通过增加酪氨酸转氨酶活性增加生物体中的维生素e含量的制作方法

专利名称：通过增加酪氨酸转氨酶活性增加生物体中的维生素e含量的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过培养比野生型有增加的酪氨酸转氨酶活性的生物体，特别是植物生产维生素E的方法，也涉及此遗传修饰的生物体，特别是植物本身。
天然存在的具有维生素E活性的八种化合物是6-色原烷醇的衍生物(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，A 27卷(1996)，VCHVerlagsgesellschaft，第4章，478-488，维生素E)。生育酚基团(1a-d)有饱和侧链，而生育三烯酚基团(2a-d)有不饱和侧链 1a，α-生育酚R1＝R2＝R3＝CH31b，β-生育酚R1＝R3＝CH3，R2＝H1c，γ-生育酚R1＝H，R2＝R3＝CH31d，δ-生育酚R1＝R2＝H，R3＝CH3 2a，α-生育三烯酚R1＝R2＝R3＝CH32b，β-生育三烯酚R1＝R3＝CH3，R2＝H2c，γ-生育三烯酚R1＝H，R2＝R3＝CH32d，δ-生育三烯酚R1＝R2＝H，R3＝CH3
在本发明中，维生素E应理解为包括具有维生素E活性的所有上述生育酚和生育三烯酚。
这些具有维生素E活性的化合物是重要的天然脂溶性固体抗氧化剂。在人和动物中，维生素E缺乏将引起病理生理学疾病。因此，维生素E化合物作为食品和饲料业、药物制剂和化妆品应用中的添加剂具有重要的经济价值。
因此，维生素E化合物及具有增加的维生素E含量的食物和饲料的经济生产方法极其重要。
特别经济的方法是生物技术方法，该方法利用天然生产维生素E的生物体或通过遗传修饰优化的生产维生素E的生物体。
图62显示在高等植物中α-生育酚生物合成的示意图。
在高等植物中，酪氨酸是从分支酸开始，经过预苯酸和arogenate形成。芳香族氨基酸酪氨酸通过酪氨酸转氨酶转化成羟苯基丙酮酸，羟苯基丙酮酸通过双加氧作用转化成尿黑酸。
随后，尿黑酸结合叶绿基焦磷酸(PPP)或牻牛儿牻牛儿焦磷酸以形成α-生育酚和α-生育三烯酚的前体，即2-甲基-6-叶绿基氢醌和2-甲基-6-牻牛儿牻牛儿氢醌。用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体的甲基化步骤首先产生了2，3-二甲基-6-叶绿基氢醌，随后环化作用产生了γ-生育酚，进一步甲基化产生了α-生育酚。
通过过量表达各生物合成基因增加代谢物流量以增加转基因生物体中生育酚或生育三烯酚含量的实验是已知的。
WO 97/27285描述了通过增加对羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)的表达或通过下调该酶对生育酚含量的改变。
WO 99/04622和D.DellaPenna等，Science 1998，282，2098-2100描述了集胞藻属(Synechocystis)物种和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的编码γ-生育酚甲基转移酶的基因序列，及引入所述基因序列得到的具有改变的维生素E含量的转基因植物。
WO 99/23231表明转基因植物中牻牛儿牻牛儿还原酶的表达引起了增加的生育酚生物合成。
WO 00/08169描述了编码1-脱氧-D-木糖-5-磷酸合成酶和牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的基因序列，及引入所述基因序列得到的具有改变的维生素E含量的转基因植物。
WO 00/68393和WO 00/63391描述了编码叶绿基/异戊二烯基转移酶的基因序列，以及引入所述序列得到的具有修饰的维生素E含量的转基因植物。
WO 00/61771提出固醇代谢基因与生育酚代谢基因的联合可以在转基因植物中导致增加的生育酚含量。
在A.Lopoukhina的博士论文(Characterization of coronatine regulatedgenes from Arabidopsis thaliana，Ruhr-Universitt Bochum，植物生理学系phD论文)和H.Hollnder-Czytko等在“Botanikertagung 2000”，Jena，17-22.9.2000的展讲报告中公开了植物毒素coronatine可诱导的拟南芥基因。在这些基因中的一个基因中，推导的氨基酸序列显示了与已知酪氨酸转氨酶约35％的同源性。通过此推定的酪氨酸转氨酶基因在大肠杆菌(E.coli)中的异源表达检测到低度酪氨酸转氨酶酶活性。已报道，用coronatine处理植物和植物创伤可引起此推导的酪氨酸转氨酶的特异性mRNA、此推导的酪氨酸转氨酶和可测量的酶活性的积累。而且，博士论文的72页以及以下的内容还公开了植物创伤已知可引起活性氧种类的形成，而抗氧化化合物如生育酚，类胡萝卜素或迷迭香酸(rosmaric acid)可将其清除。
尽管除了最后提到的现有技术外，所有这些方法都产生了通常有修饰的维生素E含量的遗传修饰的生物体，特别是植物，但是它们都有缺点，即在现有技术的遗传修饰生物体中维生素E含量的水平还是令人不满意。
因此本发明的目的是提供通过培养生物体生产维生素E的其它方法，或提供生产维生素E的其它转基因生物体，该转基因生物体有优化的特征，例如更高的维生素E含量且不显示上述现有技术的缺陷。
我们发现通过培养比野生型有增加的酪氨酸转氨酶活性的生物体生产维生素E的方法可达到这个目的。
酪氨酸转氨酶活性应理解为意指酪氨酸转氨酶的酶活性。
酪氨酸转氨酶应理解为意指有转化酪氨酸为4-羟苯基丙酮酸的酶活性的蛋白质。
因此，酪氨酸转氨酶活性应理解为意指在特定时间内，通过蛋白质酪氨酸转氨酶转化的酪氨酸的量，或形成的4-羟苯基丙酮酸的量。
因此，如果与野生型比较有增加的酪氨酸转氨酶活性，那么与野生型比较在特定时间内，通过蛋白质酪氨酸转氨酶转化的酪氨酸的量或形成的4-羟苯基丙酮酸的量亦将增加。
该酪氨酸转氨酶活性的增加优选相当于野生型酪氨酸转氨酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，特别优选至少300％，更特别优选至少500％，尤其是至少600％。
野生型应理解为意指相应的非遗传修饰的起始生物体。优选地且特别是在不能准确地判定生物体或野生型的情况下，术语用于增加酪氨酸转氨酶活性、增加羟苯基丙酮酸双加氧酶活性(见下文)、增加尿黑酸叶绿基转移酶活性(见下文)、增加牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶活性(见下文)、增加2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性、增加生育酚环化酶活性(见下文)、增加γ-生育酚甲基转移酶活性(见下文)、降低尿黑酸双加氧酶活性(见下文)、降低马来酰乙酰乙酸异构酶活性(见下文)及降低富马酰乙酰乙酸水解酶活性(见下文)，和用于增加维生素E含量的野生型应理解为意指参照生物体。该参照生物体优选是Brassica napus cv Westar。
可以用各种方式例如通过消除翻译和蛋白质水平的抑制调节机制、或通过例如用植物毒素例如coronatine诱导酪氨酸转氨酶基因或引入编码酪氨酸转氨酶的核酸，使编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因表达超过野生型的基因表达来增加酪氨酸转氨酶活性。
根据本发明，增加编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因表达也应理解为意指操作生物体，特别是植物的内源酪氨酸转氨酶的表达。这可以，例如通过修饰编码酪氨酸转氨酶的基因的启动子DNA序列实现。可以通过DNA序列的缺失或插入实现这种使至少一个内源酪氨酸转氨酶基因具有修饰的，优选增加的表达速率的修饰。
如上所述，通过应用外源刺激物修饰至少一个内源酪氨酸转氨酶的表达是可能的。这可以通过特定生理条件，即通过应用外源物质实现。
而且，可以通过与这些内源酪氨酸转氨酶基因的启动子相互作用的调节蛋白质实现至少一个内源酪氨酸转氨酶基因的修饰的或增加的表达，所述调节蛋白质在非转化的生物体中并不存在。
正如在例如WO 96/06166中所述，这种调节物可以为嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质由DNA结合结构域和转录激活结构域组成。
在优选实施方式中，通过增加编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因表达使酪氨酸转氨酶活性与野生型相比增加。
在进一步优选实施方式中，通过向生物体中引入编码酪氨酸转氨酶的核酸增加编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因表达。
原则上，任何酪氨酸转氨酶基因，即任何编码酪氨酸转氨酶的核酸都可以用于该目的。如果宿主生物体不能表达所述的酪氨酸转氨酶或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组酪氨酸转氨酶核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
说明书中提到的所有核酸均可以是，例如RNA，DNA或cDNA序列。
编码酪氨酸转氨酶的核酸的例子或酪氨酸转氨酶的例子有来源于拟南芥的6个推定的酪氨酸转氨酶TAT I到TAT VI，TAT ICAA23026(核酸SEQ.ID.NO.5，蛋白质SEQ.ID.NO.6)，TAT IICAA23025，TAT IIIAAD23027(核酸SEQ.ID.NO.7，蛋白质SEQ.ID.NO.8)，TAT IVCAA16881，TAT VAAD21706(核酸SEQ.ID.NO.9，蛋白质SEQ.ID.NO.10)，TAT VI(核酸SEQ.ID.NO.11，蛋白质SEQ.ID.NO.12)，褐家鼠(Rattus norvegicus)酪氨酸转氨酶(核酸SEQ.ID.NO.1，蛋白质SEQ.ID.NO.2)，褐家鼠酪氨酸转氨酶的变体(核酸SEQ.ID.NO.3，蛋白质SEQ.ID.NO.4)，人酪氨酸转氨酶(记录号XP_008081)，兰戈尔氏锥虫(Trypanosoma rangeli)酪氨酸转氨酶(记录号AF165323_1)，
克鲁斯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)酪氨酸转氨酶(记录号 AI622965)或苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)酪氨酸转氨酶(记录号L05065)。
优选利用编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO.2或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与SEQ ID NO.2序列有至少20％同一性，优选至少33％同一性，更优选至少35％同一性，更优选至少50％同一性，更特别优选至少70％同一性，最优选至少90％同一性，并且有酪氨酸转氨酶的酶学特征。
序列SEQ ID NO.2组成了褐家鼠酪氨酸转氨酶的氨基酸序列。
在说明书中，术语“置换”应理解为意指一个或多个氨基酸与一个或多个氨基酸的交换。优选进行的交换是称为保守性交换的交换，其中置换氨基酸与原始的氨基酸有相似的特征，例如Glu对Asp，Gln对Asn，Val对Ile，Leu对Ile，Ser对Thr的置换。
缺失是通过直接键接置换氨基酸。优选的缺失位置是多肽的末端和各蛋白质结构域间的连接。
插入是向多肽链中引入氨基酸，形式上为用一个或多个氨基酸替代直接的键接。
两个蛋白质间的同一性应理解为在所有情况下均意指整个蛋白质长度的氨基酸同一性，特别是利用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.在小型计算机上进行快速灵敏的多序列比对，Comput Appl.Biosci.1989 4月；5(2)151-1)借助于DNASTAR，Inc.Madison，Wisconsin(USA)的Lasergene软件通过比对(alignment)计算出的同一性，其中所述计算使用了如下设置的参数多重比对参数空位(gap)罚分 10空位长度罚分 10成对比对参数k-tuple1
空位罚分 3视窗 5保存的对角线(diagonals saved) 5因此，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.2有至少20％同一性的蛋白质应理解为意指对蛋白质序列与序列SEQ ID NO.2进行比对，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时，蛋白质有至少20％同一性。
根据具有上述参数设置的上述程序算法，已知的酪氨酸转氨酶与SEQID NO.2(褐家鼠酪氨酸转氨酶)有下列氨基酸序列同一性(％)CAA23026(TAT I) 26.8％CAA23025(TAT II)22.3％AAD23027(TAT III) 28.3％CAA16881(TAT IV)29.8％AAD21706(TAT V) 30.0％TAT VI K19.P17.14 33.3％AF165323_1(兰戈尔氏锥虫)33.3％XP_008081(人) 91.6％在进一步优选的实施方式中，向生物体中引入编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含褐家鼠酪氨酸转氨酶SEQ ID NO.2氨基酸序列或人酪氨酸转氨酶氨基酸序列(记录号XP_008081)。
可以，例如通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列获得适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用频繁地使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物的密码子使用常常是有利的。
在特别优选的实施方式中，向生物体引入包含序列SEQ ID NO.1的核酸。
序列SEQ ID NO.1组成了褐家鼠酪氨酸转氨酶的cDNA(记录号NM_012668)。
在优选实施方式中，与野生型比较，培养的生物体还具有增加的选自下面的至少一种活性羟苯基丙酮酸双加氧酶活性，尿黑酸叶绿基转移酶活性，牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性，2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性，生育酚环化酶活性和γ-生育酚甲基转移酶活性。
羟苯基丙酮酸双加氧酶活性应理解为意指羟苯基丙酮酸双加氧酶的酶活性。
羟苯基丙酮酸双加氧酶应理解为意指有转化羟苯基丙酮酸为尿黑酸的酶促活性的蛋白质。
因此，羟苯基丙酮酸双加氧酶活性应理解为意指在一定时间内，通过蛋白质羟苯基丙酮酸双加氧酶转化的羟苯基丙酮酸的量或产生的尿黑酸的量。
因此，在与野生型比较增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性中，在一定时间内通过蛋白质羟苯基丙酮酸双加氧酶转化的羟苯基丙酮酸的量或产生的尿黑酸的量较野生型有增加。
羟苯基丙酮酸双加氧酶活性的增加优选相当于野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，甚至更优选至少500％，特别是至少600％。
尿黑酸叶绿基转移酶活性应理解为意指尿黑酸叶绿基转移酶的酶活性。
尿黑酸叶绿基转移酶应理解为意指有转化尿黑酸和叶绿基焦磷酸为2-甲基-6-叶绿基氢醌的酶促活性的蛋白质。
因此，尿黑酸叶绿基转移酶活性应理解为意指在一定时间内，通过蛋白质尿黑酸叶绿基转移酶转化的尿黑酸或叶绿基焦磷酸的量或产生的2-甲基-6-叶绿基氢醌的量。
因此，在与野生型相比增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性中，在一定时间内通过蛋白质尿黑酸叶绿基转移酶转化的尿黑酸或叶绿基焦磷酸的量或产生的2-甲基-6-叶绿基氢醌的量与野生型比较增加。
尿黑酸叶绿基转移酶活性的增加优选相当于野生型尿黑酸叶绿基转移酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，甚至更优选至少500％，特别是至少600％。
牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性应理解为意指牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的酶活性。
牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶应理解为意指有转化牻牛儿牻牛儿-焦磷酸为叶绿基焦磷酸的酶促活性的蛋白质。
因此，牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性应理解为意指在一定时间内，通过蛋白质牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶转化的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸的量或产生的叶绿基焦磷酸的量。
因此，在与野生型相比增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性中，在一定时间内通过蛋白质牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶转化的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸的量或产生的叶绿基焦磷酸的量与野生型比较增加。
牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性的增加优选相当于野生型牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，甚至更优选至少500％，特别是至少600％。
2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性应理解为意指2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的酶活性。
2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶应理解为意指有转化2-甲基-6-叶绿基氢醌为2，3-二甲基-6-叶绿基醌醇的酶促活性的蛋白质。
因此，2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性应理解为意指在一定时间内，通过蛋白质2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶转化的2-甲基-6-叶绿基氢醌的量或产生的2，3-二甲基-6-叶绿基醌醇的量。
因此，在与野生型相比增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性中，在一定时间内通过蛋白质2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶转化的2-甲基-6-叶绿基氢醌的量或产生的2，3-二甲基-6-叶绿基氢醌的量与野生型比较增加。
2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性的增加优选相当于野生型2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选达到至少100％，更优选至少300％，甚至更优选至少500％，特别是至少600％。
生育酚环化酶活性应理解为意指生育酚环化酶的酶活性。
生育酚环化酶应理解为意指有转化2，3-二甲基-6-叶绿基氢醌为γ-生育酚的酶促活性的蛋白质。
因此，生育酚环化酶活性应理解为意指在一定时间内，通过蛋白质生育酚环化酶转化的2，3-二甲基-6-叶绿基氢醌的量，或产生的γ-生育酚的量。
因此，在与野生型相比增加的生育酚环化酶活性中，在一定时间内通过蛋白质生育酚环化酶转化的2，3-二甲基-6-叶绿基氢醌的量或产生的γ-生育酚的量与野生型比较增加。
生育酚环化酶活性的增加优选相当于野生型生育酚环化酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，甚至更优选至少500％，特别是至少600％。
γ-生育酚甲基转移酶活性应理解为意指γ-生育酚甲基转移酶的酶活性。
γ-生育酚甲基转移酶应理解为意指有转化γ-生育酚为α-生育酚的酶促活性的蛋白质。
因此，γ-生育酚甲基转移酶活性应理解为意指在一定时间内，通过蛋白质γ-生育酚甲基转移酶转化的γ-生育酚的量或产生的α-生育酚的量。
因此，在与野生型相比增加的γ-生育酚甲基转移酶活性中，在一定时间内通过蛋白质γ-生育酚甲基转移酶转化的γ-生育酚的量或产生的α-生育酚的量与野生型比较增加。
γ-生育酚甲基转移酶活性的增加优选相当于野生型γ-生育酚甲基转移酶活性的至少5％，更优选至少20％，更优选至少50％，更优选至少100％，更优选至少300％，甚至更优选至少500％，特别是至少600％。
可以通过各种途径，例如通过消除表达水平和蛋白质水平的抑制调节机制，或通过使所涉及的核酸的基因表达较野生型增加，即增加选自以下的至少一个核酸的基因表达编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸、编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸、编码牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的核酸、编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸、编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸，以实现选自以下的至少一个活性的彼此独立地增加羟苯基丙酮酸双加氧酶活性、尿黑酸叶绿基转移酶活性、牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性、2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性、生育酚环化酶活性及γ-生育酚甲基转移酶活性。
也可以通过各种途径，例如通过用激活物诱导相关基因，即通过用激活物诱导羟苯基丙酮酸双加氧酶基因、尿黑酸叶绿基转移酶基因、牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶基因，2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因、生育酚环化酶基因或γ-生育酚甲基转移酶基因，或通过向生物体引入相关核酸的一个或多个基因拷贝，即通过引入选自以下的至少一个核酸编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸、编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸、编码牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的核酸、编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸、编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸，实现与野生型相比增加的所论及核酸的基因表达。
根据本发明，增加编码羟苯基丙酮酸双加氧酶、尿黑酸叶绿基转移酶、牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶、2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶、生育酚环化酶或γ-生育酚甲基转移酶的核酸的基因表达应理解为也意指操作生物体本身，特别是植物本身的内源羟苯基丙酮酸双加氧酶、尿黑酸叶绿基转移酶、牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶、2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶、生育酚环化酶或γ-生育酚甲基转移酶的表达。
这可以例如通过修饰编码羟苯基丙酮酸双加氧酶，尿黑酸叶绿基转移酶，牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶，2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶，生育酚环化酶或γ-生育酚甲基转移酶的基因的启动子DNA序列来实现。例如可以通过DNA序列的缺失或插入实现可引起相关基因表达速率增加的这种修饰。
如上所述，通过外源刺激物的应用改变内源羟苯基丙酮酸双加氧酶，尿黑酸叶绿基转移酶，牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶，2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶，生育酚环化酶或γ-生育酚甲基转移酶的表达是可能的。这可以通过特定的生理学条件，即通过施用外源物质实现。
而且，可以通过在非转化的生物体中并不存在的可与这些基因的启动子相互作用的调节蛋白质实现内源羟苯基丙酮酸双加氧酶，尿黑酸叶绿基转移酶，牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶，2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶，生育酚环化酶或γ-生育酚甲基转移酶基因的表达改变或增加。
正如在例如WO 96/06166中所述，这种调节物可以为嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质由DNA结合结构域和转录激活结构域组成。
在一个优选实施方式中，通过向生物体中引入至少一个编码羟苯基丙酮酸双加氧酶(此后也称为HPPD)的核酸实现编码HPPD的核酸的基因表达增加。
原则上，任何HPPD基因，即任何编码HPPD的核酸都可以用于这个目的。
如果宿主生物体不能表达所述的HPPD或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组HPPD核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
HPPD基因的例子是编码拟南芥HPPD(核酸Seq.ID.No.13，蛋白质Seq.ID.No.14)或大麦HPPD(WO 99/04021)的核酸。
在这个优选实施方式中，因此，根据本发明，与野生型比较在转基因生物体中存在至少一个另外的HPPD基因。在这个优选实施方式中，相应地，生物体有至少一个编码HPPD的外源核酸或至少两个编码HPPD的内源核酸。
优选用在上述优选实施方式中的核酸是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.14或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与SEQ ID NO.14序列有至少30％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少90％同一性，最优选至少95％同一性，且有HPPD的酶学特性。
序列SEQ.ID.NO.14组成了拟南芥HPPD的氨基酸序列。
相应地，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.14有至少30％同一性的蛋白质应理解为意指当蛋白质序列与序列SEQ ID NO.14进行比对，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时蛋白质有至少30％同一性。
通过数据库中氨基酸序列或相应的逆向翻译的核酸序列与SEQ IDNO.14的同源性比较，可以容易地从各种已知基因组序列的生物体发现HPPD和HPPD基因的其它例子。
例如，大麦HPPD与拟南芥HPPD(SEQ.ID.No.14)有57.5％同一性。
此外，可以例如，从序列SEQ ID NO.13开始以本身已知的方法利用杂交和PCR技术从基因组序列未知的各种生物体中容易地发现HPPD和HPPD基因的其它例子。
在一个进一步特别优选的实施方式中，通过向生物体中引入编码包含拟南芥HPPD氨基酸序列(SEQ.ID.NO.14)的蛋白质的核酸增加羟苯基丙酮酸双加氧酶活性。
例如，通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列可以得到适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用常常使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物的密码子使用常常是有利的。
在特别优选的实施方式中，向生物体中引入包含序列SEQ.ID.NO.13的核酸。
序列SEQ.ID.NO.13组成了编码序列SEQ.ID.NO.14的HPPD的拟南芥(A.thaliana)基因组DNA。
而且，以本身已知的方法，例如通过双螺旋的各个重叠互补核酸单元的片段缩合可以从核苷酸单元化学合成所有上述HPPD基因。例如，以已知的方式通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等，(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应进行的合成寡核苷酸添加和缺口补平及一般的克隆方法。
在一个优选实施方式中，通过向生物体中引入至少一个编码尿黑酸叶绿基转移酶(此后也称为HPT)的核酸实现编码HPT的核酸的基因表达增加。
原则上，任何HPT基因，即任何编码HPT的核酸都可以用于这个目的。
如果宿主生物体不能表达所述的HPT或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组HPT核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
HPT基因的例子是编码拟南芥HPT(核酸Seq.ID.No.15，蛋白质Seq.ID.No.16)的核酸或编码大豆(Glycine max)，向日葵(Helianthusannuus)，烟草(Nicotiana tabacum)，展叶剑叶藓(Physcomitrella patens)，欧洲油菜(Brassica napus)，稻(Oryza sativa)，大麦(Hordeum vulgaris)或集胞藻属物种(Synechocystis sp.)PCC6803的HPT的核酸。
在这个优选实施方式中，因此，根据本发明，与野生型比较在转基因生物体中存在至少一个另外的HPT基因。在这个优选实施方式中，相应地，生物体有至少一个编码HPT的外源核酸或至少两个编码HPT的内源核酸。
优选用在上述优选实施方式中的核酸是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.16或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.16有至少30％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少90％同一性，最优选至少95％同一性，并且有HPT的酶学特性。
序列SEQ.ID.NO.16组成了拟南芥HPT的氨基酸序列。
相应地，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.16有至少30％同一性的蛋白质应理解为意指当蛋白质序列与序列SEQ ID NO.16比对时，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时，蛋白质有至少30％同一性。
通过数据库中氨基酸序列或相应的逆向翻译的核酸序列与SEQ IDNO.16的同源性比较，可以容易地从各种已知基因组序列的生物体发现HPT和HPT基因的其它例子。
例如，集胞藻PCC6803的HPT与拟南芥的HPT(Seq.ID.No.16)有40.9％同一性。
此外，可以例如从序列SEQ ID NO.15开始以本身已知的方式利用杂交和PCR技术从基因组序列未知的各种生物体中容易地发现其它HPT和HPT基因例子。
在一个进一步特别优选的实施方式中，通过向生物体中引入编码包含拟南芥HPT氨基酸序列(SEQ.ID.NO.16)的蛋白质的核酸增加尿黑酸叶绿基转移酶活性。
例如，通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列可以得到适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用常常使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物的密码子使用常常是有利的。
在特别优选的实施方式中，向生物体中引入包含序列SEQ.ID.NO.15的核酸。
序列SEQ.ID.NO.15组成了编码序列SEQ.ID.NO.16的HPT的拟南芥(A.thaliana)基因组DNA。
而且，以本身已知的方法，例如通过双螺旋的各个重叠互补核酸单元的片段缩合可以从核苷酸单元化学合成所有上述HPT基因。例如，以已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等，(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应进行的合成寡核苷酸的添加和缺口的补平及一般的克隆方法。
在一个优选实施方式中，通过向生物体中引入至少一个编码牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶(此后也称为GGPPOR)的核酸实现编码GGPPOR的核酸的基因表达增加。
原则上，任何GGPPOR基因，即任何编码GGPPOR的核酸都可以用于这个目的。
如果宿主生物体不能表达所述的GGPPOR或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组GGPPOR核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
GGPPOR基因的例子是编码烟草GGPPOR(核酸Seq.ID.No.17，蛋白质Seq.ID.No.18)的核酸或编码拟南芥，大豆，向日葵，展叶剑叶藓，欧洲油菜，稻，大麦或集胞藻PCC6803的GGPPOR的核酸。
在这个优选实施方式中，因此，根据本发明，与野生型比较在转基因生物体中存在至少一个另外的GGPPOR基因。在这个优选实施方式中，相应地，生物体有至少一个编码GGPPOR的外源核酸或至少两个编码GGPPOR的内源核酸。
优选用在上述优选实施方式中的核酸是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.18或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.18有至少30％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少90％同一性，最优选至少95％同一性，并且有GGPPOR的酶学特性。
序列SEQ.ID.NO.18构成了烟草GGPPOR的氨基酸序列。
相应地，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.18有至少30％同一性的蛋白质应理解为意指当蛋白质序列与序列SEQ ID NO.18比对时，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时，蛋白质有至少30％同一性。
通过数据库中氨基酸序列或相应的逆向翻译的核酸序列与SEQ IDNO.18的同源性比较，可以容易地从各种已知基因组序列的生物体发现其它GGPPOR和GGPPOR基因的例子。
例如，拟南芥的GGPPOR与烟草的GGPPOR(SEQ.ID.No.18)有80％同一性。
此外，可以例如，从序列SEQ ID NO.17开始以本身已知的方式利用杂交和PCR技术从基因组序列未知的各种生物体中容易地发现其它GGPPOR和GGPPOR基因的例子。
在一个进一步特别优选的实施方式中，通过向生物体中引入编码包含烟草GGPPOR氨基酸序列(SEQ.ID.No.18)的蛋白质的核酸增加牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性。
例如，通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列可以得到适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用常常使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物的密码子使用常常是有利的。
在特别优选实施方式中，向生物体中引入包含序列SEQ.ID.NO.17的核酸。
序列SEQ.ID.NO.17构成了编码序列SEQ.ID.NO.18的GGPPOR的烟草基因组DNA。
而且，以本身已知的方式，例如通过双螺旋的各个重叠互补核酸单元的片段缩合可以从核苷酸单元化学合成所有上述GGPPOR基因。例如，以已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press NewYork，896-897页)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等，(1989)，Molecular cloningA laboratory manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应进行的合成寡核苷酸的添加和缺口的补平及一般的克隆方法。
在一个优选实施方式中，通过向生物体中引入至少一个编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶(此后也称为MT1)的核酸实现编码MT1的核酸的基因表达增加。
原则上，任何MT1基因，即任何编码MT1的核酸都可以用于这个目的。
如果宿主生物体不能表达所述的MT1或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组MT1核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
MT1基因的例子是编码集胞藻PCC6803的MT1(核酸Seq.ID.No.19，蛋白质Seq.ID.No.20)的核酸。
在这个优选实施方式中，因此，根据本发明，与野生型比较在转基因生物体中存在至少一个另外的MT1基因。在这个优选实施方式中，相应地，生物体有至少一个编码MT1的外源核酸或至少两个编码MT1的内源核酸。
优选用在上述优选实施方式中的核酸是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.20或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.20有至少30％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少90％同一性，最优选至少95％同一性，并且有MT1的酶学特性。
序列SEQ.ID.NO.20组成了集胞藻PCC6803的MT1的氨基酸序列。
相应地，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.20有至少30％同一性的蛋白质应理解为意指当蛋白质序列与序列SEQ ID NO.20比对时，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时，蛋白质有至少30％同一性。
通过数据库中氨基酸序列或相应的逆向翻译的核酸序列与SEQ IDNO.20的同源性比较，可以容易地从各种已知基因组序列的生物体发现其它的MT1和MT1基因的例子。
此外，可以例如从序列SEQ ID NO.19开始，以本身已知的方式利用杂交和PCR技术从基因组序列未知的各种生物体中容易地发现其它的MT1和MT1基因的例子。
在一个进一步特别优选的实施方式中，通过向生物体中引入编码包含集胞藻PCC6803的MT1氨基酸序列(SEQ.ID.No.20)的蛋白质的核酸增加2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性。
例如，通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列可以得到适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用常常使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物密码子的使用常常是有利的。
在特别优选的实施方式中，向生物体中引入包含序列SEQ.ID.NO.19的核酸。
序列SEQ.ID.NO.19组成了编码序列SEQ.ID.NO.20的MT1的集胞藻PCC6803基因组DNA。
而且，以本身已知的方式从核苷酸单元出发，例如通过双螺旋的各个重叠互补核酸单元的片段缩合可以化学合成所有上述MT1基因。例如，以已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press NewYork，896-897页)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等，(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应进行的合成寡核苷酸的添加和缺口的补平及一般的克隆方法。
在一个优选实施方式中，通过向生物体中引入至少一个编码生育酚环化酶(此后也称为CYC)的核酸实现编码CYC的核酸的基因表达增加。
原则上，任何CYC基因，即任何编码CYC的核酸都可以用于这个目的。
如果宿主生物体不能表达所述的CYC或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组CYC核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
CYC基因的例子是编码集胞藻PCC6803的CYC(核酸Seq.ID.No.21，蛋白质Seq.ID.No.22)的核酸或编码大豆，向日葵，烟草，展叶剑叶藓，欧洲油菜，稻，拟南芥或大麦的CYC的核酸。
在这个优选实施方式中，因此，根据本发明，与野生型比较在转基因生物体中存在至少一个另外的CYC基因。在这个优选实施方式中，相应地，生物体有至少一个编码CYC的外源核酸或至少两个编码CYC的内源核酸。
优选用在上述优选实施方式中的核酸是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.22或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.22有至少30％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少90％同一性，最优选至少95％同一性，并且有CYC的酶学特性。
序列SEQ.ID.NO.22组成了集胞藻PCC6803的CYC的氨基酸序列。
相应地，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.22有至少30％同一性的蛋白质应理解为意指当蛋白质序列与序列SEQ ID NO.22比对时，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时，蛋白质有至少30％同一性。
通过数据库中氨基酸序列或相应的逆向翻译的核酸序列与SEQ IDNO.22的同源性比较，可以容易地从各种已知基因组序列的生物体发现其它的CYC和CYC基因的例子。
例如，拟南芥的CYC与集胞藻PCC6803的CYC(SEQ ID NO.22)有29.1％同一性。
此外，可以例如从序列SEQ ID NO.21开始，以本身已知的方式，利用杂交和PCR技术从基因组序列未知的各种生物体中容易地发现其它的CYC和CYC基因的例子。
在一个进一步特别优选的实施方式中，通过向生物体中引入编码包含集胞藻PCC6803的CYC氨基酸序列(SEQ.ID.No.22)的蛋白质的核酸增加生育酚环化酶活性。
例如，通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列可以得到适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用常常使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物的密码子使用常常是有利的。
在特别优选实施方式中，向生物体中引入包含序列SEQ.ID.NO.21的核酸。
序列SEQ.ID.NO.21组成了编码序列SEQ.ID.NO.22的CYC的集胞藻PCC6803基因组DNA。
而且，以本身已知的方法从核苷酸单元出发，例如通过双螺旋的各重叠互补核酸单元的片段缩合可以化学合成所有上述CYC基因。例如，以已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，896-897页)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等，(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应进行的合成寡核苷酸的添加和缺口的补平及一般的克隆方法。
在一个优选实施方式中，通过向生物体中引入至少一个编码γ-生育酚甲基转移酶(此后也称为γ-TMT)的核酸实现编码γ-TMT的核酸的基因表达增加。
原则上，任何γ-TMT基因，即任何编码γ-TMT的核酸都可以用于这个目的。
如果宿主生物体不能表达所述的γ-TMT或不能被改造而具有此能力，那么在包含内含子的真核生物来源的基因组γ-TMT核酸序列的情况下，优选利用已经加工的核酸序列，如相应的cDNA。
γ-TMT基因的例子是编码拟南芥γ-TMT(核酸Seq.ID.No.23，蛋白质Seq.ID.No.24)的核酸或编码大豆，向日葵，烟草，展叶剑叶藓，欧洲油菜，稻，大麦或集胞藻PCC6803的γ-TMT的核酸。
在这个优选实施方式中，因此，根据本发明，与野生型比较在转基因生物体中存在至少一个另外的γ-TMT基因。在这个优选实施方式中，相应地，生物体有至少一个编码γ-TMT的外源核酸或至少两个编码γ-TMT的内源核酸。
优选用在上述优选实施方式中的核酸是编码蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ.ID.NO.24或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述衍生序列在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.24有至少30％同一性，优选至少50％同一性，更优选至少70％同一性，更优选至少90％同一性，最优选至少95％同一性，并且有γ-TMT的酶学特性。
序列SEQ.ID.NO.24组成了拟南芥γ-TMT的氨基酸序列。
相应地，在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.24有至少30％同一性的蛋白质应理解为意指当蛋白质序列与序列SEQ ID NO.24比对时，特别是利用具有上述参数设置的上述程序算法比对时，蛋白质有至少30％同一性。
通过数据库中氨基酸序列或相应的逆向翻译的核酸序列与SEQ IDNO.24的同源性比较，可以容易地从各种已知基因组序列的生物体发现其它的γ-TMT和γ-TMT基因的例子。
例如，集胞藻PCC6803的γ-TMT与拟南芥的γ-TMT(SEQ ID NO.24)有26.7％同一性。
此外，可以例如从序列SEQ ID NO.23开始，以本身已知的方式利用杂交和PCR技术从基因组序列未知的各种生物体中容易地发现其它的γ-TMT和γ-TMT基因的例子。
在一个进一步特别优选的实施方式中，通过向生物体中引入编码包含拟南芥γ-TMT氨基酸序列(SEQ ID NO.24)的蛋白质的核酸，增加γ-生育酚甲基转移酶活性。
例如，通过根据遗传密码逆向翻译多肽序列可以得到适合的核酸序列。
优选用于该目的的密码子是根据生物体特异的密码子使用常常使用的密码子。借助于对所述生物体的其它已知基因的计算机评估可以容易地确定密码子使用。
如果，例如在植物中表达蛋白质，则在逆向翻译时利用植物密码子的使用常常是有利的。
在特别优选的实施方式中，向生物体中引入包含序列SEQ.ID.NO.23的核酸。
序列SEQ.ID.NO.23组成了编码序列SEQ.ID.NO.24的γ-TMT的拟南芥(A.thaliana)基因组DNA。
而且，以本身已知的方法从核苷酸单元出发，例如通过双螺旋的各个重叠互补核酸单元的片段缩合可以化学合成所有上述γ-TMT基因。例如，以已知的方式，通过亚磷酰胺方法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press NewYork，896-897页)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等，(1989)，Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应进行的合成寡核苷酸的添加和缺口的补平及一般的克隆方法。
在该方法的进一步优选实施方式中，此外，与野生型比较，生物体还具有至少一个降低的选自下列的活性尿黑酸双加氧酶活性、马来酰乙酰乙酸异构酶活性和富马酰乙酰乙酸水解酶活性。
降低的活性应理解为意指活性的降低和完全消除。因此，降低的活性也包括生物体中所述蛋白质的量的减少直至所述蛋白质的完全缺乏，这可以例如，通过缺少可检测的所述酶活性或通过缺少免疫学可检测的所述蛋白质来检验。
尿黑酸双加氧酶活性应理解为意指尿黑酸双加氧酶的酶活性。
尿黑酸双加氧酶应理解为意指有转化尿黑酸为马来酰乙酰乙酸的酶促活性的蛋白质。
相应地，尿黑酸双加氧酶活性应理解为意指在特定时间内，通过蛋白质尿黑酸双加氧酶转化的尿黑酸的量或产生的马来酰乙酰乙酸的量。
因此，与野生型比较，降低的尿黑酸双加氧酶活性应理解为意指与野生型比较，在一定时间内通过此蛋白质尿黑酸双加氧酶转化的尿黑酸的量或产生的马来酰乙酰乙酸的量。
优选地，该尿黑酸双加氧酶活性的降低达到至少5％，更优选达到至少20％，更优选达到至少50％，更优选达到100％。特别优选的是尿黑酸双加氧酶活性的完全消除。
马来酰乙酰乙酸异构酶活性应理解为意指马来酰乙酰乙酸异构酶的酶活性。
马来酰乙酰乙酸异构酶应理解为意指有转化马来酰乙酰乙酸为富马酰乙酰乙酸的酶促活性的蛋白质。
相应地，马来酰乙酰乙酸异构酶活性应理解为意指在特定时间内，通过蛋白质马来酰乙酰乙酸异构酶转化的马来酰乙酰乙酸的量或产生的富马酰乙酰乙酸的量。
因此，与野生型比较，降低的马来酰乙酰乙酸异构酶活性应理解为意指与野生型比较，在一定时间内通过蛋白质马来酰乙酰乙酸异构酶转化的马来酰乙酰乙酸的量或产生的富马酰乙酰乙酸的量。
优选地，该马来酰乙酰乙酸异构酶活性的降低达到至少5％，更优选达到至少20％，更优选达到至少50％，更优选达到100％。特别优选的是马来酰乙酰乙酸异构酶活性的完全消除。
富马酰乙酰乙酸水解酶活性应理解为意指富马酰乙酰乙酸水解酶的酶活性。
富马酰乙酰乙酸水解酶应理解为意指有转化富马酰乙酰乙酸为延胡索酸的酶促活性的蛋白质。
相应地，富马酰乙酰乙酸水解酶活性应理解为意指在特定时间内，通过蛋白质富马酰乙酰乙酸水解酶转化的富马酰乙酰乙酸的量或产生的延胡索酸的量。
因此，与野生型比较，降低的富马酰乙酰乙酸水解酶活性应理解为意指与野生型比较，在一定时间内通过蛋白质富马酰乙酰乙酸水解酶转化的富马酰乙酰乙酸的量或产生的延胡索酸的量。
优选地，该富马酰乙酰乙酸水解酶活性的降低达到至少5％，更优选达到至少20％，更优选达到至少50％，更优选达到100％。特别优选的是富马酰乙酰乙酸水解酶活性的完全消除。
尿黑酸双加氧酶此后也称为HGD，马来酰乙酰乙酸异构酶此后也称为MAAI，富马酰乙酰乙酸水解酶此后也称为FAAH。
有许多可以以期望的方式降低HGD，MAAI和/或FAAH活性的不同方法。
一个可能的方法包括至少一种核酸序列，此后也称为抗-HGD、抗-MAAI或抗-FAAH的应用，所述核酸序列能转录为反义核酸序列，该反义核酸序列能抑制HGD、MAAI和/或FAAH活性，例如抑制内源HGD、MAAI和/或FAAH的表达。
根据优选的实施方式，这些抗-HGD，抗-MAAI或抗-FAAH核酸序列可以包含反义方向的HGD，MAAI和/或FAAH的编码核酸序列或相应序列的功能等同片段。
反义策略可以有利地与核酶方法结合。核酶是与反义序列偶联能催化切割靶序列的催化活性RNA序列(Tanner NK.FEMS Microbiol Rev.1999；23(3)257-75)。这可以增加反义策略的效力。
在生物体中，特别是在植物中降低HGD，MAAI和/或FAAH的表达的另外方法包括对可引起共抑制的同源HGD，MAAI和/或FAAH核酸序列的过量表达(Jorgensen等，Plant Mol.Biol.1996，31(5)957-973)或借助于病毒表达系统(扩增子)诱导植物降解特异RNA(Angell，SM等，Plant J.1999，20(3)357-362)。这些方法也称为转录后基因沉默(PTGS)。
其它方法还有通过向植物中引入RNA/DNA寡核苷酸将无义突变引入内源基因(endogen)中(Zhu等，Nat.Biotechnol.2000，18(5)555-558)或借助于例如T-DNA诱变产生剔除突变体(Koncz等，Plant Mol.Biol.1992，20(5)963-976)或进行同源重组(Hohn，B.和Puchta，H，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1999，968321-8323.)。而且，还可以利用特异DNA结合因子，例如上述锌指转录因子类型的因子使基因过量表达或基因阻遏。而且，可以向细胞中引入抑制靶蛋白质本身的因子。该蛋白质结合因子可以是例如适体(aptamer)(Famulok M，和Mayer G.Curr Top Microbiol Immunol.1999；243123-36)。
降低至少一种上述活性的另一个方法是使用含有双螺旋结构区域的RNA，所述RNA在该区域中含有与将要降低的靶序列的一部分相同的核酸序列。在WO 99/32619中公开了该方法(也称为RNAi技术)的详细描述。
在一个优选实施方式中，还通过与野生型比较降低选自编码尿黑酸双加氧酶的核酸、编码马来酰乙酰乙酸异构酶的核酸及编码富马酰乙酰乙酸水解酶的核酸中的至少一个核酸的基因表达实现HGD、MAAI和FAAH活性中至少一个活性的另外降低。
可以如上所述，优选利用下面方法实现与野生型比较选自编码尿黑酸双加氧酶的核酸、编码马来酰乙酰乙酸异构酶的核酸和编码富马酰乙酰乙酸水解酶的核酸中的至少一个核酸的基因表达降低a)引入反义核酸序列；b)与核酶方法联合引入反义核酸序列；c)引入编码同源HGD、MAAI和/或FAAH及可引起共抑制的核酸序列；d)引入可引起HGD、MAAI和/或FAAH降解的表达构建体和病毒核酸序列；e)向编码HGDs、MAAI和/或FAAH的内源核酸序列中引入无义突变；f)引入剔除突变；g)引入适于同源重组的核酸序列；h)引入含有双螺旋结构区域并且在该区域中含有与内源靶核酸序列的一部分相同的核酸序列的RNA。
上述方法的联合应用也是可行的。
在此方法的特别优选实施方式中，生物体具有降低的尿黑酸双加氧酶活性。
这特别优选通过向生物体中引入如下RNA实现，所述RNA含有双螺旋结构区域且该区域中含有与编码尿黑酸双加氧酶的内源靶核酸序列的一部分相同的核酸序列。在WO 99/32619中公开了该方法(也称为RNAi技术)的详细描述。
根据所用的生物体，相应地利用编码尿黑酸双加氧酶的内源核酸的不同片段部分。
例如，SEQ.ID.No.25为欧洲油菜HGD-编码核酸的部分片段，将其整合进入适合的RNAi构建体中可降低欧洲油菜中的HGD活性。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方式中，通过培养生物体，特别是植物生产维生素E，与野生型比较，所述生物体显示了增加的酪氨酸转氨酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的生育酚环化酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和降低的马来酰乙酰乙酸异构酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和降低的富马酰乙酰乙酸水解酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性、增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的生育酚环化酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和尿黑酸叶绿基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，
增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的生育酚环化酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的生育酚环化酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性和增加的生育酚环化酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性和增加的生育酚环化酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性，增加的酪氨酸转氨酶活性和增加的羟苯基丙酮酸双加氧酶活性和增加的尿黑酸叶绿基转移酶活性和增加的牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶活性和增加的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性和增加的生育酚环化酶活性和增加的γ-生育酚甲基转移酶活性及降低的尿黑酸双加氧酶活性。
根据本发明，生物体应理解为意指作为野生型或由于遗传修饰能生产维生素E的原核生物体或真核生物体，例如细菌，酵母，藻类，藓类，真菌或植物。优选的生物体是具光合作用活性的生物体例如蓝细菌，藓类，藻类或植物，它们作为野生型已经能产生维生素E。
特别优选的生物体是植物。
优选的植物是万寿菊属(Targetes)，向日葵属(Sunflower)，拟南芥属(Arabidopsis)，烟草属(tobacco)，辣椒属(red pepper)，大豆属(Soybean)，番茄属(tomato)，茄子(eggplant)，辣椒属(Capsicum)，胡萝卜属(carrot)，马铃薯(potato)，玉蜀黍属(maize)，莴苣属(lettuces)和甘蓝(cabbage)物种，谷类(cereal)，苜蓿(alfalfa)，燕麦属(oat)，大麦属(barley)，黑麦属(rye)，小麦属(wheat)，小黑麦属(triticale)，高梁属(sorghum)和粟(millet)，稻属(rice)，苜蓿属(lucerne)，亚麻属(flax)，棉属(cotton)，大麻属(hemp)，十字花科(Brassicaceae)如油籽油菜(oilseed rape)或Canola，甜菜(sugarbeet)，甘蔗(sugarcane)，坚果(nut)和葡萄属(grapevine)种或木本物种如杨属(aspen)或红豆杉属(yew)。
特别优选的是拟南芥，万寿菊(Tagetes erecta)，欧洲油菜，烟草，向日葵，Canola，马铃薯或大豆。
在本发明生产维生素E的方法中，在培养遗传修饰生物体(此后也称为转基因生物体)的步骤后，优选收获生物体和从生物体分离维生素E。
以适合所述生物体的本身已知方法收获生物体。例如，可以通过离心，倾析或过滤分离可以在液体培养基中发酵生长的微生物如细菌，藓类，酵母和真菌或植物细胞。植物可以以本身已知的方法培养在培养基上，并以适合的方式收获。
可以以本身已知的方法，例如通过提取以及如果适合，进一步的化学或物理纯化方法例如沉淀方法，晶体学方法，热分离方法如精馏方法或物理分离方法例如层析法从收获的生物量分离维生素E。
例如，优选通过化学转化和蒸馏从植物油或从植物油除臭时得到的蒸汽馏出液(除臭器冷凝液)中分离出含油植物中的维生素E。
从除臭器冷凝液分离维生素E的其它方法在例如DE 3126110A1，EP171009A2，GB 2145079，EP 333472A2和WO 94/05650中描述。
优选通过用包含上述编码酪氨酸转氨酶的核酸的核酸构建体转化起始生物体，特别是植物产生转基因生物体，特别是植物，其中所述核酸可操作地连接一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号。
优选地，本发明核酸构建体还包含一个，两个或三个选自以下的核酸编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸，编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸，编码牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的核酸，编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸，编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸，所述核酸可操作地与一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号连接。
在另一个优选实施方式中，在可操作连接的方式，上述核酸构建体还包含具有双螺旋结构区域的RNA，其中在所述区域中有与编码尿黑酸双加氧酶的核酸的一部分相同的核酸序列。
特别是在植物中，用一个核酸构建体增加或降低四种以上的活性在技术上是困难的。这是为什么在生物体中优选利用核酸构建体的组合以增加或降低活性，特别是增加或降低四种以上的活性的原因。
然而，对已经包含修饰活性的遗传修饰生物体进行杂交也是可以的。例如，对包含各种情况的两种修饰活性的遗传修饰生物体进行杂交可以产生具有四种修饰活性的生物体。通过向生物体中引入两个核酸构建体的组合，其中每个构建体修饰2种活性，也可以实现相同的结果。
在优选实施方式中，通过引入核酸构建体的组合产生优选的遗传修饰生物体。
因此，本发明特别涉及核酸构建体的组合，其中所述组合包括含有上述编码酪氨酸转氨酶的核酸及与该核酸可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，并包括a)至少一个选自A到F的另外核酸构建体A 包含编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸及与其可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，B 包含编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸及与其可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，C 包含编码牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的核酸及与其可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，D 包含编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸及与其可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，E 包含编码生育酚环化酶的核酸及与其可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，F 包含编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸及与其可操作地连接的一个或多个保证生物体中转录和翻译的调节信号的核酸构建体，或b)至少一个另外的核酸构建体，其包含选自A到F核酸构建体的两个，三个或四个核酸构建体。
在这些核酸构建体中编码核酸序列可操作地连接一个或多个保证生物体中，特别是植物中转录和翻译的调节信号，这些核酸构建体此后也称为表达盒子。
因此，本发明也涉及核酸构建体，特别是作为表达盒子的核酸构建体，其包含编码酪氨酸转氨酶的核酸，所述核酸可操作地连接一个或多个保证生物体中，特别是植物中转录和翻译的调节信号。
优选地，调节信号包含一个或多个保证生物体中，特别是植物中转录和翻译的启动子。
表达盒子包含调节信号，即控制宿主细胞中编码序列表达的调节核酸序列。根据优选实施方式，表达盒子在上游，即编码序列5’-端包含启动子，在下游，即3’-端包含聚腺苷酸化信号，以及如果适合，还包含另外的调节元件，这些调节元件可操作地与编码至少一个上述基因的插入编码序列连接。可操作地连接应理解为意指启动子、编码序列、终止子和如果适合，另外的调节元件的顺序排列方式使得编码序列表达时这每个调节元件都能完成其期望的功能。
当利用植物作为生物体时，优选地，本发明核酸构建体和表达盒子包含保证在质体中定位的编码质体转运肽的核酸。
在下文中将描述优选用于植物的核酸构建体、表达盒子和载体的例子，和产生转基因植物的方法及转基因植物本身。
用于可操作连接的优选序列有保证在质外体，液泡，质体，线粒体，内质网(ER)，核，油质体或其它区室中进行亚细胞定位的引导肽和翻译增强子如烟草花叶病毒5’-前导序列(Gallie等，Nucl.Acids Res.15(1987)，8693-8711)，但并不限于此。
原则上，表达盒子中适合的启动子是能控制植物中外源基因表达的所有启动子。特别优选利用植物启动子或来源于植物病毒的启动子。尤其优选花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子(Franck等，Cell 21(1980)，285-294)。已知，该启动子包含不同的转录效应物识别序列，这些转录效应物将整体引起引入基因的永久和组成型表达(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
表达盒子也可以包含化学诱导的启动子，通过该启动子可以在特定时间点控制植物中靶基因的表达。可以利用的这种启动子的例子是PRP1启动子(Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)，361-366)，水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)，苯磺酰胺诱导的启动子(EP-A 388186)，四环素诱导的启动子(Gatz等，(1992)Plant J.2，397-404)，脱落酸诱导的启动子(EP-A335528)或乙醇或环己酮诱导的启动子(WO 93/21334)。
特别地，其它优选的启动子是保证在组织或植物部分中，例如在发生维生素E或其前体生物合成的组织或植物部分中表达的启动子。特别必须提到的启动子是保证叶特异性表达的启动子。可提到的有马铃薯胞质FBPase启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-245)。
借助于种子特异性启动子，在转基因烟草植物种子中，外源蛋白质可以以达到总的可溶性种子蛋白质0.67％的量稳定表达(Fiedler和Conrad，Bio/Technology 10(1995)，1090-1094)。因此，表达盒子可以包含，例如，种子特异性启动子(优选菜豆蛋白启动子(US 5504200)，USP启动子(Baumlein，H.等，Mol.Gen.Genet.(1991)225(3)，459-467)，LEB4启动子(Fiedler和Conrad，1995)，蔗糖结合蛋白质启动子(参考文献))、LEB4信号肽、将要被表达的基因和ER停留信号。
植物中维生素E生物合成的位点有叶组织等，因此本发明编码酪氨酸转氨酶的核酸的叶特异性表达是有意义的。然而，因为该表达也可以以组织特异性方式发生在植物的所有其它部分，特别是脂肪种子中，所以这不是限制性的。
因此，另一个优选实施方式涉及上述核酸的种子特异性表达。
此外，外源靶基因的组成型表达是有利的。然而另一方面，也可能期望诱导型表达。
例如，可以体外通过茎分生组织繁殖检测重组表达的靶基因的表达效率。而且，可以用试验植物，在温室实验中测试类型和水平已经被改变的靶基因的表达和它对维生素E生物合成速率的影响。
优选利用例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1989)中和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)和Ausubel，F.M.等，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc和Wiley-Interscience(1987)中所述的常规重组和克隆技术，通过适合启动子和上述靶核酸、及优选地插在启动子与靶核酸序列间编码叶绿体特异性转运肽的核酸及聚腺苷酸化信号的融合产生表达盒子。
插入的核酸序列特别优选是保证靶向质体中的序列。
然而，也可以利用这样的表达盒子，即该表达盒子的核酸序列编码靶蛋白融合蛋白质，所述融合蛋白质的一部分是可控制多肽转运的转运肽。优选的是叶绿体特异性转运肽，在靶蛋白质转运进入叶绿体后，所述叶绿体特异性转运肽将从靶蛋白质部分酶促切离。
特别优选的是来源于烟草质体转酮醇酶或来源于另一转运肽(例如，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基或铁氧还蛋白NADP氧化还原酶或异戊烯-焦磷酸异构酶-2的转运肽)的转运肽或其功能等同物。
特别优选的是如下三种可读框中烟草质体转酮醇酶质体转运肽的三个核酸序列盒子，该三个盒子的形式为KpnI/BamHI片段，在NcoI切割位点中有ATG密码子，pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHI
pTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI质体转运肽的另一个例子是拟南芥质体异戊烯-焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽。
可以合成制备或天然获得本发明核酸，或本发明核酸可以包含合成和天然核酸组分的混合物，或由来自各种生物体的各种异源基因片段组成。
如上所述，优选具有植物优选密码子的合成核苷酸序列。可以从在大多数目的植物物种中表达的具有最高蛋白质频率的密码子确定植物优选的密码子。
当制备表达盒子时，可以操纵各种DNA片段以获得适宜在正确方向中阅读且装配有正确可读框的核苷酸序列。为了使DNA片段互相连接，片段上可以连接衔接子或接头。
可以适宜地在转录方向上提供启动子和终止子区，以及包含一个或多个用于插入序列的限制位点的接头或多接头。通常，接头有1到10个，大多数情况下1到8个，优选2到6个限制位点。一般地，调节区内的接头的长度小于100bp，常常小于60bp，但至少有5bp的大小。相对于宿主植物，启动子可以是天然的或同源的，或外来的或异源的。优选地，按转录的5’-3’方向，表达盒子包含启动子，编码核酸序列或核酸构建体和转录终止区域。如需要，各种终止区可以互换。
而且，可以操作以提供适合的限制性切割位点或移除多余DNA或限制性切割位点。在插入、缺失和置换如，转换和颠换适宜进行的位置，可以利用体外诱变、引物修复、限制和连接。
在适当操作如，限制、回嚼(chewing-back)和补平突出端产生平末端的情况下，可以提供用于连接的片段互补末端。
优选的聚腺苷酸化信号是植物聚腺苷酸化信号，优选实质上对应于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的聚腺苷酸化信号，特别是对应于Ti质粒pTiACH5 T-DNA基因3(章鱼碱合成酶)的聚腺苷酸化信号(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835以及下列等等)的那些聚腺苷酸化信号或功能等同物。
本发明也涉及上述编码酪氨酸转氨酶的核酸或上述核酸构建体或酪氨酸转氨酶用于产生转基因生物体，特别是植物的用途。
优选地，这些转基因植物具有比野生型增加的维生素E含量。
因此，本发明也涉及本发明核酸或本发明核酸构建体用于增加生物体中维生素E含量的用途，所述生物体的野生型具有产生维生素E的能力。
已知具有高维生素E含量的植物对非生物胁迫有增加的抗性。非生物胁迫应理解为意指例如低温，霜冻，干旱，高温和盐度。
因此，本发明也涉及本发明核酸用于产生转基因植物的用途，其中，与野生型比较，所述转基因植物对非生物胁迫有增加的抗性。
上述蛋白质和核酸可以用于在转基因生物体中生产精细化学品，优选地，用于在转基因植物中生产维生素E。
将外源基因转移进入生物体，特别是植物的基因组中称为转化。
此外，特别是在植物中，可以利用本身已知的转化和从植物组织和植物细胞再生植物的方法进行瞬时或稳定转化。
用于植物转化的适合方法是通过聚乙二醇诱导DNA摄入的原生质体转化，利用基因枪的生物轰击(biolistic)方法——称为微粒轰击方法，电穿孔，在含有DNA的溶液中孵育干胚胎，微注射和上述农杆菌介导的基因转移。例如在B.Jenes等，基因转移技术，《Transgenic Plants》，1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press(1993)，128-143和在Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225中描述了上述方法。
优选地，将待表达的构建体克隆入适用于根瘤农杆菌转化的载体中，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711)。
因此，本发明也涉及包含上述核酸，核酸构建体或表达盒子的载体。
已经用表达盒子转化的农杆菌可以以已知方法用于转化植物，例如通过在农杆菌溶液中浸浴切割的叶片或叶片部分，随后在适宜培养基中培养它们。
此表达盒子不仅可以用在植物中，而且可以用于细菌，特别是蓝细菌，藓类，酵母，丝状真菌和藻类的转化。
对于遗传修饰植物(此后也称为转基因植物)的优选制备，将表达酪氨酸转氨酶的融合表达盒子克隆入适用于根瘤农杆菌的转化的载体，例如pBin19中。
然后，已经用这种载体转化的农杆菌可以以已知方式用于植物，特别是农作物的转化，例如通过在农杆菌溶液中浸浴切割的叶片或叶片部分，随后在适宜培养基中培养它们。
从例如，F.F.White，高等植物基因转移载体《Transgenic Plants》，1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Press，1993，15-38页中可知通过农杆菌的植物转化。可以以已知方法从这些切割的叶片或叶片部分的转化细胞再生转基因植物，这些转基因植物将包含整合在表达盒子中用于表达编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因。
为了用编码酪氨酸转氨酶的核酸转化宿主植物，表达盒子以插入形式引入重组载体中，此载体DNA还包含功能性调节信号，例如用于复制或整合的序列。在例如“Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，6/7章，71-119页(1993)中描述了适宜的载体。
例如，可以向具有35S启动子的转化载体pBin-19的衍生物中引入植物表达盒子(Bevan，M.，Nucleic Acids Research 128711-8721(1984))。
利用上面引用的重组和克隆技术，表达盒子可以克隆进入适合的载体中，所述载体使得表达盒子可以，例如在大肠杆菌(E.coli)中扩增。适宜的克隆载体的例子是pBR322，pUC系列，M13mp系列和pACYC184等。特别适合的是能在大肠杆菌(E.coli)和农杆菌中复制的二元载体。
因此，本发明也涉及上述核酸、上述核酸构建体、特别是表达盒子用于遗传修饰植物的产生，或用于植物、植物细胞、植物组织或植物部分的转化的用途。
优选地，此用途的目的是增加植物或植物部分的维生素E含量。
根据启动子的选择，表达可以特异地发生在叶中，种子，花瓣或植物的其它部分中。
因此，本发明也涉及通过向起始生物体的基因组中引入上述核酸或上述核酸构建体或上述核酸构建体的组合产生遗传修饰生物体的方法。
本发明也涉及上述遗传修饰生物体本身。
如上所述，此遗传修饰的生物体，特别是植物有增加的维生素E含量。
生物体中酪氨酸转氨酶活性的增加具有进一步的效应。不仅增加总维生素E的含量，而且与生育酚比较，还选择性增加生育三烯酚。
如上所述，在优选实施方式中，用作生物体和用于产生与野生型比较具有增加的精细化学品含量的生物体的材料是具光合作用活性的生物体如，蓝细菌，藓类，藻类或植物，特别优选植物，作为起始生物体，而且相应地也作为遗传修饰的生物体。
本发明的另一个目的是这种转基因植物，它们的繁殖材料和它们的植物细胞，植物组织或植物部分。
如上所述，优选的植物是万寿菊属，向日葵属，拟南芥属，烟草属，辣椒属(red pepper)，大豆属，番茄属，茄子，辣椒属(Capsicum)，胡萝卜属，马铃薯，玉蜀黍属，莴苣属和甘蓝物种，谷类，苜蓿，燕麦属，大麦属，黑麦属，小麦属，小黑麦属，高梁属和粟，稻属，苜蓿属，亚麻属，棉属，大麻属，十字花科如油籽油菜或Canola，甜菜，甘蔗，坚果和葡萄属种或木本物种如杨属或红豆杉属。
特别优选的是拟南芥，万寿菊(Tagetes erecta)，欧洲油菜，烟草，向日葵，Canola，马铃薯或大豆。
如上所述，遗传修饰的生物体，特别是植物可以用于维生素E的生产。
人和动物可以消耗的具有增加维生素E含量的本发明遗传修饰植物也可以例如直接或按本身已知的方式加工后用作食物或饲料，或用作饲料或食物添加剂。
根据本发明遗传修饰的植物也可以用于产生含有维生素E的提取物。
对于本发明目的而言，增加维生素E含量优选意味着与非遗传修饰的植物比较，人为地使植物获得增加这些化合物的生物合成速率的能力，且优选这种能力在植物中持继至少一代。
通常，增加的维生素E含量应理解为意指增加的总生育酚的含量。然而，特别地，增加的维生素E含量也可理解为意指上述具有生育酚活性的8种化合物的改变的含量。
例如，在植物中引入酪氨酸转氨酶基因意外地引起了生育三烯酚含量特别显著的增加。
现在，将通过下面的实施例示例说明本发明，但本发明不限于此通用的实验条件重组DNA的序列分析。
利用Sanger方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467)，用Licor激光荧光DNA测序仪(从MWG Biotech，Ebersbach可得到)测序重组DNA分子。
实施例1克隆编码褐家鼠酪氨酸转氨酶的酪氨酸转氨酶基因如S.Kar和B.J.Carr在Biochem.Biophys.Res.Commun.1995，212(1)，21-6(差异显示和克隆大鼠肝再生晚期的信使RNA)中所述，以本身已知的方式从大鼠肝脏制备RNA。
用SuperScript II cDNA合成试剂盒(Gibco BRL)，按照制造商的说明书，进行cDNA合成。
利用有义特异性引物(酪氨酸转氨酶5’SEQ.ID.No.3)和反义特异性引物(酪氨酸转氨酶3’SEQ.ID.No.4)，通过聚合酶链式反应(PCR)从褐家鼠扩增编码酪氨酸转氨酶的核酸。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl褐家鼠cDNA(如上所述制备)-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol酪氨酸转氨酶5’引物-40pmol酪氨酸转氨酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)步骤64℃，(等待循环)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过测序证实载体pGEMTe/RnTATase1中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.NO.3)。
实施例2克隆编码拟南芥酪氨酸转氨酶1的酪氨酸转氨酶基因1利用有义特异性引物(At1酪氨酸转氨酶5’SEQ.ID.No.28)和反义特异性引物(At1酪氨酸转氨酶3’SEQ.ID.No.29)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码酪氨酸转氨酶基因1的DNA，PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2
-5μg牛血清白蛋白-40pmol At1酪氨酸转氨酶5’引物-40pmol At1酪氨酸转氨酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtTATase1中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.5)。
实施例3克隆编码拟南芥酪氨酸转氨酶3的酪氨酸转氨酶基因3利用有义特异性引物(At3酪氨酸转氨酶5’SEQ.ID.No.30)和反义特异性引物(At3酪氨酸转氨酶3’SEQ.ID.No.31)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码酪氨酸转氨酶基因3的DNA，PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol At3酪氨酸转氨酶5’引物
-40pmol Ar3酪氨酸转氨酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤356℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtTATase3中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.7)。
实施例4克隆编码拟南芥酪氨酸转氨酶5的酪氨酸转氨酶基因5利用有义特异性引物(At5酪氨酸转氨酶5’SEQ.ID.No.32)和反义特异性引物(At5酪氨酸转氨酶3’SEQ.ID.No.33)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码酪氨酸转氨酶基因5的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol At5酪氨酸转氨酶5’引物-40pmol At5酪氨酸转氨酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤356℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtTATase5中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.9)。
实施例5克隆编码拟南芥酪氨酸转氨酶6的酪氨酸转氨酶基因6利用有义特异性引物(At6酪氨酸转氨酶5’SEQ.ID.No.34)和反义特异性引物(At6酪氨酸转氨酶3’SEQ.ID.No.35)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码酪氨酸转氨酶基因6的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol At6酪氨酸转氨酶5’引物-40pmol Ar6酪氨酸转氨酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE Applied Biosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR
步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤356℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtTATase6中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.11)。
实施例6克隆编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因利用有义特异性引物(牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶5’；SEQ.ID.No.36)和反义特异性引物(牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶3’SEQ.ID.No.37)，通过聚合酶链式反应(PCR)从烟草扩增编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl烟草cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶5’引物-40pmol牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶缓冲液(PE Applied Biosystems)-5U的rTth DNA聚合酶(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)
步骤294℃，3秒步骤356℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/NtGGPPOR中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.17)。
实施例7克隆编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的羟苯基丙酮酸双加氧酶基因利用有义特异性引物(At羟苯基丙酮酸双加氧酶5’SEQ.ID.No.38)和反义特异性引物(At羟苯基丙酮酸双加氧酶3’SEQ.ID.No.39)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码羟苯基丙酮酸双加氧酶基因的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol At羟苯基丙酮酸双加氧酶5’引物-40pmol At羟苯基丙酮酸双加氧酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤358℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtHPPD中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.13)。
实施例8克隆编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的尿黑酸叶绿基转移酶基因利用有义特异性引物(At尿黑酸叶绿基转移酶5’SEQ.ID.No.40)和反义特异性引物(At尿黑酸叶绿基转移酶3’SEQ.ID.No.41)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码尿黑酸叶绿基转移酶基因的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol At尿黑酸叶绿基转移酶5’引物-40pmol At尿黑酸叶绿基转移酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤358℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)
步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtHPT中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.15)。
实施例9克隆编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因利用有义特异性引物(2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶5’SEQ.ID.No.42)和反义特异性引物(2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶3’SEQ.ID.No.43)，通过聚合酶链式反应(PCR)从集胞藻PCC6803扩增编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl集胞藻PCC6803 DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol 2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶5’引物-40pmol 2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤358℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)
步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/SynMT1中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.19)。
实施例10克隆编码集胞藻PCC6803生育酚环化酶(也称为2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶)的生育酚环化酶基因(也称为2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因)利用有义特异性引物(2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶5’SEQ.ID.No.44)和反义特异性引物(2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶3’SEQ.ID.No.45)，通过聚合酶链式反应(PCR)从集胞藻PCC6803扩增编码2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl集胞藻PCC6803 DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol 2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶5’引物-40pmol 2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶3’引物-15μl的10×Pfu1-Turbo DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U的Pfu1-Turbo DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤360℃，1分钟(退火)步骤472℃，1.5分钟(延伸)
步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pCRTopo4blunt(Invitrogen)。用M13F(-20)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pCR4topoblunt/SynCyc中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.21)。
实施例11克隆编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的γ-生育酚甲基转移酶基因利用有义特异性引物(Atγ-生育酚甲基转移酶5’SEQ.ID.No.46)和反义特异性引物(Atγ-生育酚甲基转移酶3’SEQ.ID.No.47)，通过聚合酶链式反应(PCR)从拟南芥扩增编码γ-生育酚甲基转移酶基因的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl拟南芥cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol Atγ-生育酚甲基转移酶5’引物-40pmol Atγ-生育酚甲基转移酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤358℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)
用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/AtγTMT中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.23)。
实施例12克隆编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶的尿黑酸双加氧酶基因的部分片段利用有义特异性引物(尿黑酸双加氧酶5’SEQ.ID.No.48)和反义特异性引物(尿黑酸双加氧酶3’SEQ.ID.No.49)，通过聚合酶链式反应(PCR)从欧洲油菜扩增编码尿黑酸双加氧酶基因部分片段的DNA。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-2μl欧洲油菜cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol尿黑酸双加氧酶5’引物-40pmol尿黑酸双加氧酶3’引物-15μl的3.3×rTth DNA聚合酶XL缓冲液(PE AppliedBiosystems)-5U的rTth DNA聚合酶(PE Applied Biosystems)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤356℃，1分钟(退火)步骤472℃，2分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)用标准方法克隆扩增子进入PCR克隆载体pGEM-Te(Promega)。用M13F(-40)引物和M13R引物，通过完全测序证实载体pGEMTe/*BnHGD中产生的扩增子的身份(SEQ.ID.NO.25)。
实施例13构建用于种子特异性抑制欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达的DNA构建体利用载体pSUN2(WO 02/00900)，以制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，所述转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表现出降低的欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。修饰该载体，使该载体包含蚕豆(Vicia faba)豌豆球蛋白基因的种子特异性启动子(Weschke W.，Bassüner R.，van Hai N.，Czihal A.，Bumlein H.，Wobus U.蚕豆的豌豆球蛋白基因结构Biochem.Physiol.plants 183，233-242(1988))和马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)(VancanneytG.，Schmidt R.，O’Connor-Sanchez A.，Willmitzer L.，Rocha-Sosa M.，包含内含子的标志基因的构建转基因植物中内含子的拼接和其在监测农杆菌介导的植物转化早期事件中的用途，MGG(1990))和根瘤农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止信号2(Gielen等，1984)。
编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因部分片段的DNA片段从质粒pGEMTe/*BnHGD作为SacI/ScaI片段在用T4聚合酶进行片端的突出末端平端化后被克隆进入SmaI切开的pSUN2-Pvic-STLS1-ocsT中。用ScaI消化由此得到的质粒pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-ocsT。
将此欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段从质粒pGEMTe/*BnHGD作为平端SacI/ScaI片段克隆进入上述线性化载体。这样做时，注意使两个BnHGD片段在STLS1内含子两侧以相反的取向存在。该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT(

图1)用于产生转基因欧洲油菜和拟南芥植物。
实施例14构建用于在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶的DNA构建体利用载体pSUN2(专利WO 02/00900)，制备用于产生如下转基因拟南芥、烟草和欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，所述转基因拟南芥、烟草和欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶。修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质基因的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein H.，Boerjan W.，Nagy I.，Bassüner R.，van Montagu M.，InzéD.，Wobus U.，在转基因烟草和拟南芥属植物中发育调节来自蚕豆的新种子蛋白基因，MGG 225459-467(1991))、编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)基因的叶绿体转运肽的序列(Guerineau F.，Woolston S.，Brooks L.，Mullineaux P.，用于将外源蛋白引导进入叶绿体的表达盒，Nucleic AcidsRes 16(23)11380.(1988))和根瘤农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止信号(Depicker A，Stachel S，Dhaese P，Zambryski P，Goodman HM.章鱼碱合成酶转录作图和DNA序列J Mol Appl Genet.1982；1(6)561-73)。
在用限制酶SmaI消化pSUN2-USPP-rbcS-nosT后，将编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因的DNA片段从质粒pGEMTe/RnTATase作为EcoR5片段克隆入pSUN2-USPP-rbcS-nosT中。这产生了具有二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽的翻译融合物，因此保证了褐家鼠酪氨酸转氨酶运输进入质体中。
该质粒(pSUN2USPP-rbcS-RnTATase-nosT，图2)用于产生转基因欧洲油菜和拟南芥植物。
图2中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段C(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段D(272bp)编码根瘤农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止信号。
实施例15构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1的DNA构建体利用载体pSUN2(WO 02/00900)，制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶。
修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein等，1991)和根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号(GIELEN，J.，de BEUCKELEER，M.，SEURINCK，J.，DEBROECK，H.，de GREVE，H.，LEMMERS，M.，van MONTAGU，M.，SCHELL，J.根瘤农杆菌质料pTiAch5的TL-DNA的完全核苷酸序列EMBO J.3835-846.(1984))。
从质粒pGEMTe/AtTATase1以SalI片段分离编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1的DNA片段，用Klenow酶补平SalI末端后，将其克隆入用限制酶SmaI部分消化的pSUN2-USPP-nosT(线性化载体的大小是8250bp)中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT，图3)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图3中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例16构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3的DNA构建体利用载体pSUN2(WO 02/00900)，制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3。
修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein等，1991)和农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号(Gielen等，1984)。
从质粒pGEMTe/AtTATase3以SalI片段分离编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3的DNA片段，用Klenow酶补平SalI末端后，将其克隆入用限制酶SmaI部分消化的pSUN2-USPP-nosT(线性化载体的大小是8250bp)中。
该质粒(pSUN2USPP-AtTATase3-nosT，图4)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图4中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例17构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5的DNA构建体利用载体pSUN2(WO 02/00900)，制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5。
修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein等，1991)和农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号(Gielen等，1984)。
从质粒pGEMTe/AtTATase5以BamHI片段分离编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5的DNA片段，用Klenow酶补平SalI末端后，将其克隆入用限制酶SmaI部分消化的pSUN2-USPP-nosT(线性化载体的大小是8250bp)中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT，图5)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图5中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子，片段B(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例18构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6。
修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质基因的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein等，1991)和农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号(Gielen等，1984)。
从质粒pGEMTe/AtTATase6以SalI片段分离编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6的DNA片段，用Klenow酶补平SalI末端后，将其克隆入用限制酶SmaI部分消化的pSUN2-USPP-nosT(线性化载体的大小是8250bp)中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT，图6)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图6中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子，片段B(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例19构建用于表达种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
首先，修饰载体puc19(New England Biolabs)，使该载体包含豆球蛋白B4基因的种子特异性启动子(Kafatos等，1986)和根瘤农杆菌胭脂碱合成酶的终止信号(Depicker等，1982)。由此得到的载体称为puc19-LeB4-nosT。
以KpnI/SalI片段将编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因的DNA片段克隆入用限制酶KpnI/SalI消化的puc19LeB4nosT中。
从载体puc19-LeB4-NtGGPPOR-nosT以SmaI/Hind3片段分离由LeB4启动子和牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因(Seq.ID 7核苷酸第1到1323位)组成的DNA，将其克隆入用限制酶SmaI/Hind3消化的载体pSUN2中。由此得到的载体称为pSUN2-LeB4-NtGGPPOR(核苷酸1-1323)。用Hind3切割载体puc19-LeB4-NtGGPPOR-nosT，以Hind3片段分离由牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因(Seq.ID.No.17核苷酸第1319到1509位)和nos终止序列组成的DNA。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT，图7)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图7中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例20构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶。
修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质基因的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein等，1988)和根瘤农杆菌章鱼碱合成酶基因的终止信号1(Depicker等，1982)。
从质粒pGEMTe/AtHPPD以BamHI/SalI片段分离编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA片段，用Klenow酶补平BamHI末端和SalI末端后，将其克隆入用限制酶SmaI部分消化的载体pSUN2-USPP-ocsT(线性化载体的大小是8691bp)中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT，图8)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图8中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子，片段B(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶，片段C(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例21构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
修饰该载体，使该载体包含蚕豆未知种子蛋白质基因的种子特异性启动子(USPP)(Bumlein等，1991)和根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号1(Depicker等，1982)。
从质粒pGEMTe/AtHPT以BamHI片段分离编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA片段，用Klenow酶补平BamHI末端后，将其克隆入用SmaI部分消化的载体pSUN2-USPP-ocsT(线性化载体的大小是88691bp)中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT，图9)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图9中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子，片段B(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因，片段C(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例22构建用于在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
修饰该载体，使该载体包含豆球蛋白B4基因的种子特异性启动子(Kafatos等，1986)、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列和根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号(Depicker等，1982)。
从质粒pGEMTe/SynMT1以BamHI片段分离编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA片段，用Klenow酶补平BamHI末端后，将其克隆入SalI消化的pSUN2-Leb4P-IPP-nosT(其SalI末端也用Klenow酶补平)中。这产生了具有IPP-2转运肽的翻译融合物，因此保证了2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶运输进入叶绿体中。
该质粒(pSUN2LeB4-IPP-SynMT1-nosT，图10)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图10中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽，片段C(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因，和片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例23构建用于在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶。
修饰该载体，使该载体包含豆球蛋白B4基因的种子特异性启动子(Kafatos等，1986)、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)转运肽的序列和根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号(Depicker等，1982)。
从质粒pGEMTe/SynCyc以BamHI片段分离编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA片段，用Klenow酶补平BamHI末端后，将其克隆入SalI消化的pSUN2-Leb4P-IPP-nosT(其SalI末端也用Klenow酶补平)中。这产生了具有IPP-2转运肽的翻译融合物，因此保证了2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶运输进入叶绿体中。
该质粒(pSUN2-LeB4P-IPP-SynCyc-nosT，图11)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图11中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽，片段C(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因，和片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例24构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2(WO 02/00900)，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
首先，修饰载体puc19(New England Biolabs)，使该载体包含蔗糖结合蛋白基因的种子特异性启动子(SBP-P)(DE 19852195 C2)和花椰菜花叶病毒35S终止序列(FRANCK，A.，GUILLEY，H.，JONARD，G.，RICHARDS，K.，HIRTH，L.花椰菜花叶病毒DNA的核苷酸序列.Cell 21285-294.(1980))。由此得到的载体称为puc19-SBPP-35ST。
以BamHI/SalI片段将编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因的DNA片段克隆进入限制酶BamHI/SalI消化的puc19-SBPP-AtγTMT-35ST中。
利用有义特异性引物(SBPP-XbaI 5’SEQ.ID.No.50)和反义特异性引物(35ST-XbaI 3’SEQ.ID.No.51)，通过PCR扩增由SBP启动子、拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因和35ST终止序列组成的表达盒子，然后将其克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl的puc19-SBPP-AtγTMT-35ST质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol SBPP-XbaI 5’引物
-40pmol 35ST-XbaI 3’引物-5μl的10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U的Pfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4TOPOblunt/SBPP-γTMT-35ST以XbaI片段分离由SBP启动子、拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因和35ST终止序列组成的DNA片段，并将其克隆进入用限制酶XbaI消化过的载体pSUN2中。
该质粒(pSUN2-SBPP-γTMT-35ST，图12)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图12中片段A(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段B(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段C(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例25构建用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制及在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶基因的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pSUN2-Pvic-BnHGD*-STLS1-αBnHGD*-ocsT和载体pSUN2USPP-rbcS-RnTATase-nosT，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶且同时对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达产生种子特异性抑制。
利用有义特异性引物(USPP-SrfI 5’SEQ.ID.No.52)和反义特异性引物(nosT-SrfI 3’SEQ.ID.No.53)，通过PCR从载体pSUN2USPP-rbcS-RnTATase-nosT扩增由USP启动子、rbcS转运肽、褐家鼠酪氨酸转氨酶基因和nos终止序列组成的表达盒子，并将其克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl的pSUN2-USPP-rbcS-RnTATase-nosT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol USPP-SrfI 5’引物-40pmol nosT-SrfI 3’引物-5μl的10×Pfu1 Turbo DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U的Pfu1 Turbo DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，8分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnATase-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、rbcS转运肽、褐家鼠酪氨酸转氨酶基因和nos终止序列组成的DNA片段，并将其克隆进入用限制酶EcoRV消化过的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-PVIc-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT-USPP-rbcS-RnATase-nosT，图13)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图13中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段，片段C(198bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子，片段G(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)的转运肽。片段H(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因，片段I(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例26构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT和载体pUN2-PVIc-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以EcoRI/SmaI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端后，将此构建体克隆λ用EcoRV消化过的载体pSUNPvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/USPP-AtTATASe1-nosT，图14)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图14中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段G(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1，片段H(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例27构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT和载体pSUN2-PvIC-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以EcoRI/SmaI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端后将此构建体克隆入用EcoRV消化过的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/USPP-ATTATASE3-nosT，图15)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图15中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质”基因的启动子(USPP)，片段G(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3，片段H(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例28构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT和载体pSUN2-PVIC-*BnHGD-STLS1-α*BNHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端后，将此构建体克隆入用EcoRV消化过的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-PvIc-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocT/USP-ATTATASE5-nosT，图16)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图16中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质”基因的启动子，片段G(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5，片段H(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例29构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT和载体pSUN2-PViC-*BnHGD-STLS1-α*BNHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端后，将此构建体克隆入用EcoRV消化过的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-PvIC-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/USPP-ATTATase6-nosT，图17)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图17中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因内的含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质”基因的启动子，片段G(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，片段H(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例30构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LEB4-NtGGPPOR-nosT和pCR4topoblunt-USPP-rbcS-NtataSe1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下编码褐家鼠酪氨酸转氨酶，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、褐家鼠酪氨酸转氨酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入XhoI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中，该载体的XhoI末端已经先用Klenow酶进行了平端化。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPORnosT/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT，图18)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图18中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段C(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段D(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段F(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例31构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶1和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LEB4-NtGGPPOR-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆入XhoI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中，该载体的XhoI末端已经先用Klenow酶进行了平端化。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT/USPP-AtTATase1-nosT，图19)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图19中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段F(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例32构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LEB4-NtGGPPOR-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入XhoI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中，该载体的XhoI末端已经先用Klenow酶进行了平端化。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPORnosT/USPP-AtTATase3-nosT，图20)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图20中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子(USPP)，片段B(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段F(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例33构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LEB4-NtGGPPOR-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入XhoI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中，该载体的XhoI末端已经先用Klenow酶进行了平端化。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPORnosT/USPP-AtTATase5-nosT，图21)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图21中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段F(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例34构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LEB4-NtGGPPOR-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入XhoI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中，该载体的XhoI末端已经先用Klenow酶进行了平端化。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPORnosT/USPP-AtTATase6-nosT，图22)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图22中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段F(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例35构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶和种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT和pCR4topoblunt-USPP-rbcS-RnTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶，并且以种子特异性方式表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、褐家鼠酪氨酸转氨酶和Bos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT，图23)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图23中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段C(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段D(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段F(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因。片段G(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例36构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶1和种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT/USPP-AtTATase1-nosT，图24)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图24中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例37构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3和种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT/USPP-AtTATase3-nosT，图25)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图25中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子(USPP)，片段B(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例38构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5和种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT/USPP-AtTATase5-nosT，图26)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图26中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例39构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6和种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT/USPP-AtTATase6-nosT，图27)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图27中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例40构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶和种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT和pCR4topoblunt-USPP-rbcS-RnTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶，并且以种子特异性方式表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、褐家鼠酪氨酸转氨酶和nos终止序列组成的DNA片段，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT，图28)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图28中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段C(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段D(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段F(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段G(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例41构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶1和种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT/USPP-AtTATase1-nosT，图29)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图29中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例42构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3和种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT/USPP-AtTATase3-nosT，图30)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图30中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子(USPP)，片段B(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例43构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5和种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT/USPP-AtTATase5-nosT，图31)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图31中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例44构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6和种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT和pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT/USPP-AtTATase6-nosT，图32)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图32中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。
实施例45构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT和pCR4topoblunt-USPP-rbcS-RnTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、褐家鼠酪氨酸转氨酶和nos终止序列的DNA片段，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT，图33)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图33中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽，片段C(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段F(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段G(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段H(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例46构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶1和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT/USPP-AtTATase1-nosT，图34)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图34中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段F(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例47构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT/USPP-AtTATase3-nosT，图35)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图35中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子(USPP)，片段F(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例48构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT/USPP-AtTATase5-nosT，图36)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图36中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段F(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例49构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT/USPP-AtTATase6-nosT，图37)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图37中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段F(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例50构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT和pCR4topoblunt-USPP-rbcS-RnTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶并在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、褐家鼠酪氨酸转氨酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入EcoRI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT(其EcoRI末端亦被补平)中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT，图38)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图38中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段F(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段G(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段H(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例51构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶1和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入EcoRI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT(已用Klenow酶补平了载体的EcoRI末端)中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT/USPP-AtTATase1-nosT，图39)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图39中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段F(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例52构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入EcoRI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT(同样补平了该载体的EcoRI末端)中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT/USPP-AtTATase3-nosT，图40)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图40中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子(USPP)，片段F(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例53构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入EcoRI消化的并同样补平了EcoRI末端的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT/USPP-AtTATase5-nosT，图41)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图41中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段F(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例54构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT和pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入EcoRI消化的载体pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT(同样补平了该载体的EcoRI末端)中。
该质粒(pSUN2-LeB4-IPP-SynCyc-nosT/USPP-AtTATase6-nosT，图42)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图42中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶2的转运肽。片段C(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段F(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例55构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35ST和pCR4topoblunt-USPP-rbcS-RnTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶，并且以种子特异性方式表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT以SrfI片段分离由USP启动子、褐家鼠酪氨酸转氨酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT中。
该质粒(pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT/USPP-rbcS-RnTATase1-nosT，图43)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图43中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(235bp)编码蚕豆二磷酸核酮糖羧化酶(rbcS)转运肽。片段C(1365bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段D(272bp)编码根瘤农杆菌胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段E(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段F(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段G(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例56构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶1和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT和pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶1，并且以种子特异性方式表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase1-nosT以为SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶1基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT中。
该质粒(pSUN2LeB4-SBPP-AtγTMT-35sT/USPP-AtTATase1-nosT，图44)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图44中片段A(678bp)包含蚕豆未知种子蛋白质基因的启动子(USPP)，片段B(1269bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因1，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段E(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段F(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例57构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶3和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT和pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶3，并且以种子特异性方式表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase3-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶3基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT中。
该质粒(pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT/USPP-AtTATase3-nosT，图45)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图45中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子(USPP)，片段B(1334bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因3，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段E(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段F(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例58构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶5和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT和pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶5，并且以种子特异性方式表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase5-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶5基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT中。
该质粒(pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT/USPP-AtTATase5-nosT，图46)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图46中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1389bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因5，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段E(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段F(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例59构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥酪氨酸转氨酶6和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT和pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥酪氨酸转氨酶6，并且以种子特异性方式表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pSUN2-USPP-AtTATase6-nosT以SmaI/EcoRI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由USP启动子、拟南芥酪氨酸转氨酶6基因和nos终止子组成，用Klenow酶补平EcoRI末端，将该构建体克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT中。
该质粒(pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT/USPP-AtTATase6-nosT，图47)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图47中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1243bp)编码拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，片段C(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段D(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段E(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段F(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例60构建用于在种子特异性启动子控制下表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pCR4topoblunt-LeB4-NtGGPPOR-nosT(参见下文)和pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
利用有义特异性引物(LeB4-SrfI 5’SEQ.ID.No.54)和反义特异性引物(nosT-SrfI 3’SEQ.ID.No.53)，通过PCR扩增由LeB4启动子、烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因和nos终止序列组成的表达盒子，将该表达盒子克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。
由此得到的质粒是pCR4topoblunt-LeB4-NtGGPPOR-nosT。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl的puc19-LeB4-NtGGPPOR-nosT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol LeB4-SrfI 5’引物-40pmol nosT-SrfI 3’引物-5μl 10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U的Pfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4topoblunt-LeB4-NtGGPPOR-nosT以SrfI片段分离编码表达盒子的DNA片段，该表达盒子由LeB4启动子、烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因和nos终止子组成，将其克隆进入EcoRV消化的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/LeB4-NtGGPPOR-nosT，图48)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图48中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段G(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段H(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例61构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pCR4topoblunt-USPP-AtHPPD-ocsT(参见下文)和pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
利用有义特异性引物(USPP-SrfI-5’SEQ.ID.No.52)和反义特异性引物(ocsT-SrfI-3’SEQ.ID.No.55)，通过PCR扩增由USP启动子，拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和ocs终止序列1组成的表达盒子，将该表达盒子克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。由此得到的质粒是pCR4topoblunt-USPP-AtHPPD-ocsT。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol USPP-SrfI-5’引物
-40pmol ocsT-SrfI-3’引物-5μl 10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U的Pfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-AtHPPD-ocsT以SrfI片段分离由USP启动子、拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和ocs终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入EcoRV消化的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/USPP功赎罪-AtHPPD-ocsT，图49)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图49中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段G(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因，片段H(713bp)编码章鱼碱合成酶终止信号1。
实施例62构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pCR4topoblunt-USPP-AtHPT-ocsT(参见下文)和pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
利用有义特异性引物(USPP-SrfI-5’SEQ.ID.No.52)和反义特异性引物(ocsT-SrfI-3’SEQ.ID.No.55)，通过PCR扩增由USP启动子、拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶和ocs终止序列组成的表达盒子，将该表达盒子克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。
由此得到的质粒是pCR4topoblunt-USPP-AtHPT-ocsT。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl pSUN2-USPP-AtHPT-ocsT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol USPP-SrfI 5’引物-40pmol ocsT-SrfI 3’引物-5μl 10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5UPfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-AtHPT-ocsT以SrfI片段分离由USP启动子、拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶和ocs终止序列1组成的DNA片段，将其克隆进入EcoRV消化的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/USPP-AtHPT-ocsT，图50)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图50中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段G(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因，片段H(713bp)编码章鱼碱合成酶基因终止信号1。
实施例63构建用于表达种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pCR4topoblunt-LeB4-IPP-SynMt1-nosT(参见下文)和pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
利用有义特异性引物(LeB4-SrfI-5’SEQ.ID.No.54)和反义特异性引物(nosT-SrfI-3’SEQ.ID.No.53)，通过PCR扩增由LeB4启动子、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列，集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和nos终止序列组成的表达盒子，将该表达盒子克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。由此得到的质粒是pCR4topoblunt-LeB4-IPP-SynMt1-nosT。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为
-1μl pSUN2-LeB4-IPP-SynMT1-nosT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol LeB4-SrfI 5’引物-40pmol nosT-SrfI 3’引物-5μl 10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U Pfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4topoblunt/LeB4-IPP-SynMT1-nosT以SrfI片段分离由LeB4启动子、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列，集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入EcoRV消化的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/USPP-LeB4-IPP-SynMT1-nosT，图51)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图51中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段G(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽。片段H(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段I(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例64构建用于在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pCR4topoblunt-LeB4-IPP-SynCyc-nosT(参见下文)和pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
利用有义特异性引物(LeB4-EcoR5-5’SEQ.ID.No.56)和反义特异性引物(nosT-EcoR5-3’SEQ.ID.No.57)，通过PCR扩增由LeB4启动子、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列，集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶和nos终止序列组成的表达盒子，将该表达盒子克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。由此得到的质粒是pCR4topoblunt-LeB4-IPP-SynMt1-nosT。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl pSUN2-Leb4-IPP-SynCyc-nosT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol LeB4-EcoR5 5’引物-40pmol nosT-EcoR5 3’引物-5μl 10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U Pfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR
步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4TOPOblunt/LeB-IPP-SynCyc-nosT以EcoR5片段分离由LeB4启动子、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列，集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入EcoR5消化的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/LeB-IPP-SynCyc-nosT，图52)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图52中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号。片段F(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段G(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽。片段H(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段I(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例65构建用于在种子特异性启动子控制下表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶和用于对欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达进行种子特异性抑制的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pCR4topoblunt-SBPP-γTMT-35sT(参见下文)和pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶，并且以种子特异性方式抑制内源欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因的表达。
利用有义特异性引物(SBPP-SRFI-5’SEQ.ID.No.58)和反义特异性引物(nosT-SRFI-3’SEQ.ID.No.53)，通过PCR扩增由LeB4启动子、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列，拟南芥γ-生育酚甲基转移酶和nos终止序列组成的表达盒子，将该表达盒子克隆进入载体pCR4topoblunt(Invitrogen)中。由此得到的质粒是pCR4topoblunt-SBPP-γTMT-35sT。
PCR条件如下用50μl反应混合物进行PCR，该50μl反应混合物的组成为-1μl pSUN2-SBPP-γTMT-35sT质粒DNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol SBPP-SRFI 5’引物-40pmol 35sT-SRFI 3’引物-5μl 10×Pfu1 DNA聚合酶缓冲液(Stratagene)-5U Pfu1 DNA聚合酶(Stratagene)在下面循环条件下进行PCR步骤194℃，5分钟(变性)步骤294℃，3秒步骤355℃，1分钟(退火)步骤468℃，10分钟(延伸)步骤2-4的30轮循环步骤572℃，10分钟(后延伸)从质粒pCR4TOPOblunt/SBPP-γTMT-35sT以SrfI片段分离由LeB4启动子、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列，拟南芥γ-生育酚甲基转移酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入EcoRV消化的载体pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT中。
该质粒(pSUN2-Pvic-*BnHGD-STLS1-α*BnHGD-ocsT/SBPP-γTMT-35sT，图53)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图53中片段A(2559bp)包含蚕豆豌豆球蛋白基因的启动子，片段B(580bp)编码欧洲油菜尿黑酸双加氧酶基因片段。片段C(190bp)编码马铃薯(Solanum tuberosum)ST-LS1基因的内含子2(IV2)。片段D与片段B相同，但是在载体中与B有相反的取向。片段E(208bp)编码章鱼碱基因的终止信号2。片段F(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段G(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段H(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。
实施例66构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-NtGGPPOR-nosT和pCR4topoblunt-USPP-AtHPPD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-AtHPPD-ocsT以SrfI片段分离由USP启动子、拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因和ocs终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入SmaI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中。
该质粒(pSUN2LeB4-NtGGPPORnosT/USPP-AtHPPD-ocsT，图54)用于产生转基因欧洲油菜植物。
在图54中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因，片段C(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段F(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例67构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT和pCR4topoblunt-USPP-AtHPT-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶，并且以种子特异性方式表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-AtHPT-ocsT以SrfI片段分离由USP启动子、拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶和ocs终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入SmaI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT中。
该质粒(pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT/USPP-AtHPT-ocsT，图55)用于产生转基因欧洲油菜植物。
在图55中片段A(678bp)包含蚕豆“未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段C(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段F(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例68构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶、种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-SBPP-AtγTMT35ST和pCR4topoblunt-LeB4-IPP-SynMT1-nosT和pCR4topoblunt-USPP-AtHPPDocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶、在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶及在种子特异性启动子控制下表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-AtHPPD-ocsT以SrfI片段分离由USP启动子、拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因和ocs终止序列1组成的DNA片段，将其克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT35ST中，该载体同样先用限制酶SrfI消化。从质粒pCR4TOPOblunt/LeB-SynMT1-nosT以SrfI片段分离由LeB4 USP启动子、集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入XhoI消化的上述质粒pSUN2-SBPP-AtγTMT-35sT/USPP-AtHPPD-ocsT中，在克隆进入XhoI消化的该质粒载体pSUN2-SBPP-AtγTMT35sT/USPP-AtHPPD-ocsT前先将XhoI末端补平。该质粒(pSUN2-SBPP-AtγTMT35sT/USPP-AtHPPD-ocsT/LeB-SynMT1-nosT，图56)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图56中片段A(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段B(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段C(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。片段D(678bp)包含蚕豆”未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。片段G(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段H(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽。片段I(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因，和片段J(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例69构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-USPP-AtHPPDocsT和pCR4topoblunt-LeB4-IPP-SynMT1-nosT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/LeB-SynMT1-nosT以SrfI片段分离由LeB4启动子、集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入XhoI消化后XhoI末端补平的载体pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT kloniert中。
该质粒(pSUN2-USPP-AtHPPD-ocsT/LeB-SynMT1-nosT，图57)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图57中片段A(678bp)包含蚕豆”未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因，片段C(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽。片段F(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因，和片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例70构建用于表达种子特异性启动子控制下的拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和种子特异性启动子控制下的烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶和种子特异性启动子控制下的拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，使载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT/USPP-AtHPT-ocsT和pCR4topoblunt-USPP-AtHPPD-ocsT相联合，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶、在种子特异性启动子控制下表达烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶及在种子特异性启动子控制下表达拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶。
从质粒pCR4TOPOblunt/USPP-AtHPPD-ocsT以SrfI片段分离由USP启动子、拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶和ocs终止序列1组成的DNA片段，将其克隆进入XhoI消化的载体pSUN2-LeB4-NtGGPPOR-nosT/USPP-AtHPT-ocsT中，该载体的XhoI末端已先用Klenow聚合酶平端化。
该质粒(pSUN2LeB4-NtGGPPORnosT/USPP-AtHPPD-ocsT/USPP-AtHPT-ocsT，图58)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图58中片段A(678bp)包含蚕豆”未知种子蛋白质基因”的启动子，片段B(1338bp)编码拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因，片段C(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。片段D(678bp)包含蚕豆”未知种子蛋白质基因”的启动子，片段E(1182bp)编码拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因。片段F(713bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号1。片段G(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段H(1509bp)编码烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因。片段I(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例71构建用于表达种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶、种子特异性启动子控制下的集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶和种子特异性启动子控制下的拟南芥γ-生育酚甲基转移酶的DNA构建体为了制备用于产生如下转基因欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用构建体pSUN2-SBPP-AtγTMT35ST/USPP-AtHPPD-ocsT/LeB-SynMT1-nosT和pCR4topoblunt/LeB-IPP-SynCyc-nosT，该转基因欧洲油菜植物将在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶、在种子特异性启动子控制下表达集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶及在种子特异性启动子控制下表达拟南芥γ-生育酚甲基转移酶。
从质粒pCR4topoblunt/LeB-IPP-SynCyc-nosT以EcoR5片段分离由LeB4启动子、集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶和nos终止序列组成的DNA片段，将其克隆进入SrfI消化的载体pSUN2-SBPP-AtγTMT-35ST/USPP-AtHPPD-ocsT/LeB-SynMT1-nosT中，该载体先已用限制酶SrfI消化。由此，用由LeB4启动子、集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因和nos终止序列组成的表达盒子替换由USP启动子、拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因和ocs终止序列组成的表达盒子。
该质粒(pSUN2-SBPP-AtγTMT35sT/LeB-IPP-SynCyc-nosT/LeB-IPP-SynMT1-nosT，图59)用于产生转基因欧洲油菜植物。
图59中片段A(1788bp)包含蚕豆SBP基因的启动子，片段B(1047bp)编码拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因，片段C(291bp)编码花椰菜花叶病毒35S终止子。片段D(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段E(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽。片段F(1100bp)编码集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因。片段G(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。片段H(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段I(235bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽，片段J(957bp)编码集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶基因。片段K(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例72构建用于表达种子特异性启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶的DNA构建体为了制备用于产生可在种子特异性启动子控制下表达褐家鼠酪氨酸转氨酶(Seq.ID.No.1)的转基因拟南芥、烟草和欧洲油菜植物的嵌合DNA构建体，利用载体pGPTVkan的衍生物(D.Becker，E.Kemper，J.Schell，R.Masterson.Plant Molecular Biology 201195-1197，1992)。
修饰该载体，使该载体包含豆球蛋白B4基因的种子特异性启动子(Kafatos等，Nuc.Acid.Res.，14(6)2707-2720，1986)、编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列(Badur，未公开)和根瘤农杆菌胭脂碱合成酶的终止信号(Depikker等，J.Mol.Appl.Genet.1，561-73，1982)。
编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因的DNA片段作为EcoR5片段被克隆进入载体pPTVKan-LeP-IPPTP11中，克隆前用限制酶SalI消化该载体并用Klenow酶对该线性化质粒的末端进行了平端化。这产生了具有IPP-2转运肽的翻译融合物，因此保证了酪氨酸转氨酶运输进入质体中。该质粒pPTVkan-IPPTP11-TATaseRNnos(也称为pPTVkan-LeB4-IPP-RnTATase-nosT，图60)用于产生转基因欧洲油菜和拟南芥植物。
图60中片段A(2764bp)包含蚕豆豆球蛋白B4基因的启动子，片段B(207bp)编码拟南芥异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽，片段C(1377bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因。片段D(272bp)编码胭脂碱合成酶基因的终止信号。
实施例73构建包含褐家鼠酪氨酸转氨酶基因的表达盒子我们制备了转基因烟草和拟南芥植物，这些植物表达组成型CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子控制下的褐家鼠酪氨酸转氨酶(Seq.ID.No.1)(Franck等，Cell 21285-294，1980)。
制备的用于组成型表达褐家鼠酪氨酸转氨酶1的质粒的基础是pBinAR-IPP-Tp-10(Ralf Badur，博士论文，University of Gttingen，1998)。该载体是pBinAR的衍生物(Hfgen和Willmitzer，Plant Sci.66221-230，1990)，并且包含CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子(Franck等，1980)、章鱼碱合成酶基因的终止信号(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)和编码拟南芥质体特异性异戊烯焦磷酸异构酶-2(IPP-2)的转运肽的序列(Badur，未公开)。在考虑正确的阅读框情况下，将褐家鼠酪氨酸转氨酶克隆进入该载体，产生具有质体转运肽的酪氨酸转氨酶翻译融合物。因此，该转基因将被转运进入质体中。
为了产生该质粒，利用侧翼EcoRV限制切割位点，从质粒pGEM-T/酪氨酸转氨酶分离酪氨酸转氨酶基因。用标准方法将该片段连入SmaI切割的pBinAR-IPP-Tp-10(参看图61)。该质粒pBinAR-IPP-Tp-10/酪氨酸转氨酶(可替代地也称为pBinAr-35sP-IPP-RnTATase-nosT)用于产生转基因烟草和拟南芥植物。
图61中片段A(529bp)包含花椰菜花叶病毒35S启动子(花椰菜花叶病毒核苷酸第6909到7437位)，片段B(207bp)编码异戊烯焦磷酸异构酶-2的转运肽，片段C(1377bp)编码褐家鼠酪氨酸转氨酶基因1，片段D(208bp)编码章鱼碱合成酶基因的终止信号。
实施例74转基因拟南芥植物的产生根据修改的真空浸渗(infiltrion)方法(Steve Clough和Andrew Bent.花的浸渍一种用于农杆菌介导的拟南芥转化的简化方法Plant J16(6)735-43，1998；Bechtold，N.Ellis，J.和Pelltier，G.，《PlantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants》.CRAcad Sci Paris，1993，1144(2)204-212)用根瘤农杆菌株系(GV3101[pMP90])转化野生型拟南芥属植物(Columbia)。在之前先用上述DNA构建体转化所用的根瘤农杆菌细胞。
基于抗生素抗性筛选最初转化体的种子。将对抗生素有抗性的幼苗移到土壤中，然后以充分发育的植物形式用于生物化学分析。
实施例75转基因烟草植物的产生用根瘤农杆菌菌落接种10ml补充抗生素的YEB培养基(5g/l牛肉膏，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM MgSO4)，在28℃，过夜生长培养物。在4℃，用台式离心机，3500rpm沉淀细胞20分钟，然后在无菌条件下，在无抗生素的新鲜YEB培养基中重悬细胞。细胞悬浮液用于转化。
通过营养繁殖获得无菌生长的野生型植物。为此，仅切下植物顶端，转移到无菌保存罐中新鲜的2MS培养基中。至于植物的其余部分，除去叶片上表面的绒毛和叶片中央叶脉。利用刀片将叶片切成约1cm2大小的部分。将农杆菌培养物转移到小培养皿中(直径2cm)。短暂地将这些叶片部分拖过该溶液，以叶片下表面将叶片放置在培养皿(直接9cm)的2MS培养基上，以此使它们接触培养基。在25℃，黑暗中放置2天后，将外植体转移到具有愈伤组织诱导培养基的平板中，在可控环境的小室中保温到28℃。每7到10天需要更换培养基一次。一旦形成愈伤组织，将外植体转移到无菌保存罐中补充有头孢氨噻肟的芽诱导培养基(0.6％BiTec琼脂(w/v)，2.0mg/l玉米素核糖，0.02mg/l萘乙酸，0.02mg/l赤霉酸，0.25g/ml头孢氨噻肟，1.6％葡萄糖(w/v)和50mg/l卡那霉素)上。约1个月后，开始器官发生，可以切下已经形成的芽。在补充有头孢氨噻肟和选择标记的2MS培养基上培养这些芽。一旦形成实质上的根团，可以将植物盆栽在种子培养料中。
实施例76转基因欧洲油菜植物的产生基本如Bade，J.B.和Damm，B.(在“Gene Transfer to Plants”，Potrykus，I.和Spangenberg，G.编辑，Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述产生转基因油籽油菜植物，该篇文献也详述了所用培养基和缓冲液的组成。
用根瘤农杆菌株系GV3101[pMP90]实现转化。可赋予种子中特异性表达的DNA构建体(图60)用于转化。其它的所用构建体是如下赋予种子中特异性表达的构建体，即描述在图1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59中的构建体。用70％乙醇(v/v)表面灭菌Brassica napus var.Westar的种子，55℃在水中洗10分钟，在1％次氯酸盐浓溶液(25％v/vTeepol，0.1％v/v吐温20)中温育20分钟，用无菌水洗6次，每次20分钟。在滤纸上干燥种子3天，在含有15ml发芽培养基的玻璃烧瓶中使10-15粒种子发芽。从几棵幼苗(约10cm大小)切下根和顶端，将剩余的下胚轴切成约6mm长的段。由此获得的约600个外植体用50ml基础培养基洗30分钟，转移到300ml烧瓶中。添加100ml愈伤组织诱导培养基后，以100rpm温育培养物24小时。
在补充有卡那霉素(20mg/l)的Luria肉汤培养基中29℃获得农杆菌株系的过夜培养物，然后在29℃，在无卡那霉素的50ml Luria肉汤培养基中孵育2ml这种农杆菌株系培养物4小时直到0.4-0.5 OD600。以2000rpm沉淀培养物25分钟后，在25ml基础培养基中重悬浮细胞沉淀物。通过进一步基础培养基的添加，使得溶液中细菌浓度达到0.3 OD600。
用无菌移液管除去油籽油菜外植体中的愈伤组织诱导培养基，加入50ml农杆菌溶液，小心混合混合物，温育20分钟。除去农杆菌悬浮液，用50ml愈伤组织诱导培养基洗油籽油菜外植体1分钟，随后加入100ml愈伤组织诱导培养基。在定轨摇床上以100rpm共培养所述材料24小时。通过除去愈伤组织诱导培养基停止共培养，以100rpm用25ml洗涤培养基洗外植体2次，每次1分钟，再每次用100ml洗涤培养基洗2次60分钟。将洗涤培养基和外植体一起转移到15cm培养皿上，然后用无菌移液管除去培养基。
为了再生，转移成批的20-30块外植体到90mm培养皿中，该培养皿中含有25ml补充了卡那霉素的芽诱导培养基。用2层leukopor密封培养皿，在25℃以8小时黑暗光周期及2000Lux进行孵育。每12天，将发育的愈伤组织转移到含有芽诱导培养基的新培养皿中。如Bade，J.B和Damm，B.(inGene Transfer to Plants，Potrykus，I.和Spangenberg，G.，编辑，Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述进行再生完整植物的所有其它步骤。
实施例77a)转基因拟南芥和烟草植物的表征分析用上述构建体转化的植物(拟南芥和烟草)的叶和种子中生育酚和生育三烯酚的含量。为此，在温室中生长转基因植物，在Northern水平分析表达编码褐家鼠酪氨酸转氨酶1的基因的植物。测定这些植物的叶和种子中的生育酚含量和生育三烯酚含量。
为此，取样后，立即在液氮中冷冻植物叶片材料。随后通过在100％甲醇中在30℃以1000rpm于Eppendorf摇床中三次温育15分钟，利用搅拌装置实现细胞破碎。合并每种情况下得到的上清液。
进一步的温育步骤没有显示出更多的生育酚或生育三烯酚的释放。
为了避免氧化，借助于HPLC系统(Waters Allience 2690)提取后直接分析得到的提取物。利用反相柱(ProntoSil 200-3-C30(R)，Bischoff)，用100％甲醇为移动相分离生育酚和生育三烯酚，并借助于标准样品(Merck)进行鉴定。所用的检测系统是借助于Jasco FP 920荧光检测仪实现检测的物质的荧光(激发光295nm，发射光320nm)。
在所用情况中，与未转化的植物比较，转基因植物中生育酚和/或生育三烯酚的浓度增加了。
b)转基因欧洲油菜植物的表征为了示例说明通过单独表达褐家鼠酪氨酸转氨酶基因、拟南芥酪氨酸转氨酶基因1、拟南芥酪氨酸转氨酶基因3、拟南芥酪氨酸转氨酶基因5或拟南芥酪氨酸转氨酶基因6，或还表达至少一个选自下列的其它基因拟南芥羟苯基丙酮酸双加氧酶基因、拟南芥尿黑酸叶绿基转移酶基因、烟草牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶基因、集胞藻PCC6803的2-甲基-6-叶绿基氢醌甲转移酶基因、集胞藻PCC6803的2，3-二甲基-5-叶绿基质体醌醇环化酶基因、拟南芥γ-生育酚甲基转移酶基因以及抑制尿黑酸双加氧酶基因的表达可增加植物中维生素E的含量，分析利用上述构建体转化的植物(欧洲油菜)的种子中生育酚和生育三烯酚的含量。
为此，在温室中生长转基因植物，并且在Northern水平分析。类似实施例77a)，测定这些植物的种子中生育酚和生育三烯酚的含量。
实施例78过量表达酪氨酸转氨酶的转基因拟南芥植物的产生根据修改的真空浸渗方法(Steve Clough和Andrew Bent.花的浸渍一种用于农杆菌介导的拟南芥转化的简化方法Plant J 16(6)735-43，1998；Bechtold，N.Ellis，J.和Pelltier，G.，inPlanta Agrobacterium-mediatedgene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants.CRAcadSci Paris，1993，1144(2)204-212)，用根瘤农杆菌株系(GV3101[pMP90])转化野生型拟南芥植物(Columbia)。
根据R.HFGEN和L.WILLMITZER(Plant Sci.1990，66，221-230和Nucleic Acids Res.1988，十月25，16(20)，9877)描述的方法，先用质粒pBinAR-35s-IPP-RnTATase-nosT(实施例73，图61)和pPTVkan-LeB4-IPP-RnTATase-nosT(实施例72，图60)转化所用的根瘤农杆菌细胞。
基于抗生素抗性筛选最初转化体的种子。将对抗生素有抗性的幼苗移到土壤中，然后以充分发育的植物形式用于生物化学分析。
实施例79过量表达酪氨酸转氨酶的转基因欧洲油菜植物的产生基本如Bade，J.B.和Damm，B.(在“Gene Transfer to Plants”中，Potrykus，I.和Spangenberg，G.编辑，Springer Lab Manual，SpringerVerlag，1995，30-38)所述产生转基因油籽油菜植物，该篇文献也详述了所用培养基和缓冲液的组成。
用根瘤农杆菌株系GV3101[pMP90]实现转化。之前根据R.HFGEN和L.WILLMITZER(Plant Sci.1990，66，221-230和Nucleic Acids Res.1988，十月25，16(20)，9877)描述的方法，先用质粒pPTVkan-LeB4-IPP-RnTATase-nosT(实施例72，图60)转化所用的根瘤农杆菌细胞。
用70％乙醇(v/v)表面灭菌Brassica napus var.Westar的种子，然后55℃在水中洗10分钟，在1％次氯酸盐浓溶液(25％v/v Teepol，0.1％v/v吐温20)中温育20分钟，用无菌水洗6次，每次20分钟。在滤纸上干燥种子3天，在含有15ml发芽培养基的玻璃烧瓶中使10-15粒种子发芽。从几棵幼苗(约10cm大小)上切下根和顶端，将剩余的下胚轴切成约6mm长的段。由此获得的约600个外植体用50ml基础培养基洗30分钟，然后转移到300ml烧瓶中。添加100ml愈伤组织诱导培养基后，以100rpm温育培养物24小时。
在补充了卡那霉素(20mg/l)的Luria肉汤培养基中，29℃过夜培养农杆菌株系，之后在29℃在无卡那霉素的50ml Luria肉汤培养基中温育2ml这种农杆菌株系培养物4小时直到0.4-0.5 OD600。以2000rpm沉淀培养物25分钟后，在25ml基础培养基中重悬浮细胞沉淀物。通过进一步基础培养基的添加，使得溶液中细菌浓度达到0.3 OD600。
用无菌移液管除去油籽油菜外植体中的愈伤组织诱导培养基，加入50ml农杆菌溶液，小心混合混合物，温育20分钟。除去农杆菌悬浮液，用50ml愈伤组织诱导培养基洗油籽油菜外植体1分钟，随后加入100ml愈伤组织诱导培养基。在定轨摇床上以100rpm共培养所述材料24小时。通过除去愈伤组织诱导培养基停止共培养，之后以100rpm用25ml洗涤培养基洗外植体2次，每次1分钟，再每次用100ml洗涤培养基洗2次60分钟。将洗涤培养基和外植体一起转移到15cm培养皿上，用无菌移液管除去培养基。
为了再生，转移成批的20-30块外植体到90mm培养皿中，该培养皿中含有25ml补充了卡那霉素的芽诱导培养基。用2层leukopor密封培养皿，在25℃以8小时黑暗光周期及2000Lux进行温育。每12天，将发育的愈伤组织转移到含有芽诱导培养基的新培养皿中。如Bade，J.B和Damm，B.(在“Gene Transfer to Plants，Potrykus”中，I.和Spangenberg，G.，编辑，Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述进行再生完整植物的所有其它步骤。
实施例80过量表达酪氨酸转氨酶的转基因烟草植物的产生用根瘤农杆菌菌落接种10ml补充了抗生素的YEB培养基(5g/l牛肉膏，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM MgSO4)，在28℃过夜生长培养物。在4℃，用台式离心机，3500rpm沉淀细胞20分钟，然后在无菌条件下在无抗生素的新鲜YEB培养基中重悬浮细胞。此细胞悬浮液用于转化。
根据R.HFGEN和L.WILLMITZER(Plant Sci.1990，66，221-230和Nucleic Acids Res.1988，十月25，16(20)，9877)描述的方法，先用质粒pBinAR-35s-IPP-RnTATase-nosT(实施例73，图61)转化所用的根瘤农杆菌细胞。
通过营养繁殖获得无菌生长的野生型植物。为此，仅切下植物顶端，将其转移到无菌保存罐中的新鲜2MS培养基上。至于植物的其余部分，除去叶片上表面的绒毛和叶片中央叶脉。利用刀片将叶片切成约1cm2大小的部分。将农杆菌培养物转移到小培养皿中(直径2cm)。短暂地将这些叶片部分拖过该溶液，以叶片下表面将叶片放置在培养皿(直接9cm)中的2MS培养基上，这样使它们接触培养基。在25℃，黑暗中放置2天后，将外植体移植到具有愈伤组织诱导培养基的平板中，在可控环境的小室中保温到28℃。每7到10天需要更换培养基一次。一旦形成愈伤组织，将外植体转移到无菌保存罐中，该无菌保存罐含有补充了头孢氨噻肟的芽诱导培养基(0.6％BiTec琼脂(w/v)，2.0mg/l玉米素核糖，0.02mg/l萘乙酸，0.02mg/l赤霉酸，0.25g/ml头孢氨噻肟，1.6％葡萄糖(w/v)和50mg/l卡那霉素)。约1个月后，开始器官发生，可以切下已经形成的芽。
在补充了头孢氨噻肟和选择标记的2MS培养基上培养这些芽。一旦形成实质上的根团(root ball)，可以将植物盆栽在种子培养料中。
实施例81实施例78，79和80的转基因植物的表征分析实施例78，79和80的用上述构建体转化的植物(拟南芥，欧洲油菜和烟草)的叶和种子中生育酚和生育三烯酚的含量。为此，在温室中生长转基因植物，在Northern水平上分析表达编码褐家鼠酪氨酸转氨酶的基因的植物。测定这些植物的叶和种子中生育酚的含量和生育三烯酚的含量。
为此，取样后，立即在液氮中冷冻植物叶片材料。随后通过在100％甲醇中在30℃于1000rpm在Eppendorf摇床中三次温育15分钟，利用搅拌装置实现细胞的破碎。合并每种情况下得到的上清液。
进一步的温育步骤没有显示出更多的生育酚或生育三烯酚的释放。
为了避免氧化，借助于HPLC系统(Waters Allience 2690)提取后直接分析得到的提取物。利用反相柱(ProntoSil 200-3-C30，Bischoff)，用100％甲醇为移动相分离生育酚和生育三烯酚，并借助于标准样品(Merck)进行鉴定。所用的检测系统是借助于Jasco FP 920荧光检测仪进行检测的物质的荧光(激发光295nm，发射光320nm)。
表1显示与野生型比较(WT，4个重复)，实施例80产生的16个转基因烟草植物株系(株系1到24)中褐家鼠酪氨酸转氨酶过量表达的结果。第二列显示以[μg/g FW]表示的幼叶材料中维生素E的含量(总含量＝所有8种异构体的总和)。第三列显示以[％重量]表示的总维生素E含量中所述株系的生育三烯酚含量。
表1
图63是与野生型比较，烟草(实施例80)中褐家鼠酪氨酸转氨酶过量表达的结果的图示。所示数据是幼叶材料中维生素E的含量(所有8种异构体的总和)。坐标轴的描绘指示单独的各转基因株。所示野生型植物(wt)的数据为4个重复的平均值+/-SD。
序列表<110>太阳基因两合公司(SunGene GmbH & Co.KgaA)<120>通过增加酪氨酸转氨酶活性增加生物体中的维生素E含量<130>0817/00021<140>
<141>
<160>58<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1377<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1371)<400>1gat atc atg gac tcc tac gtg att cag acg gat gtc gac gac agc ttg48Asp Ile Met Asp Ser Tyr Val Ile Gln Thr Asp Val Asp Asp Ser Leu1 5 10 15tcc tca gtt ctg gat gtg cat gtc aat att ggt ggg aga aac tcg gta96Ser Ser Val Leu Asp Val His Val Asn Ile Gly Gly Arg Asn Ser Val20 25 30caa gga aga aag aaa ggc agg aag gcc aga tgg gac gtg aga ccc tct144Gln Gly Arg Lys Lys Gly Arg Lys Ala Arg Trp Asp Val Arg Pro Ser35 40 45gac atg tcc aat aag acc ttc aat ccc atc cga gcc atc gtg gac aac192Asp Met Ser Asn Lys Thr Phe Asn Pro Ile Arg Ala Ile Val Asp Asn50 55 60atg aag gtg cag ccc aat ccg aac aag acc gtg att tct ctg tca att240Met Lys Val Gln Pro Asn Pro Asn Lys Thr Val Ile Ser Leu Ser Ile65 70 75 80
ggg gac cct act gtg ttt ggg aac ctg cct aca gac cct gaa gtt acc288Gly Asp Pro Thr Val Phe Gly Asn Leu Pro Thr Asp Pro Glu Val Thr85 90 95caa gcc atg aaa gat gcc ctg gac tcg ggg aag tac aat ggc tat gcc336Gln Ala Met Lys Asp Ala Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gly Tyr Ala100 105 110ccg tcc atc ggc tac cta tcc agt cgg gag gag gtc gct tct tac tac384Pro Ser Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Arg Glu Glu Val Ala Ser Tyr Tyr115 120 125cac tgt cat gag gct cct ctg gaa gct aag gat gtc att ctg aca agc432His Cys His Glu Ala Pro Leu Glu Ala Lys Asp Val Ile Leu Thr Ser130 135 140ggc tgc agt cag gcc att gag cta tgt cta gct gtg ttg gcc aat cct480Gly Cys Ser Gln Ala Ile Glu Leu Cys Leu Ala Val Leu Ala Asn Pro145 150 155 160gga caa aac atc ctc att cca agg ccc ggg ttt tcc ctc tat agg act528Gly Gln Asn Ile Leu Ile Pro Arg Pro Gly Phe Ser Leu Tyr Arg Thr165 170 175ttg gct gag tct atg gga att gag gtc aag ctc tac aat ctc ctg cct576Leu Ala Glu Ser Met Gly Ile Glu Val Lys Leu Tyr Asn Leu Leu Pro180 185 190gag aag tct tgg gaa att gac cta aaa caa ctg gaa tct ctg atc gat624Glu Lys Ser Trp Glu Ile Asp Leu Lys Gln Leu Glu Ser Leu Ile Asp195 200 205gaa aaa aca gcg tgt ctt gtt gtc aac aac cca tcc aat ccc tgt ggc672Glu Lys Thr Ala Cys Leu Val Val Asn Asn Pro Ser Asn Pro Cys Gly210 215 220tcc gtg ttc agt aag cga cac ctt cag aag att ttg gca gtg gct gaa720Ser Val Phe Ser Lys Arg His Leu Gln Lys Ile Leu Ala Val Ala Glu225 230 235 240agg cag tgt gtc ccc atc tta gct gac gag atc tat ggt gac atg gtg768Arg Gln Cys Val Pro Ile Leu Ala Asp Glu Ile Tyr Gly Asp Met Val245 250 255ttt tca gat tgc aaa tac gaa cca ctg gcc aac ctc agc acc aat gtt816
Phe Ser Asp Cys Lys Tyr Glu Pro Leu Ala Asn Leu Ser Thr Asn Val260 265 270ccc atc ctg tcc tgt ggt ggg ctg gcc aag cgc tgg ctg gtt cct ggc864Pro Ile Leu Ser Cys Gly Gly Leu Ala Lys Arg Trp Leu Val Pro Gly275 280 285tgg agg ttg ggc tgg atc ctc att cat gat cga aga gac att ttt ggc912Trp Arg Leu Gly Trp Ile Leu Ile His Asp Arg Arg Asp Ile Phe Gly290 295 300aat gag att cga gac ggg ctg gtg aaa ctg agt cag cgg atc ctg gga960Asn Glu Ile Arg Asp Gly Leu Val Lys Leu Ser Gln Arg Ile Leu Gly305 310 315 320cca tgc acc ata gtc cag ggt gct ctg aag agc atc ctt cag cga acc1008Pro Cys Thr Ile Val Gln Gly Ala Leu Lys Ser Ile Leu Gln Arg Thr325 330 335cct cag gag ttc tat cac gac acg tta agc ttc ctc aag tcc aat gcg1056Pro Gln Glu Phe Tyr His Asp Thr Leu Ser Phe Leu Lys Ser Asn Ala340 345 350gac ctc tgc tat ggg gca ctg gct gcc atc cct gga ctc cag ccg gtc1104Asp Leu Cys Tyr Gly Ala Leu Ala Ala Ile Pro Gly Leu Gln Pro Val355 360 365cgc cct tct gga gcc atg tac ctt atg gtg gga att gag atg gag cat1152Arg Pro Ser Gly Ala Met Tyr Leu Met Val Gly Ile Glu Met Glu His370 375 380ttc ccg gaa ttc gag aac gac gtg gag ttc aca gag cgg ttg att gcg1200Phe Pro Glu Phe Glu Asn Asp Val Glu Phe Thr Glu Arg Leu Ile Ala385 390 395 400gag cag gct gtc cac tgt ctc cca gca acg tgc ttc gag tac cca aat1248Glu Gln Ala Val His Cys Leu Pro Ala Thr Cys Phe Glu Tyr Pro Asn405 410 415ttc ttc cga gtg gtc atc aca gtc ccc gag gtg atg atg ctg gag gct1296Phe Phe Arg Val Val Ile Thr Val Pro Glu Val Met Met Leu Glu Ala420 425 430tgt agc cgg atc cag gag ttc tgt gaa cag cac tac cac tgt gct gaa1344Cys Ser Arg Ile Gln Glu Phe Cys Glu Gln His Tyr His Cys Ala Glu
435 440 445ggc agc cag gag gag tgt gac aaa taa gatatc 1377Gly Ser Gln Glu Glu Cys Asp Lys450 455<210>2<211>456<212>PRT<213>褐家鼠<400>2Asp Ile Met Asp Ser Tyr Val Ile Gln Thr Asp Val Asp Asp Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Val Leu Asp Val His Val Asn Ile Gly Gly Arg Asn Ser Val20 25 30Gln Gly Arg Lys Lys Gly Arg Lys Ala Arg Trp Asp Val Arg Pro Ser35 40 45Asp Met Ser Asn Lys Thr Phe Asn Pro Ile Arg Ala Ile Val Asp Asn50 55 60Met Lys Val Gln Pro Asn Pro Asn Lys Thr Val Ile Ser Leu Ser Ile65 70 75 80Gly Asp Pro Thr Val Phe Gly Asn Leu Pro Thr Asp Pro Glu Val Thr85 90 95Gln Ala Met Lys Asp Ala Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gly Tyr Ala100 105 110Pro Ser Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Arg Glu Glu Val Ala Ser Tyr Tyr115 120 125His Cys His Glu Ala Pro Leu Glu Ala Lys Asp Val Ile Leu Thr Ser130 135 140Gly Cys Ser Gln Ala Ile Glu Leu Cys Leu Ala Val Leu Ala Asn Pro145 150 155 160Gly Gln Asn Ile Leu Ile Pro Arg Pro Gly Phe Ser Leu Tyr Arg Thr165 170 175
Leu Ala Glu Ser Met Gly Ile Glu Val Lys Leu Tyr Asn Leu Leu Pro180 185 190Glu Lys Ser Trp Glu Ile Asp Leu Lys Gln Leu Glu Ser Leu Ile Asp195 200 205Glu Lys Thr Ala Cys Leu Val Val Asn Asn Pro Ser Asn Pro Cys Gly210 215 220Ser Val Phe Ser Lys Arg His Leu Gln Lys Ile Leu Ala Val Ala Glu225 230 235 240Arg Gln Cys Val Pro Ile Leu Ala Asp Glu Ile Tyr Gly Asp Met Val245 250 255Phe Ser Asp Cys Lys Tyr Glu Pro Leu Ala Asn Leu Ser Thr Asn Val260 265 270Pro Ile Leu Ser Cys Gly Gly Leu Ala Lys Arg Trp Leu Val Pro Gly275 280 285Trp Arg Leu Gly Trp Ile Leu Ile His Asp Arg Arg Asp Ile Phe Gly290 295 300Asn Glu Ile Arg Asp Gly Leu Val Lys Leu Ser Gln Arg Ile Leu Gly305 310 315 320Pro Cys Thr Ile Val Gln Gly Ala Leu Lys Ser Ile Leu Gln Arg Thr325 330 335Pro Gln Glu Phe Tyr His Asp Thr Leu Ser Phe Leu Lys Ser Asn Ala340 345 350Asp Leu Cys Tyr Gly Ala Leu Ala Ala Ile Pro Gly Leu Gln Pro Val355 360 365Arg Pro Ser Gly Ala Met Tyr Leu Met Val Gly Ile Glu Met Glu His370 375 380Phe Pro Glu Phe Glu Asn Asp Val Glu Phe Thr Glu Arg Leu Ile Ala385 390 395 400Glu Gln Ala Val His Cys Leu Pro Ala Thr Cys Phe Glu Tyr Pro Asn405 410 415
Phe Phe Arg Val Val Ile Thr Val Pro Glu Val Met Met Leu Glu Ala420 425 430Cys Ser Arg Ile Gln Glu Phe Cys Glu Gln His Tyr His Cys Ala Glu435 440 445Gly Ser Gln Glu Glu Cys Asp Lys450 455<2l0>3<211>1365<212>DNA<213>褐家鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(1365)<400>3atg gac tcc tac gtg att cag acg gat gtc gac gac agc ttg tcc tca48Met Asp Ser Tyr Val Ile Gln Thr Asp Val Asp Asp Ser Leu Ser Ser1 5 10 15gtt ctg gat gtg cgt gtc aat gtt ggt ggg aga aac tcg gta caa gga96Val Leu Asp Val Arg Val Asn Val Gly Gly Arg Asn Ser Val Gln Gly20 25 30aga aag aaa ggc agg aag gcc aga tgg gac gtg aga ccc tct gac atg144Arg Lys Lys Gly Arg Lys Ala Arg Trp Asp Val Arg Pro Ser Asp Met35 40 45tcc aat aag acc ttc aat ccc atc cga gcc atc gtg gac aac atg aag192Ser Asn Lys Thr Phe Asn Pro Ile Arg Ala Ile Val Asp Asn Met Lys50 55 60gtg cag ccc aat ccg aac aag acc gtg att tct ctg tca att ggg gac240Val Gln Pro Asn Pro Asn Lys Thr Val Ile Ser Leu Ser Ile Gly Asp65 70 75 80cct act gtg ttt ggg aac ctg cct aca gac cct gaa gtt acc caa gcc288Pro Thr Val Phe Gly Asn Leu Pro Thr Asp Pro Glu Val Thr Gln Ala85 90 95
atg aaa gat gcc ctg gac tcg ggg aag tac aat ggc tat gcc ccg tcc336Met Lys Asp Ala Leu Asp Ser Gly Lys Tyr Asn Gly Tyr Ala Pro Ser100 105 110atc ggc tac cta tcc agt cgg gag gag gtc gct tct tac tac cac tgt384Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Arg Glu Glu Val Ala Ser Tyr Tyr His Cys115 120 125cat gag gct cct ctg gaa gct aag gat gtc att ctg aca agc ggc tgc432His Glu Ala Pro Leu Glu Ala Lys Asp Val Ile Leu Thr Ser Gly Cys130 135 140agt cag gcc att gag cta tgt cta gct gtg ttg gcc aat cct gga caa480Ser Gln Ala Ile Glu Leu Cys Leu Ala Val Leu Ala Asn Pro Gly Gln145 150 155 160aac atc ctc att cca agg ccc ggg ttt tcc ctc tat agg act ttg gct528Asn Ile Leu Ile Pro Arg Pro Gly Phe Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ala165 170 175gag tct atg gga att gag gtc aag ctc tac aat ctc ctg ccc gag aag576Glu Ser Met Gly Ile Glu Val Lys Leu Tyr Asn Leu Leu Pro Glu Lys180 185 190tct tgg gaa att gac cta aaa caa ctg gaa tct ctg atc gat gaa aaa624Ser Trp Glu Ile Asp Leu Lys Gln Leu Glu Ser Leu Ile Asp Glu Lys195 200 205aca gcg tgt ctt gtt gtc aac aac cca tcc aat ccc tgt ggc tcc gtg672Thr Ala Cys Leu Val Val Asn Asn Pro Ser Asn Pro Cys Gly Ser Val210 215 220ttc agt aag cgg cac ctt cag aag att ttg gca gtg gct gaa agg cag720Phe Ser Lys Arg His Leu Gln Lys Ile Leu Ala Val Ala Glu Arg Gln225 230 235 240tgt gtc ccc atc tta gct gac gag atc tat ggt gac atg gtg ttt tca768Cys Val Pro Ile Leu Ala Asp Glu Ile Tyr Gly Asp Met Val Phe Ser245 250 255gac tgc aaa tac gaa cca ctg gcc aac ctc agc acc aat gtt ccc atc816Asp Cys Lys Tyr Glu Pro Leu Ala Asn Leu Ser Thr Asn Val Pro Ile260 265 270ctg tcc tgt ggt ggg ctg gcc aag cgc tgg ctg gtt cct ggc tgg agg864
Leu Ser Cys Gly Gly Leu Ala Lys Arg Trp Leu Val Pro Gly Trp Arg275 280 285ttg ggc tgg atc ctc att cat gat cga aga gac att ttt ggc aat gag912Leu Gly Trp Ile Leu Ile His Asp Arg Arg Asp Ile Phe Gly Asn Glu290 295 300att cga gac ggg ctg gtg aaa ctg agt cag cgg atc ctg gga cca tgc960Ile Arg Asp Gly Leu Val Lys Leu Ser Gln Arg Ile Leu Gly Pro Cys305 310 315 320acc ata gtc cag ggt gct ctg aag agc atc ctt cag cga acc cct cag1008Thr Ile Val Gln Gly Ala Leu Lys Ser Ile Leu Gln Arg Thr Pro Gln325 330 335gag ttc tat cac gac acg tta agc ttc ctc aag tcc aat gcg gac ctc1056Glu Phe Tyr His Asp Thr Leu Ser Phe Leu Lys Ser Asn Ala Asp Leu340 345 350tgc tat ggg gca ctg gct gcc atc cct gga ctc cag ccg gtc cgc cct1104Cys Tyr Gly Ala Leu Ala Ala Ile Pro Gly Leu Gln Pro Val Arg Pro355 360 365tct gga gcc atg tac ctt atg gtg gga att gag atg gag cat ctc ccg1152Ser Gly Ala Met Tyr Leu Met Val Gly Ile Glu Met Glu His Leu Pro370 375 380gaa ttc gag aac gac gtg gag ttc aca gag cgg ttg att gcg gag cag1200Glu Phe Glu Asn Asp Val Glu Phe Thr Glu Arg Leu Ile Ala Glu Gln385 390 395 400gct gtc cac tgt ctc cca gca acg tgc ttc gag tac cca aat ttc ttc1248Ala Val His Cys Leu Pro Ala Thr Cys Phe Glu Tyr Pro Asn Phe Phe405 410 415cga gtg gtc atc aca gtc ccc gag gtg atg atg ctg gag gct tgt agc1296Arg Val Val Ile Thr Val Pro Glu Val Met Met Leu Glu Ala Cys Ser420 425 430cgg atc cag gag ttc tgt gaa cag cac tac cac tgt gct gaa ggc agc1344Arg Ile Gln Glu Phe Cys Glu Gln His Tyr His Cys Ala Glu Gly Ser435 440 445cag gag gag tgt gac aaa taa1365Gln Glu Glu Cys Asp Lys
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gct ctt ttt gtg agt ttc atg ctc ggt act gca tac tct atc aat ttg672Ala Leu Phe Val Ser Phe Met Leu Gly Thr Ala Tyr Ser Ile Asn Leu210 215 220cca ctt tta cgg tgg aaa aga ttt gca ttg gtt gca gca atg tgt atc720Pro Leu Leu Arg Trp Lys Arg Phe Ala Leu Val Ala Ala Met Cys Ile225 230 235 240ctc gct gtc cga gct att att gtt caa atc gcc ttt tat cta cat att768Leu Ala Val Arg Ala Ile Ile Val Gln Ile Ala Phe Tyr Leu His Ile245 250 255cag aca cat gtg ttt gga aga cca atc ttg ttc act agg cct ctt att816Gln Thr His Val Phe Gly Arg Pro Ile Leu Phe Thr Arg Pro Leu Ile260 265 270ttc gcc act gcg ttt atg agc ttt ttc tct gtc gtt att gca ttg ttt864Phe Ala Thr Ala Phe Met Ser Phe Phe Ser Val Val Ile Ala Leu Phe275 280 285aag gat ata cct gat atc gaa ggg gat aag ata ttc gga atc cga tca912Lys Asp Ile Pro Asp Ile Glu Gly Asp Lys Ile Phe Gly Ile Arg Ser290 295 300ttc tct gta act ctg ggt cag aaa cgg gtg ttt tgg aca tgt gtt aca960Phe Ser Val Thr Leu Gly Gln Lys Arg Val Phe Trp Thr Cys Val Thr305 310 315 320cta ctt caa atg gct tac gct gtt gca att cta gtt gga gcc aca tct1008Leu Leu Gln Met Ala Tyr Ala Val Ala Ile Leu Val Gly Ala Thr Ser325 330 335cca ttc ata tgg agc aaa gtc atc tcg gtt gtg ggt cat gtt ata ctc1056Pro Phe Ile Trp Ser Lys Val Ile Ser Val Val Gly His Val Ile Leu340 345 350gca aca act ttg tgg gct cga gct aag tcc gtt gat ctg agt agc aaa1104Ala Thr Thr Leu Trp Ala Arg Ala Lys Ser Val Asp Leu Ser Ser Lys355 360 365acc gaa ata act tca tgt tat atg ttc ata tgg aag ctc ttt tat gca1152Thr Glu Ile Thr Ser Cys Tyr Met Phe Ile Trp Lys Leu Phe Tyr Ala370 375 380gag tac ttg ctg tta cct ttt ttg aag tga1182
Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Phe Leu Lys385 390<210>16<211>393<212>PRT<213>拟南芥<400>16Met Glu Ser Leu Leu Ser Ser Ser Ser Leu Val Ser Ala Ala Gly Gly1 5 10 15Phe Cys Trp Lys Lys Gln Asn Leu Lys Leu His Ser Leu Ser Glu Ile20 25 30Arg Val Leu Arg Cys Asp Ser Ser Lys Val Val Ala Lys Pro Lys Phe35 40 45Arg Asn Asn Leu Val Arg Pro Asp Gly Gln Gly Ser Ser Leu Leu Leu50 55 60Tyr Pro Lys His Lys Ser Arg Phe Arg Val Asn Ala Thr Ala Gly Gln65 70 75 80Pro Glu Ala Phe Asp Ser Asn Ser Lys Gln Lys Ser Phe Arg Asp Ser85 90 95Leu Asp Ala Phe Tyr Arg Phe Ser Arg Pro His Thr Val Ile Gly Thr100 105 110Val Leu Ser Ile Leu Ser Val Ser Phe Leu Ala Val Glu Lys Val Ser115 120 125Asp Ile Ser Pro Leu Leu Phe Thr Gly Ile Leu Glu Ala Val Val Ala130 135 140Ala Leu Met Met Asn Ile Tyr Ile Val Gly Leu Asn Gln Leu Ser Asp145 150 155 160Val Glu Ile Asp Lys Val Asn Lys Pro Tyr Leu Pro Leu Ala Ser Gly165 170 175Glu Tyr Ser Val Asn Thr Gly Ile Ala Ile Val Ala Ser Phe Ser Ile180 185 190
Met Ser Phe Trp Leu Gly Trp Ile Val Gly Ser Trp Pro Leu Phe Trp195 200 205Ala Leu Phe Val Ser Phe Met Leu Gly Thr Ala Tyr Ser Ile Asn Leu210 215 220Pro Leu Leu Arg Trp Lys Arg Phe Ala Leu Val Ala Ala Met Cys Ile225 230 235 240Leu Ala Val Arg Ala Ile Ile Val Gln Ile Ala Phe Tyr Leu His Ile245 250 255Gln Thr His Val Phe Gly Arg Pro Ile Leu Phe Thr Arg Pro Leu Ile260 265 270Phe Ala Thr Ala Phe Met Ser Phe Phe Ser Val Val Ile Ala Leu Phe275 280 285Lys Asp Ile Pro Asp Ile Glu Gly Asp Lys Ile Phe Gly Ile Arg Ser290 295 300Phe Ser Val Thr Leu Gly Gln Lys Arg Val Phe Trp Thr Cys Val Thr305 310 315 320Leu Leu Gln Met Ala Tyr Ala Val Ala Ile Leu Val Gly Ala Thr Ser325 330 335Pro Phe Ile Trp Ser Lys Val Ile Ser Val Val Gly His Val Ile Leu340 345 350Ala Thr Thr Leu Trp Ala Arg Ala Lys Ser Val Asp Leu Ser Ser Lys355 360 365Thr Glu Ile Thr Ser Cys Tyr Met Phe Ile Trp Lys Leu Phe Tyr Ala370 375 380Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Phe Leu Lys385 390<210>17<211>1509<212>DNA<213>烟草(Nicotiana tabacum)
<220>
<221>CDS<222>(1)..(1395)<400>17atg gct tcc att gct ctc aaa act ttc acc ggc ctc cgt caa tcc tcg48Met Ala Ser Ile Ala Leu Lys Thr Phe Thr Gly Leu Arg Gln Ser Ser1 5 10 15ccg gaa aac aat tcc att act ctt tct aaa tcc ctc ccc ttc acc caa96Pro Glu Asn Asn Ser Ile Thr Leu Ser Lys Ser Leu Pro Phe Thr Gln20 25 30acc cac cgt agg ctc cga atc aat gct tcc aaa tcc agc cca aga gtc144Thr His Arg Arg Leu Arg Ile Asn Ala Ser Lys Ser Ser Pro Arg Val35 40 45aac ggc cgc aat ctt cgt gtt gcg gtg gtg ggc ggt ggt cct gct ggt192Asn Gly Arg Asn Leu Arg Val Ala Val Val Gly Gly Gly Pro Ala Gly50 55 60ggc gcc gcc gct gaa aca ctc gcc aag gga gga att gaa acc ttc tta240Gly Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ala Lys Gly Gly Ile Glu Thr Phe Leu65 70 75 80atc gaa cgc aaa atg gac aac tgc aaa ccc tgc ggt ggg gcc atc cca288Ile Glu Arg Lys Met Asp Asn Cys Lys Pro Cys Gly Gly Ala Ile Pro85 90 95ctt tgc atg gtg gga gaa ttt gac ctc cct ttg gat atc att gac cgg336Leu Cys Met Val Gly Glu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Ile Ile Asp Arg100 105 110aaa gtt aca aag atg aag atg att tcc cca tcc aac gtt gct gtt gat384Lys Val Thr Lys Met Lys Met Ile Ser Pro Ser Asn Val Ala Val Asp115 120 125att ggt cag act tta aag cct cac gag tac atc ggt atg gtg cgc cgc432Ile Gly Gln Thr Leu Lys Pro His Glu Tyr Ile Gly Met Val Arg Arg130 135 140gaa gta ctc gat gct tac ctc cgt gac cgc gct gct gaa gcc gga gcc480Glu Val Leu Asp Ala Tyr Leu Arg Asp Arg Ala Ala Glu Ala Gly Ala145 150 155 160
tct gtt ctc aac ggc ttg ttc ctc aaa atg gac atg ccc aaa gct ccc528Ser Val Leu Asn Gly Leu Phe Leu Lys Met Asp Met Pro Lys Ala Pro165 170 175aac gca cct tac gtc ctt cac tac aca gct tac gac tcc aaa act aat576Asn Ala Pro Tyr Val Leu His Tyr Thr Ala Tyr Asp Ser Lys Thr Asn180 185 190ggc gcg ggg gag aag cgt acc ctg gaa gtt gac gcc gtt atc ggc gct624Gly Ala Gly Glu Lys Arg Thr Leu Glu Val Asp Ala Val Ile Gly Ala195 200 205gac ggt gca aat tcc cgt gtc gca aaa tcc ata aac gcc ggt gac tac672Asp Gly Ala Asn Ser Arg Val Ala Lys Ser Ile Asn Ala Gly Asp Tyr210 215 220gag tac gct att gca ttc caa gaa agg att aaa att tcc gat gat aaa720Glu Tyr Ala Ile Ala Phe Gln Glu Arg Ile Lys Ile Ser Asp Asp Lys225 230 235 240atg aag tat tac gag aat tta gct gaa atg tac gtg ggt gat gac gtg768Met Lys Tyr Tyr Glu Asn Leu Ala Glu Met Tyr Val Gly Asp Asp Val245 250 255tcc cct gat ttt tac ggg tgg gtt ttc ccc aaa tgt gac cac gtt gcc816Ser Pro Asp Phe Tyr Gly Trp Val Phe Pro Lys Cys Asp His Val Ala260 265 270gtt ggc act ggc aca gtc acc cac aaa gct gac atc aaa aaa ttc cag864Val Gly Thr Gly Thr Val Thr His Lys Ala Asp Ile Lys Lys Phe Gln275 280 285cta gct aca aga ttg aga gct gat tcc aaa atc acc ggc gga aaa att912Leu Ala Thr Arg Leu Arg Ala Asp Ser Lys Ile Thr Gly Gly Lys Ile290 295 300atc cgg gtc gag gcc cac ccg att cca gaa cac cca aga ccc aga aga960Ile Arg Val Glu Ala His Pro Ile Pro Glu His Pro Arg Pro Arg Arg305 310 315 320tta caa gac aga gtt gca ttg gtt ggt gat gcg gca ggg tac gtg acc1008Leu Gln Asp Arg Val Ala Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Tyr Val Thr325 330 335
aaa tgt tcg ggc gaa ggg att tac ttc gcg gca aag agt gga cgt atg1056Lys Cys Ser Gly Glu Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Lys Ser Gly Arg Met340 345 350tgt gct gaa gca att gtt gaa ggg tca gaa atg gga aaa aga atg gtg1104Cys Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly Ser Glu Met Gly Lys Arg Met Val355 360 365gac gag agt gat ttg agg aag tat ttg gag aaa tgg gac aag act tat1152Asp Glu Ser Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Glu Lys Trp Asp Lys Thr Tyr370 375 380tgg cca acg tac aag gtg ctt gat ata ttg cag aag gta ttt tac agg1200Trp Pro Thr Tyr Lys Val Leu Asp Ile Leu Gln Lys Val Phe Tyr Arg385 390 395 400tcg aat ccg gcg agg gaa gca ttt gtt gaa atg tgc gca gat gag tat1248Ser Asn Pro Ala Arg Glu Ala Phe Val Glu Met Cys Ala Asp Glu Tyr405 410 415gtg cag aag atg aca ttt gac agc tat ttg tac aag aaa gta gca cca1296Val Gln Lys Met Thr Phe Asp Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Val Ala Pro420 425 430gga aac cca att gaa gac ttg aag ctt gct gtg aat acc att gga agt1344Gly Asn Pro Ile Glu Asp Leu Lys Leu Ala Val Asn Thr Ile Gly Ser435 440 445ttg gtg aga gct aat gca cta aga agg gaa atg gac aag ctc agt gta1392Leu Val Arg Ala Asn Ala Leu Arg Arg Glu Met Asp Lys Leu Ser Val450 455 460taa gaagattaac agcattaata ttttcttgta attgaaggat ttatttctca 1445465aattactctg taaacacctt tcatcctgcc tttaatcgga tttatgtaac ttcataattt 1505gagc 1509<210>18<211>464<212>PRT<213>烟草
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225 230 235 240Met Lys Tyr Tyr Glu Asn Leu Ala Glu Met Tyr Val Gly Asp Asp Val245 250 255Ser Pro Asp Phe Tyr Gly Trp Val Phe Pro Lys Cys Asp His Val Ala260 265 270Val Gly Thr Gly Thr Val Thr His Lys Ala Asp Ile Lys Lys Phe Gln275 280 285Leu Ala Thr Arg Leu Arg Ala Asp Ser Lys Ile Thr Gly Gly Lys Ile290 295 300Ile Arg Val Glu Ala His Pro Ile Pro Glu His Pro Arg Pro Arg Arg305 310 315 320Leu Gln Asp Arg Val Ala Leu Val Gly Asp Ala Ala Gly Tyr Val Thr325 330 335Lys Cys Ser Gly Glu Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Lys Ser Gly Arg Met340 345 350Cys Ala Glu Ala Ile Val Glu Gly Ser Glu Met Gly Lys Arg Met Val355 360 365Asp Glu Ser Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Glu Lys Trp Asp Lys Thr Tyr370 375 380Trp Pro Thr Tyr Lys Val Leu Asp Ile Leu Gln Lys Val Phe Tyr Arg385 390 395 400Ser Asn Pro Ala Arg Glu Ala Phe Val Glu Met Cys Ala Asp Glu Tyr405 410 415Val Gln Lys Met Thr Phe Asp Ser Tyr Leu Tyr Lys Lys Val Ala Pro420 425 430Gly Asn Pro Ile Glu Asp Leu Lys Leu Ala Val Asn Thr Ile Gly Ser435 440 445Leu Val Arg Ala Asn Ala Leu Arg Arg Glu Met Asp Lys Leu Ser Val450 455 460
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gcg gtg gac gat gct atg gct ttg tct ttt cct gac ggt agt ttc gac480Ala Val Asp Asp Ala Met Ala Leu Ser Phe Pro Asp Gly Ser Phe Asp145 150 155 160gta gtt tgg tcg gtg gaa gca ggg ccc cac atg cct gac aaa gct gtg528Val Val Trp Ser Val Glu Ala Gly Pro His Met Pro Asp Lys Ala Val165 170 175ttt gcc aag gaa tta ctg cgg gtc gtg aaa cca ggg ggc att ctg gtg576Phe Ala Lys Glu Leu Leu Arg Val Val Lys Pro Gly Gly Ile Leu Val180 185 190gtg gcg gat tgg aat caa cgg gac gat cgc caa gtg ccc ctc aac ttc624Val Ala Asp Trp Asn Gln Arg Asp Asp Arg Gln Val Pro Leu Asn Phe195 200 205tgg gaa aaa cca gtg atg cga caa ctg ttg gat caa tgg tcc cac cct672Trp Glu Lys Pro Val Met Arg Gln Leu Leu Asp Gln Trp Set His Pro210 215 220gcc ttt gcc agc att gaa ggt ttt gcg gaa aat ttg gaa gcc acg ggt720Ala Phe Ala Ser Ile Glu Gly Phe Ala Glu Asn Leu Glu Ala Thr Gly225 230 235 240ttg gtg gag ggc cag gtg act act gct gat tgg act gta ccg acc ctc768Leu Val Glu Gly Gln Val Thr Thr Ala Asp Trp Thr Val Pro Thr Leu245 250 255ccc gct tgg ttg gat acc att tgg cag ggc att atc cgg ccc cag ggc816Pro Ala Trp Leu Asp Thr Ile Trp Gln Gly Ile Ile Arg Pro Gln Gly260 265 270tgg tta caa tac ggc att cgt ggg ttt atc aaa tcc gtg cgg gaa gta864Trp Leu Gln Tyr Gly Ile Arg Gly Phe Ile Lys Ser Val Arg Glu Val275 280 285ccg act att tta ttg atg cgc ctt gcc ttt ggg gta gga ctt tgt cgc912Pro Thr Ile Leu Leu Met Arg Leu Ala Phe Gly Val Gly Leu Cys Arg290 295 300ttc ggt atg ttc aaa gca gtg cga aaa aac gcc act caa gct taa957Phe Gly Met Phe Lys Ala Val Arg Lys Asn Ala Thr Gln Ala305 310 315
<210>20<211>318<212>PRT<213>集胞藻PCC6803<400>20Met Pro Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ile Ser Leu Ser Leu1 5 10 15Ala Ile Ala Ala Gly Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Arg Gly Tyr Gln Ser20 25 30Ser Asp Ser Val Ala Asn Ala Tyr Asp Gln Trp Thr Glu Asp Gly Ile35 40 45Leu Glu Tyr Tyr Trp Gly Asp His Ile His Leu Gly His Tyr Gly Asp50 55 60Pro Pro Val Ala Lys Asp Phe Ile Gln Ser Lys Ile Asp Phe Val His65 70 75 80Ala Met Ala Gln Trp Gly Gly Leu Asp Thr Leu Pro Pro Gly Thr Thr85 90 95Val Leu Asp Val Gly Cys Gly Ile Gly Gly Ser Ser Arg Ile Leu Ala100 105 110Lys Asp Tyr Gly Phe Asn Val Thr Gly Ile Thr Ile Ser Pro Gln Gln115 120 125Val Lys Arg Ala Thr Glu Leu Thr Pro Pro Asp Val Thr Ala Lys Phe130 135 140Ala Val Asp Asp Ala Met Ala Leu Ser Phe Pro Asp Gly Ser Phe Asp145 150 155 160Val Val Trp Ser Val Glu Ala Gly Pro His Met Pro Asp Lys Ala Val165 170 175Phe Ala Lys Glu Leu Leu Arg Val Val Lys Pro Gly Gly Ile Leu Val180 185 190Val Ala Asp Trp Asn Gln Arg Asp Asp Arg Gln Val Pro Leu Asn Phe195 200 205
Trp Glu Lys Pro Val Met Arg Gln Leu Leu Asp Gln Trp Ser His Pro210 215 220Ala Phe Ala Ser Ile Glu Gly Phe Ala Glu Asn Leu Glu Ala Thr Gly225 230 235 240Leu Val Glu Gly Gln Val Thr Thr Ala Asp Trp Thr Val Pro Thr Leu245 250 255Pro Ala Trp Leu Asp Thr Ile Trp Gln Gly Ile Ile Arg Pro Gln Gly260 265 270Trp Leu Gln Tyr Gly Ile Arg Gly Phe Ile Lys Ser Val Arg Glu Val275 280 285Pro Thr Ile Leu Leu Met Arg Leu Ala Phe Gly Val Gly Leu Cys Arg290 295 300Phe Gly Met Phe Lys Ala Val Arg Lys Asn Ala Thr Gln Ala305 310 315<210>21<211>1100<212>DNA<213>集胞藻PCC6803<220>
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tac ggc ggc ggt gct gtg caa att tta ggg ccg gct acg aaa aaa caa192Tyr Gly Gly Gly Ala Val Gln Ile Leu Gly Pro Ala Thr Lys Lys Gln50 55 60gaa aat cag gaa gac caa ctt gtt tgg cgg aca ttt ccc tcg gta aaa240Glu Asn Gln Glu Asp Gln Leu Val Trp Arg Thr Phe Pro Ser Val Lys65 70 75 80aaa ttt tgg gcc agt cct cgc cag ttt gcc cta ggg cat tgg gga aaa288Lys Phe Trp Ala Ser Pro Arg Gln Phe Ala Leu Gly His Trp Gly Lys85 90 95tgt agg gat aac agg cag gcg aaa ccc cta ctc tcc gaa gaa ttt ttt336Cys Arg Asp Asn Arg Gln Ala Lys Pro Leu Leu Ser Glu Glu Phe Phe100 105 110gcc acg gtc aag gaa ggt tat caa atc cat caa aat cag cac caa gga384Ala Thr Val Lys Glu Gly Tyr Gln Ile His Gln Asn Gln His Gln Gly115 120 125caa atc att cat ggc gat cgc cat tgt cgt tgg cag ttc acc gta gaa432Gln Ile Ile His Gly Asp Arg His Cys Arg Trp Gln Phe Thr Val Glu130 135 140ccg gaa gta act tgg ggg agt cct aac cga ttt cct cgg gct aca gcg480Pro Glu Val Thr Trp Gly Ser Pro Asn Arg Phe Pro Arg Ala Thr Ala145 150 155 160ggt tgg ctt tcc ttt tta ccc ttg ttt gat ccc ggt tgg caa att ctt528Gly Trp Leu Ser Phe Leu Pro Leu Phe Asp Pro Gly Trp Gln Ile Leu165 170 175tta gcc caa ggt aga gcg cac ggc tgg ctg aaa tgg cag agg gaa cag576Leu Ala Gln Gly Arg Ala His Gly Trp Leu Lys Trp Gln Arg Glu Gln180 185 190tat gaa ttt gac cac gcc cta gtt tat gcc gaa aaa aat tgg ggt cac624Tyr Glu Phe Asp His Ala Leu Val Tyr Ala Glu Lys Asn Trp Gly His195 200 205tcc ttt ccc tcc cgc tgg ttt tgg ctc caa gca aat tat ttt cct gac672Ser Phe Pro Ser Arg Trp Phe Trp Leu Gln Ala Asn Tyr Phe Pro Asp210 215 220cat cca gga ctg agc gtc act gcc gct ggc ggg gaa cgg att gtt ctt720
His Pro Gly Leu Ser Val Thr Ala Ala Gly Gly Glu Arg Ile Val Leu225 230 235 240ggt cgc ccc gaa gag gta gct tta att ggc tta cat cac caa ggt aat768Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Leu Ile Gly Leu His His Gln Gly Asn245 250 255ttt tac gaa ttt ggc ccg ggc cat ggc aca gtc act tgg caa gta gct816Phe Tyr Glu Phe Gly Pro Gly His Gly Thr Val Thr Trp Gln Val Ala260 265 270ccc tgg ggc cgt tgg caa tta aaa gcc agc aat gat agg tat tgg gtc864Pro Trp Gly Arg Trp Gln Leu Lys Ala Ser Asn Asp Arg Tyr Trp Val275 280 285aag ttg tcc gga aaa aca gat aaa aaa ggc agt tta gtc cac act ccc912Lys Leu Ser Gly Lys Thr Asp Lys Lys Gly Ser Leu Val His Thr Pro290 295 300acc gcc cag ggc tta caa ctc aac tgc cga gat acc act agg ggc tat960Thr Ala Gln Gly Leu Gln Leu Asn Cys Arg Asp Thr Thr Arg Gly Tyr305 310 315 320ttg tat ttg caa ttg gga tct gtg ggt cac ggc ctg ata gtg caa ggg1008Leu Tyr Leu Gln Leu Gly Ser Val Gly His Gly Leu Ile Val Gln Gly325 330 335gaa acg gac acc gcg ggg cta gaa gtt gga ggt gat tgg ggt tta aca1056Glu Thr Asp Thr Ala Gly Leu Glu Val Gly Gly Asp Trp Gly Leu Thr340 345 350gag gaa aat ttg agc aaa aaa aca gtg cca ttc tga gggaataa 1100Glu Glu Asn Leu Ser Lys Lys Thr Val Pro Phe355 360<210>22<211>363<212>PRT<213>集胞藻PCC6803<400>22Met Lys Phe Pro Pro His Ser Gly Tyr His Trp Gln Gly Gln Ser Pro1 5 10 15
Phe Phe Glu Gly Trp Tyr Val Arg Leu Leu Leu Pro Gln Ser Gly Glu20 25 30Ser Phe Ala Phe Met Tyr Ser Ile Glu Asn Pro Ala Ser Asp His His35 40 45Tyr Gly Gly Gly Ala Val Gln Ile Leu Gly Pro Ala Thr Lys Lys Gln50 55 60Glu Asn Gln Glu Asp Gln Leu Val Trp Arg Thr Phe Pro Ser Val Lys65 70 75 80Lys Phe Trp Ala Ser Pro Arg Gln Phe Ala Leu Gly His Trp Gly Lys85 90 95Cys Arg Asp Asn Arg Gln Ala Lys Pro Leu Leu Ser Glu Glu Phe Phe100 105 110Ala Thr Val Lys Glu Gly Tyr Gln Ile His Gln Asn Gln His Gln Gly115 120 125Gln Ile Ile His Gly Asp Arg His Cys Arg Trp Gln Phe Thr Val Glu130 135 140Pro Glu Val Thr Trp Gly Ser Pro Asn Arg Phe Pro Arg Ala Thr Ala145 150 155 160Gly Trp Leu Ser Phe Leu Pro Leu Phe Asp Pro Gly Trp Gln Ile Leu165 170 175Leu Ala Gln Gly Arg Ala His Gly Trp Leu Lys Trp Gln Arg Glu Gln180 185 190Tyr Glu Phe Asp His Ala Leu Val Tyr Ala Glu Lys Asn Trp Gly His195 200 205Ser Phe Pro Ser Arg Trp Phe Trp Leu Gln Ala Asn Tyr Phe Pro Asp210 215 220His Pro Gly Leu Ser Val Thr Ala Ala Gly Gly Glu Arg Ile Val Leu225 230 235 240Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Leu Ile Gly Leu His His Gln Gly Asn245 250 255
Phe Tyr Glu Phe Gly Pro Gly His Gly Thr Val Thr Trp Gln Val Ala260 265 270Pro Trp Gly Arg Trp Gln Leu Lys Ala Ser Asn Asp Arg Tyr Trp Val275 280 285Lys Leu Ser Gly Lys Thr Asp Lys Lys Gly Ser Leu Val His Thr Pro290 295 300Thr Ala Gln Gly Leu Gln Leu Asn Cys Arg Asp Thr Thr Arg Gly Tyr305 310 315 320Leu Tyr Leu Gln Leu Gly Ser Val Gly His Gly Leu Ile Val Gln Gly325 330 335Glu Thr Asp Thr Ala Gly Leu Glu Val Gly Gly Asp Trp Gly Leu Thr340 345 350Glu Glu Asn Leu Ser Lys Lys Thr Val Pro Phe355 360<210>23<211>1047<212>DNA<213>拟南芥<220>
<221>CDS<222>(1)..(1047)<400>23atg aaa gca act cta gca gca ccc tct tct ctc aca agc ctc cct tat48Met Lys Ala Thr Leu Ala Ala Pro Ser Ser Leu Thr Set Leu Pro Tyr1 5 10 15cga acc aac tct tct ttc ggc tca aag tca tcg ctt ctc ttt cgg tct96Arg Thr Asn Ser Ser Phe Gly Ser Lys Ser Ser Leu Leu Phe Arg Ser20 25 30cca tcc tcc tcc tcc tca gtc tct atg acg aca acg cgt gga aac gtg144Pro Ser Ser Ser Ser Ser Val Ser Met Thr Thr Thr Arg Gly Asn Val35 40 45gct gtg gcg gct gct gct aca tcc act gag gcg cta aga aaa gga ata192
Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Ser Thr Glu Ala Leu Arg Lys Gly Ile50 55 60gcg gag ttc tac aat gaa act tcg ggt ttg tgg gaa gag att tgg gga240Ala Glu Phe Tyr Asn Glu Thr Ser Gly Leu Trp Glu Glu Ile Trp Gly65 70 75 80gat cat atg cat cat ggc ttt tgt gac cct gat tct tct gtt caa ctt288Asp His Met His His Gly Phe Cys Asp Pro Asp Ser Ser Val Gln Leu85 90 95tct gat tct ggt cac aag gaa gct cag atc cgt atg att gaa gag tct336Ser Asp Ser Gly His Lys Glu Ala Gln Ile Arg Met Ile Glu Glu Ser100 105 110ctc cgt ttt gcc ggt gtt act gat gaa gag gag gag aaa aag ata aag384Leu Arg Phe Ala Gly Val Thr Asp Glu Glu Glu Glu Lys Lys Ile Lys115 120 125aaa gta gtg gat gtt ggg tgt ggg att gga gga agc tca aga tat ctt432Lys Val Val Asp Val Gly Cys Gly Ile Gly Gly Ser Ser Arg Tyr Leu130 135 140gcc tct aaa ttt gga gct gaa tgc att ggc att act ctc agc cct gtt480Ala Ser Lys Phe Gly Ala Glu Cys Ile Gly Ile Thr Leu Ser Pro Val145 150 155 160cag gcc aag aga gcc aat gat ctc gcg gct gct caa tca ctc gct cat528Gln Ala Lys Arg Ala Asn Asp Leu Ala Ala Ala Gln Ser Leu Ala His165 170 175aag gct tcc ttc caa gtt gcg gat gcg ttg gat cag cca ttc gaa gat576Lys Ala Ser Phe Gln Val Ala Asp Ala Leu Asp Gln Pro Phe Glu Asp180 185 190gga aaa ttc gat ata gtg tgg tcg atg gag agt ggt gag cat atg cct624Gly Lys Phe Asp Ile Val Trp Ser Met Glu Ser Gly Glu His Met Pro195 200 205gac aag gcc aag ttt gta aaa gag ttg gta cgt gtg gcg gct cca gga672Asp Lys Ala Lys Phe Val Lys Glu Leu Val Arg Val Ala Ala Pro Gly210 215 220ggt agg ata ata ata gtg aca tgg tgc cat aga aat cta tct gcg ggg720Gly Arg Ile Ile Ile Val Thr Trp Cys His Arg Asn Leu Ser Ala Gly
225 230 235 240gag gaa gct ttg cag ccg tgg gag caa aac atc ttg gac aaa atc cgt768Glu Glu Ala Leu Gln Pro Trp Glu Gln Asn Ile Leu Asp Lys Ile Arg245 250 255aag acg ttc tat ctc ccg gct tgg tgc tcc acc gat gat tat gtc aac816Lys Thr Phe Tyr Leu Pro Ala Trp Cys Ser Thr Asp Asp Tyr Val Asn260 265 270ttg ctt caa tcc cat tct ctc cag gat att aag tgt gcg gat tgg tca864Leu Leu Gln Ser His Ser Leu Gln Asp Ile Lys Cys Ala Asp Trp Ser275 280 285gag aac gta gct cct ttc tgg cct gcg gtt ata cgg act gca tta aca912Glu Asn Val Ala Pro Phe Trp Pro Ala Val Ile Arg Thr Ala Leu Thr290 295 300tgg aag ggc ctt gtg tct ctg ctt cgt agt ggt atg aaa agt att aaa960Trp Lys Gly Leu Val Ser Leu Leu Arg Ser Gly Met Lys Ser Ile Lys305 310 315 320gga gca ttg aca atg cca ttg atg att gaa ggt tac aag aaa ggt gtc1008Gly Ala Leu Thr Met Pro Leu Met Ile Glu Gly Tyr Lys Lys Gly Val325 330 335att aag ttt ggt atc atc act tgc cag aag cca ctc taa1047Ile Lys Phe Gly Ile Ile Thr Cys Gln Lys Pro Leu340 345<210>24<211>348<212>PRT<213>拟南芥<400>24Met Lys Ala Thr Leu Ala Ala Pro Ser Ser Leu Thr Ser Leu Pro Tyr1 5 10 15Arg Thr Asn Ser Ser Phe Gly Ser Lys Ser Ser Leu Leu Phe Arg Ser20 25 30Pro Ser Ser Ser Ser Ser Val Ser Met Thr Thr Thr Arg Gly Asn Val35 40 45
Ala Val Ala Ala Ala Ala Thr Ser Thr Glu Ala Leu Arg Lys Gly Ile50 55 60Ala Glu Phe Tyr Asn Glu Thr Ser Gly Leu Trp Glu Glu Ile Trp Gly65 70 75 80Asp His Met His His Gly Phe Cys Asp Pro Asp Ser Ser Val Gln Leu85 90 95Ser Asp Ser Gly His Lys Glu Ala Gln Ile Arg Met Ile Glu Glu Ser100 105 110Leu Arg Phe Ala Gly Val Thr Asp Glu Glu Glu Glu Lys Lys Ile Lys115 120 125Lys Val Val Asp Val Gly Cys Gly Ile Gly Gly Ser Ser Arg Tyr Leu130 135 140Ala Ser Lys Phe Gly Ala Glu Cys Ile Gly Ile Thr Leu Ser Pro Val145 150 155 160Gln Ala Lys Arg Ala Asn Asp Leu Ala Ala Ala Gln Ser Leu Ala His165 170 175Lys Ala Ser Phe Gln Val Ala Asp Ala Leu Asp Gln Pro Phe Glu Asp180 185 190Gly Lys Phe Asp Ile Val Trp Ser Met Glu Ser Gly Glu His Met Pro195 200 205Asp Lys Ala Lys Phe Val Lys Glu Leu Val Arg Val Ala Ala Pro Gly210 215 220Gly Arg Ile Ile Ile Val Thr Trp Cys His Arg Asn Leu Ser Ala Gly225 230 235 240Glu Glu Ala Leu Gln Pro Trp Glu Gln Asn Ile Leu Asp Lys Ile Arg245 250 255Lys Thr Phe Tyr Leu Pro Ala Trp Cys Ser Thr Asp Asp Tyr Val Asn260 265 270Leu Leu Gln Ser His Ser Leu Gln Asp Ile Lys Cys Ala Asp Trp Ser275 280 285
Glu Asn Val Ala Pro Phe Trp Pro Ala Val Ile Arg Thr Ala Leu Thr290 295 300Trp Lys Gly Leu Val Ser Leu Leu Arg Ser Gly Met Lys Ser Ile Lys305 310 315 320Gly Ala Leu Thr Met Pro Leu Met Ile Glu Gly Tyr Lys Lys Gly Val325 330 335Ile Lys Phe Gly Ile Ile Thr Cys Gln Lys Pro Leu340 345<210>25<211>580<212>DNA<213>欧洲油菜(Brassica napus)<220>
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<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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gtcgacatgg caacccttaa gtgc 24<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述引物<220>
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<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<220>
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<223>人工序列的描述引物<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(25)<400>58gcccgggcct agaatccaac ttctg2权利要求
1.通过培养与野生型比较具有增加的酪氨酸转氨酶活性的生物体生产维生素E的方法。
2.如权利要求1所述的方法，其中，为了增加酪氨酸转氨酶活性，与野生型比较，增加编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因表达。
3.如权利要求2所述的方法，其中，为了增加基因表达，向生物体中引入编码酪氨酸转氨酶的核酸。
4.如权利要求3所述的方法，其中引入编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO.2或包含通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，该蛋白质在氨基酸水平上与SEQ ID NO.2序列有至少20％同一性，并且有酪氨酸转氨酶的酶学特征。
5.如权利要求4所述的方法，其中引入包含序列SEQ ID NO.1的核酸。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其中生物体还含有至少一种与野生型比较增加的活性，所述活性选自羟苯基丙酮酸双加氧酶活性、尿黑酸叶绿基转移酶活性、牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶活性、2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性、生育酚环化酶活性和γ-生育酚甲基转移酶活性。
7.如权利要求6所述的方法，其中，通过与野生型比较增加至少一种核酸的基因表达以实现所述额外至少一种活性的增加，其中所述核酸选自编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸、编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸、编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的核酸、编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸、编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中，为增加所述至少一种核酸的基因表达，向生物体中引入至少一种选自如下的核酸编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸、编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸、编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的核酸、编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸、编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其中与野生型比较，所述生物体还具有至少一种降低的活性，所述活性选自尿黑酸双加氧酶活性、马来酰乙酰乙酸异构酶活性和富马酰乙酰乙酸水解酶活性。
10.如权利要求9所述的方法，其中，通过与野生型比较降低至少一种核酸的基因表达以实现所述额外的至少一种活性的降低，所述核酸选自编码尿黑酸双加氧酶的核酸、编码马来酰乙酰乙酸异构酶的核酸和编码富马酰乙酰乙酸水解酶的核酸。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述生物体具有降低的尿黑酸双加氧酶活性。
12.如权利要求11所述的方法，其中向生物体中引入RNA，所述RNA具有双螺旋结构区域并且在该区域中具有与编码尿黑酸双加氧酶的同源核酸的一部分相同的核酸序列。
13.如权利要求1至12任一项所述的方法，其中利用植物作为生物体。
14.如权利要求1至13任一项所述的方法，其中在培养生物体后，收获生物体，并随后从生物体分离维生素E化合物。
15.含有编码酪氨酸转氨酶的核酸的核酸构建体，其中，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号。
16.如权利要求15所述的核酸构建体，其中调节信号包括一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的启动子。
17.如权利要求15或16所述的核酸构建体，其中所用的编码酪氨酸转氨酶的核酸是编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ IDNO.2或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，该衍生序列在氨基酸水平上与SEQ ID NO.2序列有至少20％同一性，并且其有酪氨酸转氨酶的酶学特征。
18.如权利要求15至17任一项所述的核酸构建体，其中利用保证在植物中实现转录和翻译的调节信号。
19.如权利要求18所述的核酸构建体，其还包含编码质体转运肽的核酸。
20.如权利要求15至19任一项所述的核酸构建体，其还包含一个、两个或三个选自以下的核酸编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸、编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸、编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的核酸、编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸、编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸，该核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号。
21.如权利要求15至20任一项所述的核酸构建体，其还包含可操作地连接的RNA，所述RNA具有双螺旋结构区域并且在该区域中具有与编码尿黑酸双加氧酶的核酸的一部分相同的核酸序列。
22.核酸构建体的组合，其中该组合包含权利要求15至21任一项所述的核酸构建体和a)至少一个选自A到F的另外核酸构建体A包含编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号，B包含编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号，C包含编码牻牛儿牻牛儿-焦磷酸氧化还原酶的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号，D包含编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号，E包含编码生育酚环化酶的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号，F包含编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸的核酸构建体，所述核酸可操作地连接一个或多个保证在生物体中实现转录和翻译的调节信号，或b)至少一个包含选自核酸构建体A到F的两个、三个或四个核酸构建体的另外核酸构建体。
23.如权利要求22所述的核酸构建体的组合，其中调节信号包括保证在生物体中实现转录和翻译的一个或多个启动子和一个或多个终止子。
24.如权利要求23所述的核酸构建体的组合，其中利用保证在植物中实现转录和翻译的调节信号。
25.遗传修饰生物体，其中与野生型比较，所述遗传修饰增加了酪氨酸转氨酶活性。
26.如权利要求25所述的遗传修饰生物体，其中通过与野生型比较增加编码酪氨酸转氨酶的核酸的基因表达引起酪氨酸转氨酶活性的增加。
27.如权利要求26所述的遗传修饰生物体，其中向生物体中引入编码酪氨酸转氨酶的核酸以增加所述基因表达。
28.如权利要求27所述的遗传修饰生物体，其中引入编码如下蛋白质的核酸，所述蛋白质包含氨基酸序列SEQ ID NO.2或通过氨基酸置换、插入或缺失来源于该序列的衍生序列，所述核酸在氨基酸水平上与序列SEQ ID NO.2有至少20％同一性并且具有酪氨酸转氨酶的酶学特征。
29.如权利要求28所述的遗传修饰生物体，其包含至少一个编码酪氨酸转氨酶的外源核酸或至少两个编码酪氨酸转氨酶的内源核酸。
30.如权利要求25至29任一项所述的遗传修饰生物体，其中所述遗传修饰还使至少一种活性相对于野生型出现增加，所述活性选自羟苯基丙酮酸双加氧酶活性、尿黑酸叶绿基转移酶活性、牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶活性、2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶活性、生育酚环化酶活性和γ-生育酚甲基转移酶活性。
31.如权利要求30所述的遗传修饰生物体，其中通过与野生型比较使至少一种核酸的基因表达增加而引起所述至少一种活性的增加，所述核酸选自编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的核酸、编码尿黑酸叶绿基转移酶的核酸、编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的核酸、编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的核酸、编码生育酚环化酶的核酸和编码γ-生育酚甲基转移酶的核酸。
32.如权利要求31所述的遗传修饰生物体，其中生物体包含至少一个编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的外源核酸或两个或更多个编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的内源核酸和/或至少一个编码尿黑酸叶绿基转移酶的外源核酸或两个或更多个编码尿黑酸叶绿基转移酶的内源核酸和/或至少一个编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的外源核酸或两个或更多个编码牻牛儿牻牛儿焦磷酸氧化还原酶的内源核酸和/或至少一个编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的外源核酸或两个或更多个编码2-甲基-6-叶绿基氢醌甲基转移酶的内源核酸和/或至少一个编码生育酚环化酶的外源核酸或两个或更多个编码生育酚环化酶的内源核酸和/或至少一个编码γ-生育酚甲基转移酶的外源核酸或两个或更多个编码γ-生育酚甲基转移酶的内源核酸。
33.如权利要求25至32任一项所述的遗传修饰生物体，其中与野生型比较，所述遗传修饰还降低了至少一种选自尿黑酸双加氧酶活性、马来酰乙酰乙酸异构酶活性和富马酰乙酰乙酸水解酶活性的活性。
34.如权利要求33所述的遗传修饰生物体，其中通过与野生型比较降低至少一种核酸的基因表达引起所述至少一种活性的降低，所述核酸选自编码尿黑酸双加氧酶的核酸、编码马来酰乙酰乙酸异构酶的核酸和编码富马酰乙酰乙酸水解酶的核酸。
35.如权利要求25至34任一项所述的遗传修饰生物体，其中与野生型比较，所述遗传修饰生物体有增加的维生素E含量。
36.如权利要求25至35任一项所述的遗传修饰生物体，其中所用生物体是植物。
37.如权利要求25至36任一项所述的遗传修饰生物体在维生素E的生产中的用途。
38.如权利要求25至36任一项所述的遗传修饰生物体的用途，所述遗传修饰生物体用作饲料和食品或用于加工食品的生产、用于含有维生素E的生物提取物的生产或用于饲料和食品添加剂的生产。
39.如权利要求25至36任一项所述的遗传修饰生物体的制备方法，其中向起始生物体的基因组中引入权利要求1至12任一项所述的核酸或权利要求15至21任一项所述的核酸构建体或权利要求22至24任一项所述的核酸构建体的组合。
40.如权利要求1至12任一项所述的核酸或权利要求15至21任一项所述的核酸构建体或权利要求22至24任一项所述的核酸构建体的组合在增加生物体的维生素E含量中的用途，其中所述生物体的野生型具有产生维生素E的能力。
全文摘要
本发明涉及通过培养比野生型有增加的酪氨酸转氨酶活性的生物体，特别是植物生产维生素E的方法，也涉及此遗传修饰生物体，特别是植物本身。
文档编号C12N1/21GK1537168SQ02808070
公开日2004年10月13日 申请日期2002年3月7日 优先权日2001年3月9日
发明者R·巴杜尔, M·盖格尔, R·莱姆克, K－D·扎尔歇特, S·特洛普夫, R 巴杜尔, 房, 穸 , 迤辗 申请人:太阳基因两合公司