硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的制作方法

专利名称：硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖(fucoglucuronomannan)降解酶，这种酶可用于制糖技术领域，并且涉及一种用于生产所述酶的方法，以及含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份，和可用作制糖技术的试剂的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，和用于生产所述糖的方法。
背景技术：
褐藻含有多种硫酸化多糖。这种硫酸化的多糖通常被统称为岩藻依聚糖和岩藻多糖。其结构根据产生它们的藻类而改变。例如，从岩藻目(Fucales)藻类，Kjellmaniella crassifolia Miyabe，海带，Cladosiphon okamuranus Tokida，海蕴和裙带菜的孢子叶的藻类中提取的硫酸化多糖，具有彼此不同的结构。一般，从一种藻类中制备的硫酸化多糖级份，包括若干种硫酸化多糖分子种类的混合物。
业已确定其结构的硫酸化多糖分子的种类包括硫酸化岩藻聚糖，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，硫酸化岩藻半乳聚糖和硫酸化葡糖醛酸岩藻聚糖。在很多场合下，硫酸化多糖通常具有某种生物学活性。例如，业已报导了硫酸化岩藻聚糖级份具有强的抗凝活性，并且，业已报导了硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份具有针对肿瘤细胞的细胞程序死亡诱导活性。因此，业已尝试了用硫酸化多糖开发药物。
如果人们希望用硫酸化多糖开发药物的话，必须确定其结构。为了确定其结构，使用能降解硫酸化多糖的酶是非常有利的。不过，市场上还没有能降解源于褐藻的硫酸化多糖的酶。另外，为了确定硫酸化多糖的结构，需要能特异性降解所述硫酸化多糖的酶。这是因为源于褐藻的硫酸化多糖根据所述藻类的种而有所不同。
业已报导了源于岩藻目藻类的硫酸化多糖混合物具有抗凝活性，抑制衣原体集群在子宫上皮细胞上的活性，抑制过敏反应的活性，和抑制移植器官排斥作用的活性等。业已研究了源于岩藻目岩藻依聚糖的结构，以便揭示所述活性和结构之间的关系。不过，根据物理化学分析业已仅仅提出了所述结构的平均值。
在用岩藻目藻类制备的硫酸化多糖混合物级份中存在若干种类型的硫酸化多糖分子。除了决定感兴趣的生物活性的分子以外的硫酸化多糖通常是不必要的。在某些情况下，这种不必要的分子有可能诱导病理作用。
如果人们能够从源于岩藻目藻类的硫酸化多糖中制备具有结构再现性的寡糖的话，对于揭示生物学活性和结构之间的关系将是非常有用的。例如，已知一种酶，能降解包含在源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份中的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，以便产生寡糖(WO96/34004)。这种酶还能作用于源于Laminariales目的褐藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，以便产生硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖。不过，它对源于岩藻目褐藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖几乎没有活性。
由于上述原因，需要一种能特异性降解包含在源于岩藻目褐藻的硫酸化多糖混合物级份中的分子种类的酶，含有多种均一的分子种类的岩藻依聚糖级份，通过酶促方法生产的具有均一结构的寡糖，以及用于生产所述化合物的方法。
发明目的本发明的主要目的是提供一种能有效降解源于岩藻目藻类的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的、可用于制糖技术的酶，以及用于生产这种酶的方法，和可以通过让所述酶作用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖获得的寡糖，和用于生产所述寡糖的方法。本发明的另一个目的是提供一种级份，其中，业已将除去了源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份中的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，并且提供了一种用于生产所述化合物的方法。
发明概述作为深入研究的结果，本发明人业已发现属于Fucophilus属的细菌菌株Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234能产生一种新型硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖降解酶，并且发现了一种生产所述酶的方法。另外，本发明人业已发现，通过利用所述酶降解、并且除去源于岩藻目褐藻的硫酸化多糖混合物级份中的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，可以提高依聚糖级份的纯度。另外，本发明人业已发现利用所述酶可以由源于岩藻目褐藻的硫酸化多糖混合物级份生产具有均一结构的新型硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖。因此，业已实现了本发明。
本发明的第一方面涉及具有通式(I)或(II)或其盐的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖 其中R是H或SO3H，
其中R是H或SO3H。
本发明的第二方面涉及具有以下化学和物理特征的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶(I)作用于源于岩藻目藻类的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，并且消除性裂解α-D-甘露糖基(mannosyl)键，以便产生具有不饱和葡糖醛酸基团的寡糖；(II)最佳pH为大约6.5-8.0；和(III)最佳温度为大约30-40℃。
所述第二方面的酶可以按照这样一种方法获得，该方法包括培养能产生硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的Fucophilus属的细菌，并且从培养物中收集所述酶。
所述第一方面的糖或其盐可以通过一种制备所述糖的方法制备，该方法包括让所述第二方面的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于岩藻目藻类的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份。
本发明的第三方面涉及一种可以根据这样一种方法获得的岩藻依聚糖级份，该方法包括通过让所述第二方面的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份除去被转化成更小的分子的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
所述第三方面的岩藻依聚糖级份可以通过用于生产岩藻依聚糖级份的方法制备，该方法包括让所述第二方面的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份；以及收集岩藻依聚糖级份。
本发明的第四方面涉及一种用于制糖技术的试剂，该试剂包含所述第二方面的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶。
本发明的第五方面涉及包括具有通式(X)的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的多糖 其中R是H或SO3H；R2是H，SO3H或通式(XI)；而n是1或更大的整数
其中R是H或SO3H。
本发明的第六方面涉及具有以下化学和物理特征的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖或其盐(1)包含岩藻糖、甘露糖和葡糖醛酸作为组成糖；和(2)通过所述第二方面的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的作用转化成较小的分子，以便产生至少一种选自通式(I)的化合物或通式(II)的化合物的化合物 其中R是H或SO3H，
其中R是H或SO3H。
附图简述

图1表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的pH和相对活性(％)之间关系的曲线图。
图2表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的温度(℃)和相对活性(％)之间关系的曲线图。
图3表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)的1H-NMR光谱的曲线图。
图4表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)的质谱的曲线图。
图5表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(2)的1H-NMR光谱的曲线图。
图6表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(2)的质谱的曲线图。
图7表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(2)的1H-NMR光谱的曲线图。
图8表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(2)的质谱的曲线图。
图9表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(3)的1H-NMR光谱的曲线图。
图10表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(3)的质谱的曲线图。
图11表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(4)的1H-NMR光谱的曲线图。
图12表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(4)的质谱的曲线图。
图13表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(5)的1H-NMR光谱的曲线图。
图14表示本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(5)的质谱的曲线图。
发明详述下面将详细说明本发明。
在本文中，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖表示包含在褐藻内的硫酸化多糖，它包含岩藻糖、甘露糖和葡糖醛酸作为其组成糖。通过让本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，获得了具有通过上述通式(I)和/或(II)所表示的化学结构的物质。对于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的来源没有特别限制。例如，可以优选使用源于岩藻目褐藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖(例如墨角藻，泡叶藻)。在本文中，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份，表示含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的级份。
在本文中，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，表示能作用于源于褐藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖并且消除性裂解甘露糖和葡糖醛酸之间的α-D-甘露糖基键的酶，以便产生具有不饱和葡糖醛酸基团的寡糖。
在本文中，糖类化合物表示硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，并且包括可以通过让本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于在其还原末端具有甘露糖的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖而获得。
当按照本发明方法生产硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖时，首先提取了褐藻中所包含的水溶性成分。在这种情况下，优选在pH4-9和100℃或更低的温度下进行所述提取，以便避免硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖转化成更小的分子。另外，可以通过超滤有效除去所述提取物中的氨基酸或小的分子色素。活性炭处理能有效除去疏水性物质。
因此，可以获得源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份。该级份可以被用作硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份，例如作为本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的底物。通过用阴离子交换柱分离所述硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份，可以获得纯度更高的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。所述硫酸化多糖混合物级份或通过阴离子交换柱纯化的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖都可以用作底物，用于测定本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶在纯化时的活性。另外，还可将其用作原材料，用于生产含有较少分子种类和本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖的岩藻依聚糖级份。
能产生本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的任何细菌都可用于生产，而没有限制。例如，可以使用Fucophilusfucoidanolyticus菌株SI-1234。
Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234是本发明人从海参肠中筛选新获得的细菌。其细菌学特征如下。
a.形态学特征(1)直径为1.2-1.6μm的球菌(2)孢子无(3)格兰氏染色阴性b.生理学特征(1)生长温度25℃(2)对氧气的态度需氧(3)过氧化氢酶阳性(4)氧化酶阴性
(5)对盐的需求在0％盐培养基中生长阴性在1％盐培养基中生长阴性在海水培养基中生长阳性(6)醌甲基萘醌7(7)细胞内DNA的GC含量52％(8)OF-测试不产生酸(9)菌落颜色不产生特征性菌落色素(10)运动性阴性(11)滑行阴性(12)鞭毛无根据Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，Vol.9(1994)中所披露的基本分类方法，可以将该菌株归入第四组(格兰氏阴性需氧杆菌和球菌)。不过，该菌株与属于第四组的细菌显著不同，因为在它的电子转运链中具有甲基萘醌7，并且GC含量为52％。
测定了该菌株的编码16S rRNA的DNA(16S rDNA)的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，并且比较了它与已知细菌的核苷酸序列的同源性。结果，没有已知的细菌在整个16S rDNA区(大约1500个碱基)上具有高的同源性。如果在整个16S rDNA的序列同源性为90％或更低的话，这两种细菌菌株就不属于相同的属。因此，本发明人认为该菌株是一种不属于已知属的细菌，而是属于一种新的属，并将其命名为Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234。本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶包括从根据16S rDNA的核苷酸序列确定与Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234属于同一属的细菌中获得的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶。
该菌株被称为Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234，并且根据布达佩斯条约保藏在国际专利生物保藏中心，通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，Japan)，保藏日期为1999年8月18日(转移日期为2001年3月7日)，保藏号为FERM BP-7495。
为了培养生产本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的微生物，可以向培养基中添加任何营养源，只要所述微生物能利用它产生所述酶就行。例如，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖、诸如墨角藻或泡叶藻的藻类、藻酸、昆布多糖、岩藻糖、葡萄糖、甘露糖醇、甘油、蔗糖、麦芽糖、和淀粉等都可以用作碳源。酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浸渍液、肉提取物、脱脂大豆、硫酸铵、氯化铵、尿素、和糖醛酸等是合适的氮源。另外，可以添加钠、钾、钙、或锌等的盐酸盐、磷酸盐或硫酸盐。通常，从海水中获得的微生物在海水或商业出售的人工海水中能很好地生长。
确定培养条件，以便根据所使用的微生物或培养基的组成等，使本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的产量最高。一般，本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的最大产量是通过在15-30℃的温度下，在pH5-9的培养基中通气并且搅拌培养5-72小时获得的。本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，可以在培养之后从细胞中获得，和从通过离心与细胞分离的细胞培养上清液中获得。
通过在合适的培养基中培养Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234收集细胞，并且通过用于破碎细胞的诸如超声处理的常规方法破碎细胞可以获得无细胞提取物。然后可以通过常规纯化方法从所述提取物中获得纯化的酶制剂。通过纯化可以获得基本上不合其他硫酸化的含有岩藻糖的多糖降解酶的纯化形式的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶。例如，可以通过脱盐、离子交换柱层析、疏水柱层析或凝胶过滤进行纯化。
另外，可以将类似于纯化细胞内酶的纯化方法，用于从可能含有大量酶的培养上清液中纯化本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的化学和物理特征如下(I)作用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，并且消除性地裂解α-D-甘露糖基键，以便产生具有不饱和葡糖醛酸基团的寡糖；(II)最佳pH值大约为6.5-8.0(图1，表示本发明酶的反应pH和相对活性的关系的曲线图，其中，垂直轴表示相对活性(％)，而水平轴表示pH)；(III)最佳温度为大约30-40℃(图2，表示本发明酶的反应温度和相对活性之间的关系的曲线图，其中，垂直轴表示相对活性(％)，而水平轴表示温度(℃))；和(IV)通过凝胶过滤确定分子量为大约500,000-600,000。
通过测定降解硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的活性，可以鉴定本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶。可以将来自生产菌株中的无细胞提取物或在通过各种柱层析方法纯化之后获得的酶溶液用于所述测定。
Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234是一种利用硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的微生物。它能在细胞内和细胞外产生本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，以便降解硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
在本文中，源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份是指含有源于褐藻的岩藻依聚糖的级份，即从褐藻中提取的含有岩藻糖的硫酸化多糖的混合物。
根据本发明，可以通过用一种酶降解包含在硫酸化多糖混合物级份中的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，并且将其除去，获得含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份。
可以通过让硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于从褐藻中提取的硫酸化多糖混合物级份，并且除去转化成更小的分子，即硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，获得含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份。例如，可以将超滤、凝胶过滤、或阴离子交换柱处理等用于所述纯化。可以选择性地进行脱盐、或冷冻干燥等。
例如，除了硫酸化岩藻聚糖之外，源于岩藻目藻类的硫酸化多糖混合物级份含有若干种类型的硫酸化多糖，如硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。通过用硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶降解，并且除去硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，可以制备含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份。通过降解硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖产生的含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份和硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖可用作制糖技术的试剂。
在制备本发明的含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份时，可以按照常规方法溶解源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份。所述硫酸化多糖混合物级份能够以最大浓度溶解在所述溶液中。不过，所述浓度的选择通常可以将其可操作性、用于降解目的的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶等因素考虑在内。根据有关目的，可以从水、和缓冲液等中选择硫酸化多糖混合物级份的溶剂。通常，溶液的pH接近于中性。酶促反应通常是在30℃左右进行的。所述含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份可任选进一步通过离子交换树脂处理、或超滤等进一步纯化，或进行脱盐、消毒和冷冻干燥。
在本发明的含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份中所包含的一种物质，在其分子中具有硫酸基团和/或羧基基团。所述基团与各种碱起反应，形成盐。由于在本发明的含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份中所包含的物质在盐的形式下是稳定的，因此，举例来说，它通常是以钠、钾和/或钙的盐的形式提供的。通过利用诸如Dowex 50W的阳离子交换树脂，人们可以将所述盐转化成包含在本发明的含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份中的游离形式的物质。可以任选用其他各种需要的盐对所述盐进行常规盐交换。
可以将包含在本发明的含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份中的物质转化成可以药用的盐。所述盐的例子包括与碱金属，如钠和钾形成的盐，与碱土金属，如钙和镁形成的盐，以及与铵和锌形成的盐。
通过让本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖或含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的材料，可以制备本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖。例如，部分纯化的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖制剂，源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份，褐藻的含水溶剂提取物，或褐藻本身可以被优选用作所述含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的材料。
在制备本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖时，可以按照常规方法溶解硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖或含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的材料。可以以最大浓度将所述硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖或含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的材料溶解在所述溶液中。不过，所述浓度的选择通常考虑到了用于反应的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的可操作性和用量。根据其目的，硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的溶剂可以从水、和缓冲液等中选择。通常，所述溶液的pH接近于中性。酶促反应通常是在30℃左右进行的。通过调整用于所述反应的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的量，反应混合物的组成，或反应时间等，可以控制硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖的分子量。通过用分子量分级分离或阴离子交换柱分级分离按上述方法获得的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，可以制备具有更均一的分子量的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖。可以使用分子量分级分离的常规方法，如凝胶过滤或超滤。可以任选通过离子交换树脂处理，或活性炭处理等对较小的分子作进一步的纯化，或可以对其进行脱盐、消毒或冷冻干燥。本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖具有如此均一的结构，以至人们可以通过下文所述的NMR分析确定其结构。硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖的例子包括由下面的通式(I)和(II)表示的化合物。尽管不希望限定本发明，在通式(I)和(II)中Rs中的至少一个优选是SO3H。
其中R是H或SO3H，
其中R是H或SO3H。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖在其分子中具有硫酸基团和羧基基团。所述基团能与各种碱起反应形成盐。由于本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖在其盐的形式下是稳定的，例如，它通常是以与钠、钾和/或钙形成的盐的形成提供的。通过利用诸如Dowex 50W的阳离子交换树脂，人们可以将所述盐转化成游离形成的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖。任选用其他各种需要的盐对所述盐进行常规盐交换。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖可以转化成可以药用的盐。所述盐的例子包括与碱金属，如钠和钾形成的盐，与碱土金属，如钙和镁形成的盐，以及与铵和锌形成的盐。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶能将硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖转化成更小的分子。因此，可将其用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的结构分析。本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖可用作制糖技术的试剂。例如，通过披露于JP-B 5-65108中的方法，对寡糖进行PA-标记而制备的2-氨基吡啶(PA)-标记的寡糖，可以用作岩藻呋喃糖苷酶或5-硫酸化岩藻呋喃糖苷酶的底物。因此，可以提供一种作为制糖技术的试剂的非常有用的物质。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖是具有这样一种结构的多糖，其中，岩藻糖侧链是从一种糖链上的甘露糖延伸来的，所述糖链是由交替相互结合的葡糖醛酸和甘露糖组成的。所述多糖通常是通过二价阳离子等的交联键聚合的。尽管不希望限定本发明的范围，在裂解所述交联键之后的分子量为5,000-2,000,000，优选10,000-1,000,000。尽管不希望限定本发明的范围，通式(X)所表示的是所述硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。在通式(X)中，n是1或大于1的整数，优选5-2000，更优选10-1000。
其中R是H或SO3H；R2是H，SO3H或通式(XI)；而n是1或大于1的整数
其中R是H或SO3H。
实施例以下实施例进一步详细说明了本发明，但不应当被视为是对本发明范围的限定。
参考实施例1制备源于墨角藻(Fucus Vesiculosus)的硫酸化多糖混合物级份。
将干燥的墨角藻藻类磨碎。将1kg磨碎的藻类悬浮在10L 80％乙醇中。在25℃下搅拌该悬浮液3小时，过滤，然后洗涤，以便获得残余物。将所述残余物悬浮在30L含有100mM氯化钠的30mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。在95℃下处理该悬浮液2小时，然后冷却到30℃。向其中添加100g活性炭，3000U藻酸裂解酶(Nagase Biochemicals)和3.75L乙醇。搅拌该混合物24小时，然后离心，获得上清液。用装有排阻分子量为100,000的空心纤维的超滤装置将所述上清液浓缩到4L。将溶剂换成100mM的氯化钠。将该溶液冷却到5℃。用0.5N盐酸将pH调节到2.0。通过离心除去所形成的沉淀物，获得上清液。用1N氢氧化钠将上清液的pH调整到8.0。用上述超滤装置将该溶液浓缩到2L，并且将溶剂换成20mM氯化钠。将该溶液冷冻干燥，获得80g源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份。
参考实施例2源泡叶藻(Ascophyllum nodosum)的硫酸化多糖混合物级份的制备按照披露于参考实施例1中的方法从1kg的市售泡叶藻粉末中获得源于泡叶藻的硫酸化多糖混合物级份。
参考实施例3源于Kjellmaniella crassifolia Miyabe的硫酸化多糖混合物级份的制备用切碎磨(Masuko Sangyo)破碎市售Kjellmaniellacrassifolia Miyabe，以便制备碎片。按照披露于参考实施例1中的方法，从1kg的碎片中获得了38g源于Kjellmaniella crassifoliaMiyabe的硫酸化多糖混合物级份。
参考实施例4源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份制备将7g如参考实施例1所述的源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份溶解在含有100mM氯化钠的700ml 20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)中。将该溶液加样到用相同的缓冲液平衡的5-L DEAE-CellulofineA-800上。让样品过柱，用10L相同的缓冲液洗涤该柱，并且用100-1600mM氯化钠的梯度溶液进行洗脱，以便收集级份(500ml)。分别通过苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法测定每一种级份的总含糖量和总糖醛酸含量。通过超滤(排阻分子量为100,000)浓缩由200-700mM氯化钠洗脱的级份，脱盐并且冷冻干燥，以便获得1.3g来自墨角藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份。
参考实施例5源于泡叶藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份的制备按照参考实施例4所披露的方法，从由参考实施例2所披露的源于泡叶藻的7g硫酸化多糖混合物级份中获得1.1g源于泡叶藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份。
参考实施例6源于Kjellmaniella crassifolia Miyabe的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份的制备将参考实施例3所披露的源于Kjellmaniella crassifoliaMiyabe的7g硫酸化多糖混合物级份溶解在含有150mM氯化钠的700ml20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)中。将该溶液加样到用相同缓冲液平衡的5-L DEAE-Cellulofine A-800中。让样品过柱，用10L相同缓冲液洗涤该柱，并且用150-1950mM氯化钠的梯度溶液进行洗脱，以便收集级份(500ml)。分别按照苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法测定每一种洗脱级份中的总含糖量和总糖醛酸含量。通过超滤(排阻分子量为100,000)浓缩由350-490mM氯化钠洗脱的级份，脱盐并且冷冻干燥，以便获得1.32g源于Kjellmaniella crassifolia Miyabe的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份。
参考实施例7测定硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶活性的方法当本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖时，产生了一种具有不饱和葡糖醛酸基团的寡糖，导致在232nm波长下的吸光度提高。按以下方法用它测定硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶活性。本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于墨角藻和泡叶藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。它还能作用于源于Kjellmaniella crassifolia Miyabe的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。然后用源于Kjellmaniellacrassifolia Miyabe的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖作底物，测定其活性，因为它能够方便地制备。
简单地讲，将50μl如参考实施例6所述的源于Kjellmaniellacrassifolia Miyabe的2.5％的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份的溶液与50μl 100mM磷酸缓冲液(pH7.5)，10μl 4M氯化钠和10μl本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖混合在一起。在37℃下反应3小时之后，用2ml的冷水洗脱105μl的反应混合物。在232nm波长下测定吸光度。作为对照，同样分析了通过用所述酶溶液的溶剂取代本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶进行反应获得的反应混合物，以及通过用水代替硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份进行反应获得的反应混合物。
一个单位的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶活性被定义为在上述反应系统中，在1分钟内产生1μmol不饱和葡糖醛酸基团需要的酶的量。所述酶的活性是按以下公式计算的Δ232×2.105/5.5/180/0.01＝U/mlΔ232在232nm波长下提高的吸光度；2.105进行吸收测定的样品体积(ml)；5.5不饱和醛酸基团的分子消光系数(/mM)；180反应时间(分钟)；0.01酶溶液的体积(ml)。
蛋白含量是通过在280nm波长下测定酶溶液的吸光度确定的。在进行所述计算时，假设含有浓度为1mg/ml的蛋白的溶液的吸光度为1.0。
实施例1硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的制备将Fucophilus fucoidanolyticus菌株SI-1234接种到600ml由人工海水组成的培养基(Jamarin Laboratory)(pH8.0)中，该培养基含有浓度分别为0.2％和1％的如参考实施例1所述的源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份和蛋白胨，该培养基业已在120℃下高压灭菌20分钟，并且在24℃下培养72小时，以便制备种子培养物。在120℃下处理装有20L由人工海水(Jamarin Laboratory)组成的培养基(pH8.0)的30L发酵罐20分钟，该培养基含有浓度分别为0.2％和1％的如参考实施例1所述的源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份和蛋白胨，以及消泡剂(KM70，Shin-Etsu Chemical)。将所述种子培养物接种到该培养基中，并且以125rpm的速度在24℃下培养48小时。在培养之后，对培养物进行离心，以便获得细胞和上清液。
将所述细胞悬浮在600ml含有400mM氯化钠和10mM氯化钙的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)中，超声波处理，并且离心，以便获得上清液。用相同的缓冲液适当透析上清液，并且离心，以便获得作为本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的粗制酶溶液的上清液。
测定所述培养上清液和粗制酶溶液中所包含的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的活性。结果，在相当于1ml培养基的培养上清液和相当于1ml培养基的细胞提取物中分别检测到了1mU和2mU的活性。
实施例2用硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的粗制酶溶液制备硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，及其纯化和结构分析(1)(1)制备通过让实施例1所披露的粗制酶溶液作用于参考实施例1所披露的源于墨角藻硫酸化多糖混合物级份，制备本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。简单地讲，将5g源于墨角藻的硫酸化多糖级份溶解在500ml含有300mM氯化钠和50mM氯化钙的25mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)中。然后将50ml如实施例1所示的粗制酶溶液添加进去。让该混合物在25℃下反应4天时间。用装有排阻分子量为10,000的空心纤维的超滤装置，处理通过对所述反应混合物进行离心所获得的上清液，以便收集分子量为10,000或更低的寡糖级份。该级份被确定为硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖酶促消化产物级份1。
(2)纯化用脱盐装置(Micro Acilyzer G3，Asahi Kasei)对在实施例2-(1)中所获得的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖酶促消化产物级份1进行脱盐。分别以10mM和10mM的浓度将咪唑和氯化钠添加到其中。将所得到的混合物加样到用含有10mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)的1-L DEAE-Cellulofine A-800柱中。用2L相同缓冲液洗涤，然后用10-1200mM氯化钠的梯度溶液洗脱并且收集级份。测定每一种级份在232nm波长下的吸光度。分别通过苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法测定每一种级份中的总含糖量和总糖醛酸含量。结果，洗涤后半部分的级份和用360mM氯化钠洗脱的级份形成了在232nm波长下的吸收峰，总含糖量和总的糖醛酸含量是彼此成正比例的。合并每一个峰的级份，并且将合并物分别命名为寡糖级份1-(1)和1-(2)。
向寡糖级份1-(1)中添加水，使导电率与含有5mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)的导电率相等。将该混合物加样到用含有5mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)平衡的30-ml DEAE-Cellulofine A-800柱中。用60ml的相同缓冲液洗涤该柱。收集流通级份，用蒸发器浓缩到2.8ml，加样到用10％乙醇平衡的CellulofineGCL-25柱(2×32cm)中，用10％乙醇洗脱，以便脱盐，并且随后干燥。因此获得了1.6mg本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)。
向寡糖级份1-(2)中添加水，使导电率与含有200mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)的导电率相等。将该混合物加样到用含有200mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)平衡的20-mlDEAE-Cellulofine A-800柱中。用40ml的相同缓冲液洗涤该柱。用200-500mM氯化钠的梯度溶液进行洗脱。收集240-320mM氯化钠洗脱的级份，用蒸发器浓缩到1.0ml，加样到用10％乙醇平衡的CellulofineGCL-25柱(2×32cm)中，用10％乙醇洗脱，以便脱盐，并且随后干燥。因此获得了6.4mg本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(2)。
(3)结构分析对在实施例2-(2)中获得的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)和1-(2)的还原末端进行糖分析，并且在用2-氨基吡啶进行荧光标记之后进行糖组成分析。结果确定了位于本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)和1-(2)的还原末端的糖都是甘露糖。对于中性糖组成来说，每一种寡糖由岩藻糖和甘露糖组成。然后，进行了硫酸含量测定(通过浊度测定方法用氯化钡测定)和糖醛酸含量测定(按照咔唑-硫酸方法测定)，用质谱仪API-III(Perkin-Elmer Sciex)进行了质谱分析，并且用核磁共振装置JNM-α500(Nippon Denshi)进行了NMR分析。在换成重水之后，按照常规方法对要分析的样品进行结构分析。用HMBC方法，即用于杂核的1H-检测的方法分析组成糖的键。将DQF-COSY方法和HOHAHA方法用于分析1H-NMR。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)和1-(2)的物理特征如下。
(a)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)的物理特征NMR分析中的质谱分析和分配结果如下文所述。在图3和4中分别示出了1H-NMR光谱和质谱。在图3中，垂直轴表示信号强度，而水平轴表示化学位移值(ppm)。在图4中垂直轴表示相对强度，而水平轴表示m/z值。
分子量484MS m/z 483.3[M-H+]-在表1中示出了1H-NMR分析的结果。
表1

糖组成L-岩藻糖∶D-甘露糖∶不饱和葡糖醛酸＝1∶1∶1硫酸基团无在1H-NMR中确定的峰分配的数量如下面的通式(III)所示 (b)本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(2)的物理特征下面示出了质谱分析的结果和NMR分析中分配的结果。在图5和6中分别示出了1H-NMR光谱和质谱。在图5中，垂直轴表示信号强度，而水平轴表示化学位移值(ppm)。在图6中垂直轴表示相对强度，而水平轴表示m/z值。
分子量724MS m/z 723.1[M-H+]-，766.7[M+2Na+-3H+]-，790.5[M+3Na+-4H+]-，360.9[M-2H+]2-，372.0[M+Na+-3H+]2-在表2中示出了1H-NMR分析的结果。
表2

糖组成L-岩藻糖∶D-甘露糖∶不饱和葡糖醛酸＝1∶1∶1硫酸基团3个分子在1H-NMR中确定的峰分配的数量如下面的通式(IV)所示 实施例3用硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的粗制酶溶液制备硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，及其纯化和结构分析(2)(1)制备通过让实施例1所披露的粗制酶溶液作用于参考实施例4所披露的源于墨角藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，制备本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖。简单地讲，将0.61g源于墨角藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份溶解在60ml含有400mM氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。然后将6ml如实施例1所述的粗制酶溶液添加进去。业已用含有300mM氯化钠，5mMEDTA和5mM叠氮化钠的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)对该粗制酶溶液进行过透析。让该混合物在25℃下反应7天时间。对通过将所述反应混合物离心所获得的上清液进行超滤(排阻分子量为10,000)，以便收集分子量为10,000或更低的寡糖级份。该级份被称为硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖酶促消化产物级份2。
(2)纯化将在实施例3-(1)中获得的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖酶促消化产物级份2浓缩到40ml。将该浓缩物加样到用10％乙醇平衡的Cellulofine GCL-1000柱(4×87cm)中。进行分级分离，以便每一种级份含有10ml的洗脱物。收集第70-第100个级份，并且用脱盐装置(Micro Acilyzer G3，Asahi Kasei)进行脱盐。以10mM的最终浓度添加咪唑。将所获得的混合物加样到用10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)平衡的80ml DEAE-Cellulofine A-800柱中。用160L相同缓冲液洗涤，然后用0-800mM氯化钠的梯度溶液洗脱并且收集级份。测定每一种级份在232nm波长下的吸光度。分别通过苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法测定每一种级份中的总含糖量和总糖醛酸含量。结果，发现了在232nm波长下的5个独立的吸收峰，检测到的总含糖量和总的糖醛酸含量彼此成正比例。合并每一个峰的级份，并且根据用于洗脱(从低到高)的盐的浓度将其命名为寡糖级份2-(1)-(5)。
用蒸发器分别将寡糖级份2-(1)-(5)浓缩到4ml，加样到10％乙醇平衡的Cellulofine GCL-25柱(2×32cm)中，并且用10％乙醇洗脱，用于脱盐和干燥。因此，分别获得了3.5，3.9，1.9，1.7和0.9mg的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(1)-(5)。
(3)结构分析对在实施例3-(2)中获得的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(1)-(5)的还原末端进行糖分析，并且在用2-氨基吡啶进行荧光标记之后进行糖组成分析。结果确定了位于本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(1)-(5)的还原末端的糖都是甘露糖。对于中性糖组成来说，每一种寡糖都是由岩藻糖和甘露糖组成。然后，进行了硫酸含量测定(通过浊度测定方法用氯化钡测定)和糖醛酸含量测定(按照咔唑-硫酸方法测定)，用质谱仪API-III(Perkin-ElmerSciex)进行了质谱分析，并且用核磁共振装置JNM-α500(NipponDenshi)进行了NMR分析。在换成重水之后，按照常规方法对要分析的样品进行结构分析。用HMBC方法，即用于杂核的1H-检测的方法分析组成糖的键。将DQF-COSY方法和HOHAHA方法用于分析1H-NMR。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(1)-(5)的物理特征如下。
(a)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(1)的物理特征作为上述分析的结果，证实该物质与本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖1-(1)相同。
(b)本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(2)的物理特征下面示出了质谱分析的结果和NMR分析中分配的结果。在图7和8中分别示出了1H-NMR光谱和质谱。在图7中，垂直轴表示信号强度，而水平轴表示化学位移值(ppm)。在图8中，垂直轴表示相对强度，而水平轴表示m/z值。
分子量564MS m/z 563.0[M-H+]-，585.0[M+Na+-2H+]-281.0[M-2H+]2-在表3中示出了1H-NMR分析的结果。
表3

糖组成L-岩藻糖∶D-甘露糖∶不饱和葡糖醛酸＝1∶1∶1硫酸基团1个分子在1H-NMR中确定的峰分配的数量如下面的通式(V)所示 (c)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(3)的物理特征下面示出了质谱分析的结果和NMR分析中分配的结果。在图9和10中分别示出了1H-NMR光谱和质谱。在图9中，垂直轴表示信号强度，而水平轴表示化学位移值(ppm)。在图10中，垂直轴表示相对强度，而水平轴表示m/z值。
分子量644MS m/z 321.3[M-2H+]2-在表4中示出了1H-NMR分析的结果。
表4

糖组成L-岩藻糖∶D-甘露糖∶不饱和葡糖醛酸＝1∶1∶1硫酸基团2个分子在1H-NMR中确定的峰分配的数量如下面的通式(VI)所示 (d)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(4)的物理特征下面示出了质谱分析的结果和NMR分析中分配的结果。在图11和12中分别示出了1H-NMR光谱和质谱。在图11中，垂直轴表示信号强度，而水平轴表示化学位移值(ppm)。在图12中，垂直轴表示相对强度，而水平轴表示m/z值。
分子量870MS m/z 456.1[M+2Na-4H+]2-，445.0[M+Na+-3H+]2-在表5和6中示出了1H-NMR分析的结果。
表5

表6

糖组成L-岩藻糖∶D-甘露糖∶不饱和葡糖醛酸＝2∶1∶1硫酸基团3个分子在1H-NMR中确定的峰分配的数量如下面的通式(VII)所示 (e)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖2-(5)的物理特征下面示出了质谱分析的结果和NMR分析中分配的结果。在图13和14中分别示出了1H-NMR光谱和质谱。在图13中，垂直轴表示信号强度，而水平轴表示化学位移值(ppm)。在图14中，垂直轴表示相对强度，而水平轴表示m/z值。
分子量950MS m/z 1037.0[M+4Na-5H+]-，506.9[M+3Na-5H+]2-，495.8[M+2Na+-4H+]2-在表7和8中示出了1H-NMR分析的结果。
表7

表8

糖组成L-岩藻糖∶D-甘露糖∶不饱和葡糖醛酸＝2∶1∶1硫酸基团4个分子在1H-NMR中确定的峰分配的数量如下面的通式(VIII)所示 实施例4用重组硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖裂解酶制备硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，及其纯化和结构分析(1)制备通过让重组硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于参考实施例4所披露的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份，制备本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，所述裂解酶是通过按照WO99/11797中所披露的方法将编码硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的基因转入大肠杆菌而生产的。简单地讲，将0.4g源于墨角藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖级份溶解在40ml含有400mM氯化钠的20mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.0)中。然后添加5ml重组硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶(相当于66U)溶液。让该混合物在25℃下反应25小时时间。将该反应混合物加样到用10％乙醇平衡的Cellulofine GCL-1000柱(4×87cm)中。进行分级分离，以便每一个级份中含有9.5ml的洗脱物。合并第83-第120号级份，并且将合并物命名为硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖酶促消化产物级份3。
(2)纯化用脱盐装置(Micro Acilyzer G3，Asahi Kasei)对在实施例4-(1)中获得的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖酶促消化产物级份3进行脱盐。以10mM的最终浓度添加咪唑。将所获得的混合物加样到用10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0)平衡的20ml DEAE-Cellulofine A-800柱中。用40L相同缓冲液洗涤，然后用0-800mM氯化钠的梯度溶液进行洗脱。测定每一种级份在232nm波长下的吸光度。分别通过苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法测定每一种级份中的总含糖量和总糖醛酸含量。结果，在用200mM和300mM氯化钠洗脱的部分检测到了在232nm波长下的吸收峰，总含糖量和总的糖醛酸含量彼此成正比例。合并每一个峰上的级份，并且将合并级份命名为寡糖级份3-(1)和3-(2)。
用蒸发器将寡糖级份3-(1)浓缩到1ml，加样到10％乙醇平衡的Cellulofine GCL-25柱(1.2×30cm)中，并且用10％乙醇洗脱，用于脱盐和干燥。因此，获得了0.7mg的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(1)。
用蒸发器分别将寡糖级份3-(2)浓缩到1.0ml，加样到10％乙醇平衡的Cellulofine GCL-25柱(1.2×30cm)中，用10％乙醇洗脱，用于脱盐和干燥。因此，获得了1.6mg的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(2)。
(3)结构分析对在实施例4-(2)中获得的本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(1)和3-(2)的还原末端进行糖分析，并且在用2-氨基吡啶进行荧光标记之后进行糖组成分析。结果确定了本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(1)和3-(2)的还原末端的糖都是甘露糖。对于中性糖组成来说，每一种寡糖都是由岩藻糖和甘露糖组成。然后，进行了硫酸含量测定(通过浊度测定方法用氯化钡测定)和糖醛酸含量测定(用咔唑-硫酸方法测定)，用质谱仪API-III(Perkin-Elmer Sciex)进行了质谱分析，并且用核磁共振装置JNM-α500(Nippon Denshi)进行了NMR分析。在更换成重水之后，按照常规方法对要分析的样品进行结构分析。用HMBC方法，即用于杂核的1H-检测的方法分析组成糖的键。将DQF-COSY方法和HOHAHA方法用于分析1H-NMR。
本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(1)和3-(2)的物理特征如下。
(a)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(1)的物理特征作为上述分析的结果，证实该物质与以前报导过的寡糖具有相同的结构。
其结构如下面的通式(IX)所示 (b)本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(2)的物理特征作为上述分析的结果，证实该物质与本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖3-(2)的结构相同。
将实施例3的结构与实施例4的结构进行比较。在实施例4中尽管使用了200倍或200倍以上的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，以底物重量为基础计算的寡糖产生效率低于1/5。另外，在实施例3中获得了六类寡糖，而在实施例4中仅获得了两类寡糖。因此，本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶能有效降解源于墨角藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，而在实施例4中使用的重组硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，不能以相同的效力降解源于墨角藻的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
实施例5测定本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的分子量通过用含有100mM氯化钠，10mM氯化钙和5mM叠氮化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的Sephacryl S-200柱(4.4×100cm)对实施例1所披露的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的粗制酶溶液进行凝胶过滤，并且进行分级分离，以便每一个级份含有13.5ml的洗脱物。按照参考实施例7所披露的方法测定本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶对每一种级份的活性。因此，确定本发明硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的分子量为大约500,000-600,000。
实施例6含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份的制备为了用参考实施例1所披露的源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份制备含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份，将500ml的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，50ml的4M氯化钠，10ml的如实施例1所披露的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的粗制酶溶液和5g如参考实施例1所披露的源于墨角藻的硫酸化多糖级份混合在一起，并且让该混合物在25℃下反应5天时间。通过透析除去通过降解所得到的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，以便制备含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份，其中，业已从硫酸化多糖级份中除去了硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
实施例7硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用位点的结构用本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶制备的每一种寡糖的还原末端的糖是甘露糖。不饱和葡糖醛酸存在于非还原末端。随着反应的进行，在232nm波长下的吸光度增加。因此，推测这种酶能消除性裂解硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖中的甘露和葡糖醛酸之间的甘露糖基键，与披露于WO 96/34004中的酶类似。
如果它是所推测类型的酶的话，就应当存在具有这样一种结构的多糖，其中，岩藻糖侧链是由糖链上的甘露糖延伸的，所述糖链由源于墨角藻的岩藻依聚糖中的彼此交替结合的葡糖醛酸和甘露糖组成(硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖)。草酸处理是用于从源于褐藻的硫酸化多糖混合物中获得由甘露糖和葡糖醛酸组成的多糖(葡糖醛酸甘露聚糖)的已知方法(Carbohydrate Research，vol.125，283-290(1984))。通过这种方法处理源于墨角藻的岩藻依聚糖，以便分析其结构，证实是否像推测的那样在墨角藻中含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
具体地讲，将1g按参考实施例1所述方法制备的源于墨角藻的硫酸化多糖混合物级份溶解在100ml水中。添加4.5g草酸。用6M氢氧化钠将pH调节到1.0。在100℃下处理该混合物5小时。用6M氢氧化钠将pH调节到8。以85％的最终浓度将乙醇添加到通过离心获得的上清液中。在放置2小时之后，对该混合物进行离心，以便获得沉淀物。将沉淀物溶解在3000ml 10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)中。将该溶液加样到用含有30mM氯化钠的10mM咪唑-盐酸缓冲液(pH8.0)平衡的100-ml DEAE-Cellulofine中。在用相同的缓冲液洗涤之后，用30mM-500mM氯化钠的梯度溶液进行洗脱。进行分级分离，以便每一个级份含有10ml的洗脱物。通过苯酚-硫酸方法和咔唑-硫酸方法分别测定每一个级份中的中性糖含量和糖醛酸含量。含有中性糖和糖醛酸的主要成分是用120-250mM的氯化钠洗脱的。收集所述级份，用电透析装置脱盐，冷冻干燥，并且在更换成重水之后进行NMR分析。结果，证实了该物质具有与披露于以下文献中的葡糖醛酸甘露聚糖相同的结构Carbohydrate Research，vol.125，283-290(1984)。
因此，证实了在本发明的寡糖中所包含的不饱和葡糖醛酸是通过本发明的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的作用从所述硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖中的葡糖醛酸产生的。
另外，证实了源于墨角藻的岩藻依聚糖含有一种新型硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，它含有岩藻呋喃糖。
工业实用性本发明提供了一种新型硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，它可用于硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的结构分析，并且可再现地生产硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖，以及提供了一种用于生产所述酶的方法。本发明还提供了一种硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖和含有较少分子种类的岩藻依聚糖级份。它可以用所述酶生产，并可以用作制糖技术的制剂，并且还提供了用于生产所述化合物的方法。
序列表独立文本SEQ ID NO1Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234的16SrDNA区序列表<110)>宝生物工程株式会社。
<120>硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖<130>663177<150>JP 2001-119671<151>2001-04-18<150>JP 2001-155849<151>2001-05-26<160>1<210>1<211>1535<212>DNA<213>Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234<400>1ggatccgata gagtttgatc ctggctcaga gtgaacgctg gcggcgtggt taagacatgc 60aagtcgaacg agattctttg tattgaagcc tcggtggatt tataaagatg aaagtggcaa 120acgggtgcgt aacacgtgag caatctgccc taaagatcgg aatagctcga ggaaactcga 180attaatgccg gatgtgatac gccaactcat gttggtagta ttaaagcttg taatggcgct 240ttaggaggag ctcgcggcct atcagcttgt tggtgaggta aaggctcacc aaggcaaaga 300cgggtagctg gtctgagagg atgatcagcc acactggaac tgagacacgg tccagacacc 360tacgggtggc agcagtttcg aatcattcac aatgggggca accctgatgg tgcaacgccg 420
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1.具有通式(I)或(II)的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖或其盐 其中R是H或SO3H， 其中R是H或SO3H。
2.一种硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶，具有以下化学和物理特征(I)作用于源于岩藻目的藻类的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，并且消除性裂解α-D-甘露糖基键，以便产生具有不饱和葡糖醛酸基团的寡糖；(II)最佳pH为大约6.5-8.0；和(III)最佳温度为大约30-40℃。
3.一种用于生产权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的方法，该方法包括培养能生产权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的Fucophilus属的细菌；和从所述培养物中收集所述酶。
4.一种用于生产具有通式(I)或(II)的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖或其盐的方法，该方法包括让权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于岩藻目的藻类的含有硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖的级份， 其中R是H或SO3H， 其中R是H或SO3H。
5.一种可以通过一种方法获得的岩藻依聚糖级份，该方法包括通过让权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份，除去被转化成更小的分子的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖。
6.一种用于生产岩藻依聚糖级份的方法，该方法包括让权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶作用于源于褐藻的硫酸化多糖混合物级份；和收集岩藻依聚糖级份。
7.一种用于制糖技术的试剂，它包含权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶。
8.一种具有以下化学和物理特征的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖或其盐(1)包含岩藻糖、甘露糖和葡糖醛酸作为组成糖；和(2)通过权利要求2所限定的硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖裂解酶的作用转化成更小的分子，以便产生选自通式(I)或通式(II)的化合物的至少一种化合物 其中R是H或SO3H， 其中R是H或SO3H。
全文摘要
一种酶，它能分解硫酸化岩藻葡糖醛酸甘露聚糖，并且可用于制糖领域；一种用于生产所述酶的方法；一种减少了分子种类，并且可用作制糖技术的试剂的岩藻依聚糖级份；一种硫酸化的岩藻葡糖醛酸甘露聚糖寡糖；以及用于生产所述级份和寡糖的方法。
文档编号C12P19/00GK1520458SQ0280847
公开日2004年8月11日 申请日期2002年4月18日 优先权日2001年4月18日
发明者酒井武, 木村瞳, 猪饲胜重, 加藤郁之进, 之进, 重 申请人:宝生物工程株式会社