAATACAGC0.2663 CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTTG0.2664 GTTGAGCCACATGCAGGGCCTATTGCAC0.2665 GCTCTAGATTATTCGGCTCTTAGAGTTTTATAG0.2666 GCTCTAGATTATTCGGCTCTTAGAG表2.CR3中的T细胞表位
数字代表相对于每个病毒蛋白质的HXB2氨基酸序列的位置，病毒分离物位于括号内；ND，未明确。
实施例2.在pFPL29中克隆cr3。
在pCR3中，cr3基因克隆于pTryp控制之下，5’为ClaI位点，3’为T4噬菌体基因32终止子和HindIII位点。该质粒经ClaI和HindIII消化和Klenow I处理，获得带有5’端ATG、3’翻译终止密码子的cr3基因。将该DNA片段克隆于痘病毒重组载体pEFL29。
pEFL29具有FPV的6Kb BamH1末端片段，用作在FPV基因组中同源重组的非必需区。该片段包含三个ORF，ORF1是间断的。该同源区侧接VV p7.5K启动子，后面是SmaI位点以及位于FPV晚期启动子4b控制之下的报告基因lacz。该质粒也包括卡那霉素抗性基因和细菌复制起点。
PEFL29经SmaI消化、碱性磷酸酶处理，与ClaI/HindIII消化的、包含cr3基因的条带连接。选择cr3位于p7.5K之下正确方向的若干克隆。使用E.coli菌株DH5α(φ80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rK-mK+)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169)，在包含卡那霉素(25μg/ml)的LB培养基中增殖和选择重组质粒。所有基因操作按照Sambrook y col进行(Sambrook J，Fritsh EF，Maniatis T.1989.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Sec Ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)利用自动测序仪(Pharmacia)验证克隆pEFL-cr3(图1)的DNA序列。利用CsCl梯度纯化该克隆，用于转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。
实施例3.在pFP67xgpt中克隆cr3。
PCR扩增cr3基因并克隆到pMosblue载体(Amersham，UK)。得到的质粒命名为pTCR3。pTCR3经HpaI/BamHI消化，将包含cr3的较短条带克隆到痘病毒载体pFP67xgpt中。
pFP67xgpt具有FPV基因组的11.2Kb BamH1片段，用作在FPV基因组中同源重组的非必需区(Tomley F，Binns M，Campwell J，Boursnell M.Sequence Analysis of an 11.2 Kilobase，near-terminal，Bam HI fragment of fowlpox virus，J Gen Virol，1988，69，1025-1040)。该片段包含该区域的开放阅读框架6和7，在基因间区域进行插入。该同源区侧接E/L合成启动子(Carroll Mw，Moss B.E.coli B-glucoronidase(GUS)as a marker forrecombinant vaccinia viruses，Biotechniques，1995，19，3352-354)，以及位于VV 7.5K启动子控制之下的报告基因Ecogpt。该质粒也包括卡那霉素抗性基因和细菌复制起点。
质粒pFP67xgp经StuI/BamHI切割，与包含pTCR3经HpaI/BamHI消化所得DNA片段的cr3连接。选择cr3位于E/L合成启动子之下正确方向的若干克隆(图1)。使用E.coli菌株DH5α(φ80dlacZΔM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rK-mK+)，supE44，relA1，deoR，Δ(lacZYA-argF)U169)，在包含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中增殖和选择重组质粒。所有基因操作按照Sambrook等人进行。利用自动测序仪(Pharmacia)验证克隆pFP67xgptct的DNA序列。利用CsCl梯度纯化该克隆，用于转染CEF)。
实施例4.产生重组FPVs用于产生重组体的亲本FPV是HP-438减毒株，其来自HP-1致病株，经过连续6次CEF传代、另外2次尿囊绒膜传代以及最后438次CEF传代(Mayr A和K Malicki.1966.Attenuierung vonvirulentem Huhnerpockenvirus in Zellkulturen undEigenschaften des attenuierten Virus. Zentralbl.Veterinaermed.Reihe B 131-13)。然后将二次噬斑纯化的HP438分离物(FP9)传代6次，形成原种。FPV原种在包含2％新生牛血清(NBCS)的199培养基中的CEFs上生长。
如前所述，通过FP9和pEFL29质粒或其衍生物之间的同源重组，产生重组FPV。在25cm2培养瓶中生长的CEFs按感染复数(m.o.i)为2个噬斑形成单位(pfu)/细胞，感染FP9，2小时以后，利用20μg Lipofectin(Gibco BRL，USA)转染经CsCl纯化的10μg质粒DNA(pEFL-cr3或pFP67xgptctl)。加入新鲜培养基(3ml包含10％胰蛋白磷酸盐培养液加2％NBCS的199培养基)，在CO2温箱中37℃温育。24h之后再次加入新鲜培养基，然后细胞再温育3-4天。在那之后，将细胞冻融3次。然后在CEF中滴定细胞溶解产物，选择重组病毒。吸附2hr以后，移去病毒接种物，加入一层包含EMEN的琼脂糖。混合等量的2％低熔点琼脂糖和含4％胎牛血清(Gibco，Grand Island，NY)的EMEN 2X.(Gibco，Grand Island，NY)，制备该层。第4天显现病毒噬斑。培养物中加入另一层含0.33％Xgal(Melford Laboratories，UK)的琼脂糖，染色转染pEFL-cr3的CEF。选择蓝色噬斑，纯化3次，直到100％的病毒噬斑为B半乳糖苷酶表达阳性。然后在生长于25cm2培养瓶、包含10％胰蛋白磷酸盐培养基加2％NBCS的199培养基的CEF中，扩增lacZ+病毒原种。选择的重组FPV命名为FPCR3。
转染质粒pFP67xgptctl的选择性培养基包含霉酚酸(25μg/ml)、黄嘌呤(xantine)(250μg/ml)和次黄嘌呤(hypoxantine)(1μg/ml)。第4天显现病毒噬斑。由于gpt和cr3基因侧接相同的同源区，选择性培养基中的病毒噬斑分离物表明，发生重组，两种基因均插入到FPV基因组中。在CEF中连续3次纯化噬斑。选择的重组病毒命名为FPSCR3GPT。
实施例5.FPCR3的PCR分析。
利用PCR分析，检测包含cr3基因的FPCR3重组体。重组FPV在CEF中繁殖6天，然后收集细胞并沉淀。悬浮该沉淀，于包含1.25mg/ml蛋白酶K的200μl提取缓冲液(10mM Tris HCl，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％SDS，2％β-巯基乙醇)中55℃温育2h。然后酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。利用分别与cr3基因5’和3’序列互补的下述引物，PCR检测每个病毒的DNA。使用的PCR条件为，94℃ 5分钟，然后94℃ 1分钟、45℃ 1分30秒、72℃ 1分30秒，25个循环，最后72℃延伸10分钟。引物序列如下
引物775，5′TATTAACATTGCCTAGTAG 3′引物776，5′GAAGTAGAATCATAAAGAAC 3′PCR反应之后，三个独立的CR3重组病毒(FPCR3.1；FPCR3.2；FPCR3.3)显示预期的1.3kb条带。亲代病毒FPL29没有该条带(图3A)。
实施例6.FPSCR3GPT的PCR分析利用PCR分析，检测包含cr3基因的FPSCR3GPT重组体。重组FPV在CEF中繁殖6天，然后收集细胞并沉淀。悬浮该沉淀，于包含1.25mg/ml蛋白酶K的200μl提取缓冲液(10mM Tris HCl，100mMNaCl，10mM EDTA，0.5％SDS，2％ β-巯基乙醇)中55C温育2h。然后酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。利用分别与cr3基因5’和3’序列互补的下述引物，PCR检测每个病毒的DNA。使用的PCR条件为，94℃5分钟，然后94℃ 1分钟、45℃ 1分30秒、72℃ 1分30秒，25个循环，最后72℃延伸10分钟。引物序列如下引物2660，(257-279)5′GAAGATCTGTACAGAAATGGAAAAG 3′引物2663，(1029-1059)5′CCCTGCATGTGGCTCAACTGGTACTAGCTTG 3′PCR反应之后，三个独立的CR3重组病毒(FPSCR3gpt.1；FPSCR3gpt.2；FPSCR3gpt.3)显示预期的800pb条带。亲代病毒FPL29没有该条带(图4A)。
实施例7.评价FPCR3感染的CEF的CR3表达。
由Western印迹确认FPCR3的CR3表达。利用重组FPV按0.5pfu/细胞感染60mm培养皿(Petri dish)中铺满CEF。24小时后收集细胞、沉淀并悬浮于1X SDS凝胶载样缓冲液中(50mM Tris HCl pH6.8，100mM DTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)。利用15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。然后按标准方法电转移到硝化纤维素膜(Hybond-C，Amersham，UK)。转移以后，膜在5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲盐溶液中(PBS2.68mM KCl，1.47mMKH2PO4，0.137M NaCl，8.06mM Na2HPO4)封闭过夜。然后与10ug/ml单克隆抗体6.2(用含1％奶粉的PBS稀释)在室温下温育2h。该单克隆抗体由CR3免疫的小鼠产生(Iglesias E，Ruiz M，Carrazana Y，Cruz LJ，Aguilar A，Jiménez V，Carpio E，Martínez M，PérezM.Martínez C，Cruz O，Martín A，Duarte C.Chimericproteins containing HIV-1 epitopes.Journal Biochemistry，Molecular Biology and Biophysics，2001，5109-20.)。然后洗膜，与缀合辣根过氧化物酶(HRPO)(Amersham，UK)的羊抗小鼠抗体(1∶2000)温育。洗涤几次以后，利用ECL Western印迹检测系统(Amersham，UK)，按照厂家说明书进行免疫印迹。在FPCR3感染的培养物中检测到分子量50-64kDa的一条特异性条带。在亲代FP9病毒感染的CEF中没有检测到蛋白质(图3B)实施例8.评价FPSCR3gpt感染的CEF的CR3表达。
按照与前一实施例类似的方法，利用Western印迹证实FPSCR3gpt的CR3表达。在FPSCR3gpt感染的培养物中也检测到分子量50y 64kDa的一条特异性条带，而在亲代FP9病毒感染的CEF中未检测到蛋白质(图4B)。
实施例9.纯化FPCR3和FPSCR3gpt并免疫小鼠重组FPV的大量原种在从无特定病原体鸡群的蛋获得的CEF中生长。利用Beckman SW28转子，细胞质提取物通过25％(w/v)蔗糖垫以29000rpm离心2小时，纯化FPV。然后利用CEF单层的噬斑分析，确定病毒滴度。图5表明，培养物按比例增加以后，CR3的表达不变。
通过静脉内(i.v)、腹膜内(i.p)或皮下(s.c)途径，利用200μl2.5-5×107pfu的FPCR3、FPSCR3gpt或阴性对照病毒的无菌PBS致敏(primed)年青的成熟(5-8周龄)雌性Balb/c小鼠(得自the SPF breeding colony，the Institute for Animal Health，Compton，UK，或the Centro Naciornal de Producción deAnimales de Laboratorio(CENPALAB)，Cuba)。2-4周以后，小鼠通过相同途径加强，二次剂量为200μl 2.5-9×107pfu的相同病毒的无菌PBS。
实施例10.检测Balb/c小鼠针对CR3的CTL应答利用基于前已述及的方法，进行酶联免疫斑点(Enzyme-linked-immunospot，ELISPOT)分析，检测抗原特异性IFN-γ-释放细胞(Tanguay S和JJ Killion.Direct comparison of ELISPOT andELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells.1994.Lymphokine Cytokine Res，13259-263)。简言之，immobilon-P膜96孔板(Millipore，Molsheim，France)包被100μl/孔的5μg/ml小鼠IFN-γ特异性单克隆抗体R4(Pharmingen，San Diego，California)，4℃过夜，PBS洗涤3X，利用添加10％FBS的RPMI 1640培养基37℃封闭1h。然后加入测试细胞其为利用FPCR3或FPSCR3gpt致敏和加强的小鼠的离体脾细胞悬浮液(如上所述制备)。每孔加入不同数量的测试细胞106、2×105和4×104。通过加入与1μM合成肽温育的P815细胞、或者CR3、Gag或Nef的VV重组体按5pfu/细胞的m.o.i感染的P815细胞，对细胞进行刺激。包括不含肽或者经对照的痘苗病毒(vSC8或野生型痘苗株WR)感染的P815细胞，以显示产IFN-γ细胞的本底数。每孔终体积为200μl R10培养基加上hIL-2。所有分析变量一式两份进行测试。温育过夜(至少17小时)以后，平板用PBS洗涤3X，用PBS加上0.05％Tween 20洗涤5X，然后加入0.5g/ml生物素缀合的第二抗体XMG1.2(Pharmingen，San Diego，California)，室温下反应2h。各孔用PBS加0.05％Tween 20洗涤5X，加入在PBS加0.05％Tween 20中按1/1000稀释的碱性磷酸酶(AP)标记的链亲和素(Vector Labs，CA，USA)，室温下1h。各孔再用PBS加0.05％Tween 20洗涤3X，PBS洗涤3X，利用AP活性试剂盒(Biorad，CA，USA)形成斑点。15分钟后，各孔用自来水洗涤、干燥，在立体显微镜下(Leica Microscopy System，Heerbrugg，Switzerland)计数斑点。另外，我们在某些分析中使用1/800稀释的HRPO标记的链亲和素(Amersham，UK)；然后利用0.1％的3，3’-二氨基联苯胺(Sigma，Saint Louis，USA)50mM Tris-HCl，pH 7.4溶液和0.1％过氧化氢形成斑点。结果表示为每106脾细胞或分离的细胞中斑点形成细胞(SFC)的数目。数值超过每组阴性对照(不含肽、或对照VV感染的P815)的两倍，则认为阳性。
两次独立ELISPOT分析的结果如图6所示。在针对经VVCR3或VVgag和VVnef感染的、或经V3 MN肽(LKKKRIHIGPGRAFYERY)致敏的P815的IFNγ ELISPOT中，FPCR3免疫的Balb/c小鼠的大部分脾细胞是阳性，而阴性病毒免疫则没有阳性脾细胞。
在另一实验中，如上所述用FPCR3或FPSCR3gpt免疫Balb/c小鼠，利用cr3稳定转染的P815(P815cr3)测定诱导的CTL。该实验的结果如图7所示。两种重组FPV均诱导大部分的CR3特异性的IFBγ分泌细胞。
实施例11.AIDS患者淋巴细胞对CR3表位的加工和识别。
HIV感染患者的自体B细胞经EBV转化，用CR3的VV重组体(VVCR3)感染。这些靶细胞与HIV患者的外周血淋巴细胞温育，利用ELISPOT计算分泌IFNγ的脾细胞数目。本实验证实，痘病毒表达的cr3基因能够将其表位有效呈递给HIV感染患者的CTL淋巴细胞。
序列表<110>CENTRO DE INGENIERIA基因TICA Y BIOTECNOLOGIA<120>人类免疫缺陷病毒嵌名蛋白质的重组痘病毒<130>hiv<140>
<141>
<150>CU 2001-0057<151>2001-02-28<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1333<212>DNA<213>人类免疫缺陷病毒<220>
<221>基因<222>(1)..(1333)<223>Gen cr3序列<400>1atgcgtatca aacagattat caacatgtgg caggaagtgg gcaaagcgat gtatgccccg 60ccgatttctg gtatggttga gcagatgcat gaagatatca ttagcctgtg ggaccagtct 120cttaagaaaa agcgtatcca cattggccca ggccgtgcat tctatgaaag atacctaaag 180gatcaacagc tcctagggaa aaagcaactg ctgtttattc atttcagaat tgggtgtcga 240catagcagaa agaaagagat ctgtacagaa atggaaaagg aagggaaaat ttcaaaaatt 300gggcctgaaa atccatacaa tactccagta tttgctataa agaaaaaaga cagtactaaa 360tggagaaaac tagtagattt cagagaactt aataaaagaa ctcaagactt ctgggaagtt 420cagttaggaa taccacaccc cgcagggtta aaaaagaaaa aatcagtaac agtattggat 480gtgggtgatg catacttttc agttccctta gataaagact ttagaaagta tactgcattt 540accataccta gtataaacaa tgagacacca gggattagat atcagtacaa tgtgctgcca 600cagggatgga aaggatcacc agcaatattc caaagtagca tgacaaaaat cttagagcct 660tttagaaaac agaatccaga catagttatc tatcaataca tggatgattt gtatgtagga 720tcggacatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg attgtgcctg gctagaagca 780caagaggagg aggagatggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 840tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 900attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 960ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 1020tggtgctaca agctagtacc agttgagcca catgcagggc ctattgcacc aggccaaatg 1080agagaaccaa ggggaagtga catagcagga actactagta cccttcagga acaaatagga 1140tggatgacaa ataatccacc tatcccagta ggagaaatct ataaaagatg gataatcctg 1200ggattaaata aaatagtaag aatgtatagc cctaccagct ttctggacat aagacaagga 1260ccaaaggaac cctttagaga ttatgtagac cggttctata aaactctaag agccgaataa 1320tctagaacgg atc133权利要求
1.包含不同HIV-1基因片段的嵌合基因，其中这些片段编码富含细胞毒性T细胞(CTL)表位的区域，其由多种主要组织相容性复合物(HLA-1)抗原呈递，也可以包含HIV的T辅助(Th)细胞表位以及至少一种为单克隆抗体靶物的B细胞表位。
2.权利要求1所述基因，其编码包含至少一种HIV结构蛋白质以及一种HIV非结构蛋白质片段的嵌合多蛋白质。
3.权利要求2所述基因，其编码包含HIV-1蛋白质逆转录酶、P24和Nef的片段，gp120、gp41和vpr的Th表位以及gp120的B细胞表位的嵌和多蛋白质。
4.权利要求3的基因，其编码包含逆转录酶的203-259、P24的219-307和Nef.的45-147片段，gp120的T1和T2、gp41的580-594和vpr的566-580Th细胞表位以及Mab 2C4识别的MN株V3区的B细胞表位的嵌和多蛋白质。
5.权利要求4所述基因，其DNA序列与cr3基因序列基本一致。
6.嵌和蛋白质，其氨基酸序列与CR3蛋白质的序列基本一致。
7.包含不同HIV-1基因片段的异源基因重组病毒，其中所述片段编码富含CTL表位的区域，其由多种HLA-1抗原呈递，也可以包含HIV-1的T辅助细胞表位以及至少一种由Mab识别的B细胞表位。
8.权利要求7所述重组病毒，其中该异源基因编码包含至少一种HIV结构蛋白质以及一种HIV非结构蛋白质的片段的嵌合蛋白质。
9.权利要求8所述重组病毒，其中该异源基因编码包含HIV-1蛋白质RT、P24和Nef的片段，gp120、gp41和vpr的Th表位以及gp120的B细胞表位的嵌和蛋白质。
10.权利要求9的重组病毒，其中异源基因编码包含RT的203-259、P24的219-307和NEF的45-147片段，gp120的T1和T2、gp41的580-594和vpr的566-580Th细胞表位以及Mab 2C4识别的MN株V3区的B细胞表位的嵌和蛋白质。
11.权利要求10的重组病毒，其中该异源基因的DNA序列与cr3基本一致。
12.权利要求7-11所述病毒，其中该病毒为痘病毒。
13.权利要求7-12所述病毒，其中该病毒为禽痘病毒。
14.权利要求7-13所述病毒，其中该病毒为鸟痘病毒。
15.权利要求7-14所述病毒，其中该病毒为FPCR3。
16.权利要求7-14所述病毒，其中该病毒为FPCR3gpt。
17.疫苗制剂，其包含·权利要求7-16所述重组病毒。·药学可接受的载体。
18.权利要求17所述疫苗制剂的用途，用于诱导AIDS病人或未感染者针对HIV的免疫应答。
19.由权利要求17所述疫苗制剂以及免疫强化剂物质组成的预防或治疗组合。
20.权利要求19所述预防或治疗组合，其中该免疫强化剂物质为细胞因子。
21.权利要求20所述预防或治疗组合，其中该细胞因子为IL2。
22.包含权利要求1-5所述嵌和基因的质粒载体，该嵌和基因位于哺乳动物细胞启动子控制之下。
23.疫苗制剂，其包含·权利要求22所述重组质粒载体·药学可接受的载体。
24.权利要求23所述疫苗制剂的用途，用于诱导AIDS病人或未感染者针对HIV不同蛋白质的免疫应答。
25.由权利要求23所述疫苗制剂以及免疫强化剂物质组成的预防或治疗组合。
26.权利要求25所述预防或治疗组合，其中该免疫强化剂物质为细胞因子。
27.权利要求26所述预防或治疗组合，其中该细胞因子为IL2。
全文摘要
本发明涉及HIV不同基因片段联合形成的HIV嵌合基因，其中所述片段包含细胞毒性T细胞(C孔)或HIV－1辅助T细胞的表位，其由人1型主要组织相容性复合物(HLA－1)的多种抗原呈递。从该基因得到用于抗HIV/AIDS感染的预防和治疗接种的重组痘病毒，能够在接种的实验动物中产生保护性细胞免疫应答，并可由HIV/AIDS患者的CTL淋巴细胞识别。
文档编号C12N15/39GK1526018SQ02803413
公开日2004年9月1日 申请日期2002年2月22日 优先权日2001年2月28日
发明者E·伊格莱西亚斯派瑞兹, E 伊格莱西亚斯派瑞兹, D·M·巴斯克斯布鲁穆奎斯特, 巴斯克斯布鲁穆奎斯特, C·A·杜阿尔特卡诺, 杜阿尔特卡诺 申请人:遗传工程与生物技术中心